コンドロイチン硫酸-メトトレキサートナノゲルの抗腫瘍研究

背景

メトトレキサート（4-アミノ-10-メチル葉酸、MTX）は葉酸類似体であり、代謝拮抗剤ファミリーに属しています[1]。 MTXは、1950年代から腫瘍治療に使用された最初の薬剤であり[2]、酵素活性をブロックし、DNA合成を妨害することによって作用する変異原性および催奇形性の抗腫瘍薬です[3]。以前の研究では、標的細胞への化学療法薬の送達だけでは細胞死を誘発するのに十分ではなく、高用量のMTXは患者の治癒率と予後を大幅に改善できることが示されています[4]。 MTXの低い水溶性、低い透過性、および短い半減期は、その臨床応用を制限します[5、6]。 MTXの化学療法の効果は、腫瘍細胞の取り込みが少ないこと、組織の生体内分布、および深刻な副作用に大きく影響されます[7]。ただし、MTXの濃度が高いと、MTXの生物学的利用能が低いため、副作用のリスクが高まる可能性があります[8]。 MTXのバイオアベイラビリティを改善し、その副作用を減らすために、新しいドラッグデリバリーシステムを開発する緊急の必要性があります。

ナノテクノロジーは、薬物の安定性の改善、血液循環の延長、副作用の軽減、薬物放出の制御など、薬物送達システムに利点があります[9、10、11、12、13、14、15]。自己組織化技術は、薬物送達の分野で広く使用されており、薬物の有効性を高め、副作用を低減します[16、17、18、19、20]。私たちの研究は、MTXの溶解性と生体内分布を改善し、その副作用を軽減するためのナノゲルドラッグデリバリーシステムを設計することを目的としています。コンドロイチン硫酸（CS）は酸性グリコサミノグリカン（GAG）であり、軟骨、血管壁、皮膚、腱、その他の結合組織の重要な成分を構成しています[21]。コンドロイチン硫酸に基づくナノゲルは以前に研究されています[22、23]。研究によると、CD44はCSプロテオグリカンに結合します[24、25、26]。 CD44は、細胞外ドメインを持つ膜貫通型糖タンパク質であり、細胞間および細胞-ECMの相互作用の媒介に関与しており、細胞移動に役割を果たしています[27]。 CD44は、正常組織での発現レベルが低いのとは対照的に、転移性癌で高度に発現しています[28]。 CSに基づくナノ粒子は、腫瘍標的化および抗腫瘍薬物送達について報告されています[29、30]。ここでは、CS-CD44相互作用を介した癌細胞へのMTX薬物分子の標的化送達を強化するために、新しいタイプの自己組織化CS-MTXナノゲルを作製しました。

メソッド

資料とサンプル

コンドロイチン硫酸は、Dalian Meil​​un Biotech Co.、Ltd。（Dalian、Liaoning、China）から購入しました。 4-メチルモルホリン、テトラヒドロフラン、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジンはSun Chemical Technology（Shanghai、China）Co.、Ltd。から購入し、ウシ胎児血清（FBS）を購入しました。 HyClone（ユタ、米国）から。他のすべての化学物質は、Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd。（Shanghai、China）から購入しました。ルイスラットはShanghaiSippr-BK Laboratory Animal Co.、Ltd。（Shanghai、China）から購入しました。

DMT-MMの合成

4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）は、水性またはプロトン溶媒で使用できるカルボン酸活性化を伴う脱水縮合反応に使用されますシステム。 25グラムの2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン（CDMT）を200 mlのテトラヒドロフラン（THF）に溶解しました。次に、18.79 mlの4-メチルモルホリン（NMM）を攪拌しながらCDMT溶液に滴下しました。完全な応答を確実にするために、攪拌は30分間維持する必要があります。次に、ろ過した生成物をTHFで3回洗浄し、真空下で24時間乾燥させました。 DMT-MMは白色粉末として得られました（スキーム1）。

DMT-MMの形成における合成経路

MTX-CSの合成

MTX共役CSはDMT-MMによってアクティブ化されました。 CSの活性化では、CS（1.0 g）を20 mlの超純水に溶解し、DMT-MM（0.769 g）を添加して活性化しました。反応は室温で30分間行いました。次に、活性化されたCSを室温で24時間MTXとさらに反応させました。溶液を4時間ごとに水を交換しながら48時間透析し、凍結乾燥しました。 MTX-CSは黄色の粉末として得られた。黄色の粉末をフーリエ変換赤外分光法（ALPHA、BRUKER、USA）で調べた。 FTIRスペクトルは、400〜4000 cm ^-1 で記録されました。 。 ¹ H NMRを使用して、MTXがCSに結合しているかどうかを判断しました（スキーム2）。

