CKAP4結合シリコン量子ドットミセル：肺がん向け新規標的イメージング剤

概要

現在、様々な蛍光ナノ材料が手術ナビゲーション用光学造影剤として設計・合成されています。しかし、シリコン量子ドット（Si QD）を用いた肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤の調製に関する報告はありません。本研究では、Piらが報告した水分散性Si QDミセルを改良・修飾し、Si QDミセル-CKAP4を調製しました。データによると、Si QDミセル-CKAP4は平均水動力学直径約78.8 nmの球状粒子でした。Si QDミセル-CKAP4のUV-可視吸収は200〜500 nmの範囲でした。励起波長330 nmで、蛍光発光スペクトルに640 nmで強い蛍光が観察されました。レーザー共焦点顕微鏡と蛍光顕微鏡アッセイにより、Si QDミセル-CKAP4が肺がん細胞と肺がん組織に対してin vitroで良好な標的能を示すことが確認されました。In vivo蛍光イメージングアッセイでは、Si QDミセル-CKAP4が肝臓で代謝され、腎臓で排泄されることが示されました。さらに、Si QDミセル-CKAP4は健康な肺組織と比較してin vivoで肺がん組織を特異的に標的としました。細胞毒性とヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色アッセイにより、Si QDミセル-CKAP4がin vitroおよびin vivoで高い生体安全性を示すことが確認されました。Si QDミセル-CKAP4は肺がん特異的標的イメージング剤であり、将来的に肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤になることが期待されます。

はじめに

がんは世界中で人類の健康を脅かす主要な疾患の一つです[1]。その中でも、肺がんの発症率と死亡率は全悪性腫瘍中最高位であり、毎年増加傾向にあります[2]。外科的切除は固形腫瘍の主要治療法です。しかし、悪性組織と健常組織の識別方法は、主に触覚と視覚的手がかり、および執刀医の経験に限られています[3]。

近年、蛍光ガイド手術が、腫瘍切除のためのリアルタイム術中ガイダンスの研究分野で普及しています[4]。蛍光造影剤と蛍光イメージングシステムの助けにより、執刀医はリアルタイム画像ガイダンスを用いて原発腫瘍を切除し、手術腔内の残留腫瘍を特定できます。従来の生体医用イメージング手法と比較して、蛍光イメージングシステムは、電離放射線がない、高空間分解能などの利点を提供します[3, 5, 6]。

現在、研究者たちは生物イメージング用の様々な蛍光ナノ材料を報告しています[7, 8]。その中でも、シリコン量子ドット（Si QD）は生物イメージング分野で人気を集めています[9-11]。しかし、Si QDを用いた肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤の調製に関する報告はありません。

2014年、Piらは新規水分散性Si QDミセルの合成法を報告しました[12]。研究データは、Si QDミセルが制御可能なサイズ、高い蛍光量子効率、優れた光安定性などの利点を持つことを示しました[12]。本研究は、Piらが報告した水溶性Si QDミセルを改良・修飾し、将来的に肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤として使用が期待される新規蛍光造影剤を調製することを目的としています。

2018年、柳田らは、CKAP4が肺がん患者の血清とがん組織で高発現しており、肺がん早期診断の新規バイオマーカーとして使用可能であることを報告しました[13]。したがって、CKAP4抗体結合Si QDミセルは新規蛍光造影剤となり得、肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤として使用される可能性があります。

本研究では、DSPE-PEG-COOHを用いて表面にカルボキシル基を持つSi QDミセルを調製しました。次に、EDCを用いてCKAP4抗体をSi QDミセルと結合させました。結果、Si QDミセル-CKAP4は水溶液中で良好に分散しました。365 nm紫外線照射下でSi QDミセル-CKAP4は強い赤色蛍光を示しました。抗体結合により、Si QDミセル-CKAP4はin vitroおよびin vivoで肺がん細胞と組織に対する良好な標的能を示しました。さらに、Si QDミセル-CKAP4はin vitroおよびin vivoで高い生体安全性を示しました。本研究では、肺がん手術ナビゲーション用の潜在的蛍光造影剤を調製しました。

方法

試薬

牛血清アルブミン（BSA）はSigma製（アッセイ≥98%、ミズーリ州、米国）；テトラヒドロフラン（THF）はAdamas-beta製（純度99.9%、バーゼル、スイス）；DSPE-PEG-COOHはAladdin製（上海、中国）；CKAP4抗体はAbcam製（0.55 mg/mL、ケンブリッジ、英国）；デュルベッコ改変イーグル培地（DMEM）とリン酸緩衝生理食塩水（PBS）はHyclone製（ユタ州、米国）；胎児牛血清（FBS）とトリプシンはGibco製（ニューヨーク州、米国）；パラホルムアルデヒド（4%）、トリトンX-100含有免疫染色透過化バッファー、免疫染色用ブロッキングバッファーはBeyotime製（上海、中国）；グリセリンはSolarbio製（純度≥99%、北京、中国）；トリプシンはKingmorn製（0.25%、上海、中国）。

機器

透過型電子顕微鏡（TEM）像はJEM-2100F電子顕微鏡（JEOL、東京、日本）で撮影。水動力学直径はJEM Zetasizer Nano-ZS90（Malvern Instruments、Malvern、英国）で測定。UV-Vis吸収スペクトルはCary 50分光光度計（Varian、パロアルト、カリフォルニア州、米国）で取得。蛍光発光スペクトルはF-182 4500分光光度計（日立製作所、東京、日本）で取得。X線光電子分光法（XPS）はRBDアップグレードPHI-5000C ESCAシステム（Perkin Elmer、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）で実施。光ルミネセンス（PL）量子収率（QY）は蛍光分光計（FLS1000、Edinburgh Instruments、リビングストン、英国）で推定。フーリエ変換赤外分光法（FTIR）はThermo IS50（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国）で実施。X線回折（XRD）はSmartLab（リガク、東京、日本）で測定。

細胞

A549と293T細胞株は上海細胞生物学研究所（上海、中国）から購入。

Si QDミセルの調製

まず、水素化シリル化反応によりドデシル-Si QDを調製し、先行報告法[12]に従ってTHFに溶解し、ドデシル-Si QD溶液（15 mg/mL）を調製しました。次に、20 mg DSPE-PEG-COOHを10 mL脱イオン水に溶解・混合し、DSPE-PEG-COOH溶液（2 mg/mL、10 mL）を調製しました。その後、ドデシル-Si QD溶液（15 mg/mL、66 µL）を10 mL DSPE-PEG-COOH溶液に滴下添加しました。3分間超音波攪拌後、透明な溶液が得られました。その後、フード内で暗所にて12時間攪拌しました。続いて、24時間透析し、その後3日間凍結乾燥してSi QDミセルを得ました。

Si QDミセル-CKAP4の調製

本研究では、EDCによりカルボキシル基を活性化してCKAP4抗体をSi QDミセルと結合させました[14]。方法は以下の通りです：4 mgのSi QDミセルを900 µL PBSに分散させ、Si QDミセル溶液を調製。EDC（10 mg）を100 µL PBSに加えてEDC溶液を調製。次に、100 µL EDC溶液を900 µL Si QDミセルに徐々に加え、5分間超音波攪拌。さらに、20 µL CKAP4抗体を徐々に加え、室温暗所で2時間攪拌。生成物を4000 rpmで15分間超濾過。PBSで3回洗浄後、生成物をSi QDミセル-CKAP4としました。

細胞毒性試験

本研究では、トリパンブルーを用いてナノ材料の生体安全性を試験しました[15]。A549と293T細胞を24ウェルプレート（1 × 10⁶ cells/well）に播種し、37℃で12時間培養。培地を除去後、Si QDミセルまたはSi QDミセル-CKAP4の一連の濃度（Si濃度：0〜152 µg/mL）を24ウェルプレートに添加し、37℃で2時間インキュベート。培地を除去し、細胞を回収してPBSで2回洗浄。トリパンブルーを細胞懸濁液と1:1の比率で混合。Countstarを用いて生細胞数と死細胞数を検出・記録。細胞生存率（%）= 生細胞数 / (生細胞数 + 死細胞数) × 100。3回の生物学的反復を実施。Prismソフトウェア（バージョン7.01；GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で統計解析。データはDunnett事後検定付き二元配置分散分析で解析。統計的有意水準はP < 0.05。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。