MTX-CSの形成における合成経路

MTX-CSナノゲルの細胞毒性

ナノゲルの細胞毒性は、A549TとHela腫瘍細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）培養を使用して分析されました。 A549T細胞とHela細胞を、96ウェルプレートに5×10 ³ の密度で播種しました。 1640年のウェルあたりの細胞数、10％FBSを補充し、5％CO ₂ で24時間インキュベート 37°Cで。 A549Tの後にさまざまな濃度のMTX-CSNG（0、5、10、20、30、40、50、100、200、400μM）で処理し、Helaの後にさまざまな濃度のMTX-で処理しました。 CS NG（0、5、10、30、40、60、80、100μM）をさらに48時間。 MTX-CS NGの濃度は、各サンプルのMTXの含有量に基づいています。 CSの濃度は、各サンプルのMTX-CSNGの含有量に基づいています。 HUVECは、96ウェルプレートに5×10 ³ の密度で播種されました。 10％FBSを添加し、5％CO ₂ 下で24時間培養した、DMEMのウェルあたりの細胞数 37°Cで。次に、HUVECにさまざまな濃度のMTX-CS NG（0、5、10、20、30、40、50、100、200、400μM）を追加しました。 MTX-CS NGの濃度は、各サンプルのMTXの含有量に基づいています。 CSの濃度は、各サンプルのMTX-CSNGの含有量に基づいています。 MTTアッセイは、細胞活性の測定です。 20マイクロリットルのCCK-8バッファーを各ウェルに加え、5％CO ₂ の下で37°Cでインキュベートしました。 さらに4時間。培地を除去し、200μLのDMSOを各ウェルに加えました。 MULTISKAN GOマイクロプレートリーダー（Thermo Scientific、USA）を使用して、490 nm（参照として570 nm）の波長で吸光度を測定しました。

動物および実験計画

インビボでのMTX-CSNGの毒性を分析するために、18匹目のオスのSprague-Dawleyラットを浙江医科学アカデミーの実験動物センター（杭州、浙江、中国）から購入した。それらのラットは、水と食物への自由なアクセスで、12時間の明、12時間の暗サイクルの下で飼育されました。 8週齢（200±10 g）のラットを、ランダムに3つのグループに分けました。コントロールグループ（同量の生理食塩水を注射）、MTXグループ（1.25μmolkg ^-1 を注射）です。 日 ^-1 ）、およびMTX-CS NGグループ（25 mg kg ^-1 を注射） 日 ^-1 MTX-CS NG）。 MTX-CS NGグループのMTX投与量は、MTXグループの遊離投与量と同等でした（1.25μmolkg ^-1 日 ^-1 ）。薬は別の日にそれぞれ腹腔内注射によって与えられました。 2週間の治療（合計7回の注射）後、さらなる研究のために断頭によりすべてのラットを殺しました。

組織学的研究

断頭後、すべてのラットの脾臓を迅速に解剖し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、4％（ w ）で固定しました。 / v ）パラホルムアルデヒド（pH =7.4）（Sigma-Aldrich、MO、USA）24時間。次に、標準的な手順を使用してヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色用の組織を準備し、高品質の光学顕微鏡で取得しました。

結果と考察

MTX-CSの合成

MTXがCSに結合しているかどうかを判断するために、FTIRと ¹ を使用しました。 MTX、CS、およびMTX-CSバイオコンジュゲートサンプルを分析するためのHNMR。図1は、CS（図1a）、MTX（図1b）、およびMTX-CSバイオコンジュゲート（図1c）のFTIRスペクトルを示しています。図1bに示すように、MTXは3355、2951、1646、1600、1540、1493、1403、および1207 cm ^-1 で特徴的な透過率を示しました。 。 FTIRのピークは1600および1540cm ^-1 MTX（図1b）およびMTX-CSバイオコンジュゲート（図1c）のFTIRスペクトルに見られるパラベンゼンの伸縮に割り当てることができます。 FTIRの結果は、MTXがCSに正常に結合したことを示しています。