ナノ材料の肺がん細胞への標的能（in vitro）

Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4の肺がん細胞への標的能をin vitroで検出しました：まず、A549細胞をレーザー共焦点ディッシュ（3 × 10⁵ cells/dish）に播種し、37℃で12時間培養。培地を除去し、PBSで3回洗浄。その後、1 mLパラホルムアルデヒド（4%）を添加し、25℃で10分間固定。パラホルムアルデヒドを除去し、PBSで3回洗浄。次に、1 mLトリトンX-100含有免疫染色透過化バッファーを添加し、25℃で10分間処理。除去後、PBSで3回洗浄。その後、1 mL免疫染色用ブロッキングバッファーを添加し、25℃で10分間処理。除去後、PBSで3回洗浄。次に、200 µL Si QDミセルまたはSi QDミセル-CKAP4（Si濃度150 µg/mL）を添加し、37℃で2時間インキュベート。ナノ材料を除去し、PBSで3回洗浄。レーザー共焦点顕微鏡（Leica、ヴェツラー、ドイツ）で撮影。励起光を405 nm、発光波長を630 nmに設定。

Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4の正常細胞への標的能をin vitroで検出しました：まず、293T細胞を1.5 mL Eppendorfチューブに1 × 10⁶ cells/tubeの密度で回収。1000 rpmで5分間遠心分離し、上清を除去。次に、1 mLパラホルムアルデヒド（4%）を添加し、室温で10分間固定。1000 rpmで5分間遠心分離し、上清を除去。PBSで3回洗浄。その後、1 mLトリトンX-100含有免疫染色透過化バッファーを添加し、25℃で10分間処理。1000 rpmで5分間遠心分離。上清を除去し、PBSで3回洗浄。次に、1 mL免疫染色用ブロッキングバッファーを添加し、25℃で10分間処理。1000 rpmで5分間遠心分離。上清を除去し、PBSで3回洗浄。その後、200 µL Si QDミセルまたはSi QDミセル-CKAP4（Si濃度150 µg/mL）を添加し、37℃で2時間インキュベート。1000 rpmで5分間遠心分離し、上清を除去、沈殿をPBSで3回洗浄。細胞を回収し、顕微鏡スライドを作製。レーザー共焦点顕微鏡で観察。励起光405 nm、発光波長630 nmに設定。

3回の独立実験を実施。ImageJソフトウェア（ベセスダ、メリーランド州、米国）で平均蛍光強度の定量解析。Prismソフトウェア（バージョン7.01）で統計解析。データはDunnett事後検定付き一元配置分散分析で解析。統計的有意水準はP < 0.05。***P < 0.001。

腫瘍保持マウスモデル

雄性ヌードマウス（5〜6週齢）10匹をShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.（上海、中国）から購入。全マウスを同志社大学実験動物センター（上海、中国）でSPF条件下で飼育。腫瘍保持マウスモデル確立のため、マウスに皮下へ1 × 10⁶ A549細胞を注入。腫瘍直径が6 mmに達したマウスを実験に使用。全マウス実験は機関ガイドラインに従い、同志社大学動物実験委員会の承認を得て実施。

Si QDミセル-CKAP4の肺がん組織への標的能（in vitro）

腫瘍保持マウスを麻酔下で安楽死させ、腫瘍と正常肺組織を採取しパラフィン切片を作製。脱水、抗原賦活、血清ブロッキング後、Si QDミセルまたはSi QDミセル-CKAP4（Si濃度150 µg/mL）を組織に添加し、37℃で2時間インキュベート。ナノ材料を除去し、PBSで3回洗浄。組織を4′, 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で10分間染色。PBSで3回洗浄後、抗褪色媒質を添加し、25℃で5分間インキュベート。抗褪色媒質を除去し、PBSで3回洗浄。蛍光顕微鏡（Nikon、東京、日本）で励起波長405 nm、発光波長630 nmで撮影。3回の独立実験を実施。ImageJソフトウェアで平均赤色蛍光強度の定量解析。Prismソフトウェア（バージョン7.01）で統計解析。データはDunnett事後検定付き一元配置分散分析で解析。統計的有意水準はP < 0.05。***P < 0.001。

In vivo蛍光イメージング

実験では、9匹の腫瘍保持マウスを3群に分けました（Si QDミセル-CKAP4注入群、Si QDミセル注入群、生理食塩水注入群）。Si QDミセル-CKAP4注入群マウスには、200 µL Si QDミセル-CKAP4（Si：4 mg/kg）を静脈注入。Si QDミセル注入群マウスには、200 µL Si QDミセル（Si：4 mg/kg）を静脈注入。生理食塩水注入群マウスには、200 µL生理食塩水を静脈注入。異なる時間点（0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4時間）で蛍光画像を取得。Si QDミセル-CKAP4注入群マウスを4時間で麻酔・安楽死させ、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍の蛍光信号を検出。本研究では、VISQUE Invivo Smart-LF（VIEWORKS、京畿道、韓国）を用い、PEフィルターセット（λ_excitation 450〜500 nm、λ_emission 600〜650 nm）で蛍光イメージングを実施。Prismソフトウェア（バージョン7.01）で統計解析。データはDunnett事後検定付き一元配置分散分析で解析。統計的有意水準はP < 0.05。*P < 0.05；**P < 0.01。

ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色

本研究では、12匹の腫瘍保持マウスに、生理食塩水（200 µL）、Si QDミセル（Si：4 mg/kg、200 µL）、またはSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg/kg、200 µL）を尾静脈注射。24時間後、マウスを安楽死させ。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓でH&E染色を実施。光学顕微鏡で病理変化を観察[14, 16]。

結果

Si QDミセルの調製とキャラクタリゼーション

まず、先行報告（スキーム1、ステップ1）[12]に従い、水素化シリル化反応によりドデシル-Si QDを調製しました。報告データと同様に、我々のグループで合成したドデシル-Si QDはメチルベンゼンに良好に分散しました[12]。TEM観察では、ドデシル-Si QDは比較的均一なサイズの球状でした。TEM像のドデシル-Si QDサイズをImageJソフトウェアで測定。データによると、ドデシル-Si QD直径は4.1〜5.3 nmの範囲で、平均直径約4.7 nmでした（図1a）。ドデシル-Si QDの拡大像では、明確な格子縞が観察されました（図1a）。本研究では、ImageJソフトウェアで格子面間距離を測定。データによると、格子縞の平均距離は約0.35 nmで、先行報告のドデシル-Si QD（0.34 nm）とほぼ同一でした。したがって、本研究で合成したドデシル-Si QDは良好な結晶性を示しました[12]。動的光散乱（DLS）では、ドデシル-Si QDの水動力学直径は4.8〜13.5 nmの範囲で、平均6.5 nmでした（図1b）。

Si QDミセル-CKAP4調製と肺がん組織での標的生物イメージングの模式図

a ドデシル-Si QDのTEM像； b ドデシル-Si QDの水動力学直径分布； c Si QDミセルのTEM像； d Si QDミセルの水動力学直径分布； e Si QDミセル-CKAP4のTEM像； f Si QDミセル-CKAP4の水動力学直径分布； g Si QDミセルのC1s XPSスペクトル； h Si QDミセル-CKAP4のC1s XPSスペクトル

水分散性Si QDミセルを調製するため、ドデシル-Si QDをDSPE-PEG-COOHによる自己組立で修飾しました（スキーム1、ステップ2）[12]。ここでは、表面にカルボキシル基を持つSi QDミセルを調製するため、F127の代わりにDSPE-PEG-COOHを使用しました。結果、Si QDミセルは水中で良好に分散しました。TEM像では、Si QDミセルはSi QDが内包された球状粒子でした。Si QDミセル直径は22.7〜54.6 nmの範囲で、平均直径約34.3 nmでした（図1c）。DLSでは、Si QDミセルの水動力学直径は43.8〜615.9 nmの範囲で、平均58.7 nmでした（図1d）。Si QDミセルの平均ゼータ電位は約-20.7 mVでした。本研究では、Si QDミセルの組成を調べるためFTIRを実施（追加ファイル1：図S1A）。データによると、N-H、C-H、O-H、C=Oの伸縮振動吸収ピークはそれぞれ3430、2920、2850、1640 cm⁻¹；C-HとO-Hの曲げ振動吸収ピークはそれぞれ1460と1400 cm⁻¹；Si-C、C-O、P-O-Cの伸縮振動吸収ピークはそれぞれ1250、1100、951 cm⁻¹；Si-HとO=C-Nの曲げ振動吸収ピークはそれぞれ850と526 cm⁻¹でした。これらのデータは、DSPE-PEG-COOHの特性基（N-H、O-H、C=O、C-O、P-O-C、O=C-N）とドデシル-Si QDの特性基（Si-C、Si-H）がSi QDミセルのFTIRスペクトルで見つかることを示し、ドデシル-Si QDがDSPE-PEG-COOH自己組立ミセルに成功裏に内包されたことを示しています。また、Si QDミセルをXRDでキャラクタリゼーション（追加ファイル1：図S1B）。Si QDミセルの回折ピークはシャープで、Si QDミセルの結晶性が良好であることを示します。XRDパターンでは、2θ = 27.073、28.451、56.598、73.145のピークが、それぞれシリコンの(100)、(002)、(112)、(203)結晶面に対応（PDF #80-0005）、Si QDがSi QDミセルに成功裏に内包されたことを示します。2θ = 31.692、45.431、66.200、75.260、83.955のピークは、NaClの(200)、(220)、(400)、(420)、(422)結晶面に対応（PDF #77-2064）。Si QDミセルにNaClが存在する合理的説明は：Si QDミセル調製後、PBSに溶解させたためNaClが混入した可能性があります。

UV-可視吸収スペクトルでは、Si QDミセルの吸収は200〜500 nmの範囲でした（図2a）。励起波長330 nmで、Si QDミセルの蛍光発光スペクトルに650 nmで強い蛍光が観察されました（図2b）。Si QDミセル水溶液（Si濃度：80 µg/mL）は自然光下では透明でクリアでしたが、365 nm UV光下で強い赤色蛍光を発しました（図2c）。本研究では、絶対PL QYを蛍光分光計（FLS1000）で測定。励起波長365 nm。データによると、Si QDミセルの絶対PL QYは約14.49%でした。

a Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4のUV-可視吸収スペクトル； b Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4の蛍光発光スペクトル； c 自然光（左）と365 nm UV光（右）下でのSi QDミセルとSi QDミセル-CKAP4の画像

Si QDミセル-CKAP4の調製とキャラクタリゼーション

EDCを用いてCKAP4抗体をSi QDミセルと結合させました（スキーム1、ステップ3）[14]。TEM像では、Si QDミセル-CKAP4はSi QDが内包された球状粒子でした。Si QDミセル-CKAP4直径は24.4〜67.7 nmの範囲で、平均直径約35.5 nmでした（図1e）。DLSでは、Si QDミセル-CKAP4の水動力学直径は58.7〜824.9 nmの範囲で、平均78.8 nmでした。これはSi QDミセルよりわずかに大きく、CKAP4抗体結合によるものと考えられます（図1f）。C1s XPSスペクトルでは、C1s領域に6種類の炭素原子が示されました：C(O)O（288.81 eV）、C=O（286.5 eV）、C-O（285.76 eV）、C-N（285.25 eV）、C-C（284.88 eV）、C-H（284.34 eV）（図1g）。しかし、Si QDミセル-CKAP4のXPSスペクトルではC(O)Oピークがほぼ消失し、カルボキシル基と第一級アミンの結合が成功したことを示し、したがってCKAP4抗体がSi QDミセルと成功裏に結合したことを確認できました（図1h）。Si QDミセル-CKAP4の平均ゼータ電位は約-10.7 mVで、Si QDミセルより高くなりました。この現象の説明は：Si QDミセル表面には多数のカルボキシル基があり、強い負電荷を示します。しかし、Si QDミセル-CKAP4ではCKAP4抗体結合により表面カルボキシル基が減少し、平均ゼータ電位が上昇しました。

UV-可視吸収スペクトルでは、Si QDミセル-CKAP4の吸収は200〜500 nmの範囲で、Si QDミセルと類似でした（図2a）。励起波長330 nmで、Si QDミセル-CKAP4の蛍光発光スペクトルに640 nmで強い蛍光が観察されました（図2b）。これらの結果は、抗体結合がSi QDミセル-CKAP4の蛍光特性に有意な影響を与えないことを示しています。Si QDミセル-CKAP4水溶液（Si濃度：80 µg/mL）は自然光下で透明クリアで、365 nm UV光下で強い赤色蛍光を発し、Si QDミセルと一致しました（図2c）。PL QY試験では、Si QDミセル-CKAP4の絶対PL QYは約16.96%でした。

Si QDミセル-CKAP4のin vitro細胞毒性試験

ヒト肺がん細胞株A549とヒト腎上皮細胞株293Tを標的細胞として、Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4の生体安全性を調査しました。本研究では、Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4の異なる濃度（Si濃度：0、2.375、4.75、9.5、19、38、76、152 µg/mL）をA549または293T細胞と37℃で2時間インキュベート。トリパンブルーで細胞生存率を検出（図3）[15]。GraphPadソフトウェアでSi QDミセルとSi QDミセル-CKAP4のID50を算出。データによると、Si QDミセルのID50はA549と293T細胞で152 µg/mL超でした。Si QDミセル-CKAP4のID50はA549細胞で25.94 µg/mL、293T細胞で72.69 µg/mLでした。これらの結果は、Si QDミセル-CKAP4の細胞毒性がSi QDミセルより有意に高く、A549細胞での細胞毒性が293T細胞より有意に高いことを示しました。この現象は補体依存性細胞毒性[17]による可能性があります。さらに、これらの結果はSi QDミセル-CKAP4が正常細胞より肺がん細胞でより高い生物学的安全性を示すことを意味し、in vivo応用の基盤を築きました。

A549 a と293T b をSi QDミセルとSi QDミセル-CKAP4の異なる濃度（Si濃度：0、2.375、4.75、9.5、19、38、76、152 µg/mL）で2時間インキュベートした細胞生存率（n=3；平均±SD；Dunnett事後検定付き二元配置分散分析； *P < 0.05； **P < 0.01； ***P < 0.001）

Si QDミセル-CKAP4の肺がん細胞への標的能（in vitro）

Si QDミセル-CKAP4の肺がん細胞への標的機能をin vitroでさらに調査するため、A549と293T細胞を標的細胞として使用。Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4をA549と293T細胞と37℃で2時間インキュベート。標的効果をレーザー共焦点顕微鏡で検出（図4）。結果、Si QDミセル-CKAP4インキュベートA549の赤色蛍光が、Si QDミセル-CKAP4と293T共インキュベート群、Si QDミセルとA549共インキュベート群、Si QDミセルと293T共インキュベート群よりも有意に高かった。これらの結果は、Si QDミセル-CKAP4がin vitroでA549細胞を特異的に標的とすることを示しました。

Si QDミセル-CKAP4のA549細胞への標的能検出。 a A549と293TをSi QDミセル-CKAP4とSi QDミセル（Si濃度150 µg/ml）で37℃、2時間インキュベート。上清除去と2回洗浄後、共焦点レーザー走査顕微鏡で撮影（バー、25 µm）。 b ImageJで平均蛍光強度の定量解析（n=3；平均±SD；Dunnett事後検定付き一元配置分散分析； ***P < 0.001）

Si QDミセル-CKAP4の肺がん組織への標的能（in vitro）

Si QDミセル-CKAP4の肺がん組織標的可能性を探るため、A549組織への標的特性をin vitroで検証する実験を設計。本研究では、A549細胞をマウスに皮下接種。腫瘍形成後、A549腫瘍組織と正常肺組織を採取し、Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4で37℃、2時間インキュベート。標的効果をレーザー共焦点顕微鏡で検出（図5）。結果、Si QDミセル-CKAP4インキュベートA549組織は励起波長405 nmで強い赤色蛍光を発しました。一方、Si QDミセルインキュベートA549組織、Si QDミセル-CKAP4インキュベート正常肺組織、Si QDミセルインキュベート正常肺組織では弱い赤色蛍光のみ観察されました。Si QDミセル-CKAP4インキュベートA549組織の赤色蛍光は、他の3群より有意に高かった。これらのデータは、Si QDミセル-CKAP4がin vitroで肺がん組織を効果的に標的とすることを示し、肺がん用潜在的蛍光造影剤になることが期待されます。

Si QDミセル-CKAP4のA549組織への標的能検出。 a A549組織と正常肺組織をSi QDミセル-CKAP4とSi QDミセル（Si濃度：150 µg/ml）で37℃、2時間培養。2回洗浄後、DAPIで核染色。共焦点レーザー走査顕微鏡で撮影（バー、200 µm）。 b ImageJで平均赤色蛍光強度の定量解析（n=3；平均±SD；Dunnett事後検定付き一元配置分散分析； ***P < 0.001）

In vivo蛍光イメージング

9匹の腫瘍保持マウスを3群に分けました（Si QDミセル-CKAP4注入群、Si QDミセル注入群、生理食塩水注入群）。Si QDミセル-CKAP4注入群マウスに200 µL Si QDミセル-CKAP4（Si：4 mg/kg）を静脈注入。Si QDミセル注入群マウスに200 µL Si QDミセル（Si：4 mg/kg）を静脈注入。生理食塩水注入群マウスに200 µL生理食塩水を静脈注入。異なる時間点（0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4時間）で蛍光画像を取得。全マウスの3群全てで、肺がん組織における有意な蛍光信号は観察されませんでした（データ未表示）。これは、Si QDミセル-CKAP4とSi QDミセルの蛍光透過が弱いためと考えられます。

Si QDミセル-CKAP4注入群マウスを4時間で麻酔・安楽死させ、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍の蛍光信号を検出。データによると、肝臓、腎臓、腫瘍組織で有意な蛍光信号が観察されました。しかし、心臓、脾臓、健康な肺組織では有意な蛍光信号はありませんでした（図6）。肝臓と腎臓での有意な蛍光信号は、Si QDミセル-CKAP4が肝臓で代謝され、腎臓で排泄されることを示しています。さらに、A549腫瘍組織の蛍光信号が健康な肺組織より有意に高かった。この現象は、Si QDミセル-CKAP4の肺がん組織への標的能に寄与します。これらの結果は、Si QDミセル-CKAP4が肺がん組織を特異的に標的とし、将来的に肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤になることが期待されることを示しています。

a Si QDミセル-CKAP4注入マウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍の明視野写真。 b 同臓器の蛍光写真。 c 心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍組織の相対蛍光強度（n=3；平均±SD；Dunnett事後検定付き一元配置分散分析； *P < 0.05； **P < 0.01）

Si QDミセル-CKAP4のin vivo生体安全性評価

最後に、Si QDミセル-CKAP4のin vivo急性毒性を調査。本研究では、腫瘍保持マウス（n=12）に、生理食塩水（200 µL）、Si QDミセル（Si：4 mg/kg、200 µL）、またはSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg/kg、200 µL）を尾静脈注射し、24時間後に安楽死させました。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓のH&E染色像を図7に示します。生理食塩水注入マウスと比較して、Si QDミセル注入マウスとSi QDミセル-CKAP4注入マウスの主要臓器に明らかな病理変化はありませんでした。以上のデータは、Si QDミセル（Si：4 mg/kg）とSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg/kg）がin vivoで有意な毒性を示さないことを示しています。

生理食塩水、Si QDミセル（Si：4 mg/kg）、Si QDミセル-CKAP4（Si：4 mg/kg）を注射した腫瘍保持マウスの24時間後の心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓のH&E染色像（倍率：200×）

考察

現在、様々な蛍光ナノ材料が手術ナビゲーション用光学造影剤として設計・合成されています[3, 4]。2020年、Onらは、蛍光色素[インドシアニングリーン（ICG）またはシアニン5.5（Cy5.5）]結合グリコールキトサンナノ粒子（CNP）を、肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤として調製しました[18]。しかし、Si QDを用いた肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤の調製報告はありません。

本研究では、肺がん組織イメージングを標的とするSi QDミセル-CKAP4を合成成功し、将来的に肺がん手術ナビゲーション用光学造影剤として使用されることが期待されます。Si QDミセル-CKAP4の利点は以下の通りです：(1) Si QDを用いた肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤を初めて合成し、肺がん手術ナビゲーションツールライブラリのツールボックスを拡張しました。(2) Piらが報告した水分散性Si QDミセルを最適化し、Si QDミセルに標的能を付与しました[12]。これにより、Si QDの生物医学分野への応用に新たな可能性を提供しました。(3) Si QDミセル-CKAP4の肺がん標的原理は、肺がん組織でのCKAP4タンパク質高発現に基づきます。CKAP4抗体結合により、Si QDミセル-CKAP4は能動的に肺がん組織を標的とできます。EPR効果で受動的に腫瘍を標的とするナノ材料と比較して、Si QDミセル-CKAP4は肺がん組織に対するより強い特異性を示しました。(4) Si QDミセル-CKAP4は特定濃度範囲で腫瘍細胞に選択的細胞毒性を示しました。したがって、合理的薬物濃度範囲でSi QDミセル-CKAP4は高い生物学的安全性を示し、潜在的臨床応用価値を示唆しました。

本研究では、PL QY試験でSi QDミセルの絶対PL QYが約14.49%、Si QDミセル-CKAP4が約16.96%でした。Piらの研究では、ドデシル-Si QDのPL QYが約26%で、PLピークが700 nm未満の赤色発光Si QDとしては非常に高い値でした[12, 19, 20]。しかし、本研究のSi QDミセルPL QYは約14.49%で、ドデシル-Si QDより低かった。これは乳化過程で導入された表面欠陥による可能性があり、Piらの研究で報告されたSi QDミセル（ドデシル修飾Si QDが乳化でF127自己組立ミセルに内包）のPL QY低下とほぼ整合します[12, 21]。本研究では、Si QDミセル-CKAP4のPL QYが約16.96%で、Si QDミセル（14.49%）よりわずかに高かった。これはSi QDミセル-CKAP4でCKAP4抗体結合がSi QDミセルの一部表面欠陥を修復し、PL QYがわずかに向上したためと考えられます。

周知の通り、Si QD生物イメージング応用には課題があります：Si自体は低細胞毒性ですが、サイズが一定程度減少するとSi粒子が細胞毒性を示す可能性があります。本研究では、細胞毒性試験でSi QDミセル-CKAP4が9.5〜19 µg/mLで肺がん細胞に選択的細胞毒性を示しました。したがって、CKAP4抗体結合の結果、Si QDミセル-CKAP4の正常細胞への細胞毒性は肺がん細胞より有意に低く、Si QDミセル-CKAP4の生物応用に強力な条件を提供します。

本研究では、ヒト肺がん細胞株A549とヒト腎上皮細胞株293Tを標的細胞として、Si QDミセルとSi QDミセル-CKAP4の標的能を調査。A549と293T細胞はそれぞれ貼着性と半貼着性でした。実験中、繰り返し遠心分離と洗浄により293T細胞数が減少しました。したがって、図4に示すように、293T細胞数はA549細胞より少なくなっています。

また、A549細胞はp53野生型肺がん細胞株に属することに注意すべきです。したがって、A549細胞のみではSi QDミセル-CKAP4の肺がんへの標的能を完全に反映できません。今後、p53陰性細胞株（H1299など）でのSi QDミセル-CKAP4の標的能とイメージング効果を試験し、臨床応用の確固たる実験的基盤を提供する予定です[22]。

結論

本研究では、Piらが報告したSi QDミセルを改良・修飾し、水分散性Si QDミセル-CKAP4を調製しました。Si QDミセル-CKAP4は平均水動力学直径約78.8 nmの球状粒子でした。Si QDミセル-CKAP4のUV-可視吸収は200〜500 nmの範囲でした。励起波長330 nmで、蛍光発光スペクトルに640 nmで強い蛍光が観察されました。Si QDミセル-CKAP4はin vitroおよびin vivoで肺がん細胞と肺がん組織に対する良好な標的能を示しました。さらに、in vivo蛍光イメージングアッセイでは、Si QDミセル-CKAP4が肝臓で代謝され、腎臓で排泄されることが示されました。細胞毒性とH&E染色アッセイにより、Si QDミセル-CKAP4がin vitroおよびin vivoで高い生体安全性を示すことが確認されました。Si QDミセル-CKAP4は肺がん特異的標的イメージング剤であり、将来的に肺がん手術ナビゲーション用蛍光造影剤になることが期待されます。