a CSのFTIRスペクトル。 b MTXのFTIRスペクトル。 c MTX-CSのFTIRスペクトル

図2は、 ¹ を示しています。 CS、MTX、およびMTX-CSバイオコンジュゲートのHNMRスペクトル。 6.93（2H、d、 J ）のピーク =10.1Hz）および7.84（2H、d、 J =10.1Hz）をMTXのベンゾイル基に割り当てることができます。 4.90（2H、s）のピークは、2,4-ジアミノ-6-プテリジニル基の隣のメチレンに割り当てることができ、8.69（1H、s）のピークは、2,4-ジアミノ-に割り当てることができます。図2bが示すように、MTXの6-プテリジニル基。 ¹ CS-MTXのHNMR（図2c）は、CS（二糖部分δ）を示唆しました。 _H シグナルは3.20〜5.40で、5.39がアノマー炭素として割り当てられています）がMTXに正常に結合しました（ベンゾイル基の化学シフトは8.00〜6.88、メチル基は3.20でした）。 NMRは、MTXがCSに結合していることも証明しました。

¹ CS、MTX、およびCS-MTXのHNMRスペクトル。 a ¹ CSのHNMRスペクトル; CSはD ₂ に溶解しました O. b ¹ MTXのHNMRスペクトル; MTXをジメチルスルホキシド-d6に溶解した。 c ¹ CS-MTXのHNMRスペクトル; CS-MTXはD ₂ に溶解しました O

CSに結合したMTXの量を計算するために、サンプルを超純水に溶解し、室温で48時間振とうしました。 MTXの量は、309nmのUV-vis分光光度計を使用して決定しました。 MTXの量はUV-vis分光法によって測定されました。最後に、MTX-CS NGのメトトレキサートの計算量は13.65％でした。 CSの親水性側鎖の外層による疎水性MTX分子のカプセル化によって形成されたナノゲル（図3a）。ナノゲルは、動的光散乱（DLS）、原子間力顕微鏡（AFM）、および透過型電子顕微鏡（TEM）によって特徴づけられました。示されているように、DLSデータは、100〜400 nmの範囲ですべてのナノゲルのサイズを測定しました（図3b）。ナノ粒子の粒子サイズは主に約200nmです。ナノゲルのAFM画像は、ナノ粒子が約200 nmの同様のサイズと形態で十分に分布していることを確認しました（図3c）。 TEM画像は、ナノゲルのサイズが200〜240nmの範囲のサイズのナノスフェアであることも示しています。ナノ粒子の粒子サイズは主に約200nmです（図3d、e）。

MTX-CSNGの概略図。 MTX-CS NGの動的光散乱（DLS）、原子間力顕微鏡（AFM）、および透過型電子顕微鏡（TEM）の特性評価。 a MTX-CSNGの概略図。 b 代表的な実験でDLSによって測定されたMTX-CSNGのサイズ。 c MTX-CSNGのAFM画像。 d 、 e MTX-CSNGのTEM画像

CSに結合したMTXの量を計算するために、サンプルを超純水に溶解し、室温で48時間振とうしました。 MTXの量は、313nmのUV-vis分光光度計を使用して決定しました。

MTXの量はUV-vis分光法によって測定されました。最初に、遊離メトトレキサートUV吸収の標準曲線を設定しました（図4）。吸光度と遊離MTX濃度の関係は次のとおりです。

メトトレキサートUV吸収の標準曲線

次に、28.8mgのMTX-CSを1000mlの超純水に溶解し、UV吸収は0.2055です。最後に、MTX-CS NGで計算されたメトトレキサートの量は13.65％でした。

MTX-CSナノゲルの細胞毒性

MTX-CS NG、遊離MTX、およびCSと混合したMTXのin vitro抗腫瘍活性を、A549TとHela腫瘍細胞培養の両方を使用して分析しました。 MTTアッセイ（図5）で示されているように、MTX-CS NGは両方の癌細胞の生存率を大幅に低下させる可能性がありますが、遊離MTXは高濃度では効果を示しませんでした。高濃度でCSと混合されたMTXは癌細胞の成長さえ促進します。 Helaの生存率は、10μMの薬物濃度で遊離MTXの73.81％からMTX-CS NGの60.16％に減少しました（細胞生存率の13.65％の減少）（図5a）。同様に、A549T細胞の生存率は、50μMの薬物濃度で遊離MTXの80.23％からMTX-CS NGの46.04％に減少しました（細胞生存率の34.09％の減少）（図5b）。ヒアルロン酸などの多糖類は、CD44受容体に特異的に結合するため、癌治療用の薬物コンジュゲートまたはナノ粒子の標的部分として使用されます[31]。コンドロイチン硫酸はCD44受容体のリガンドとしても機能します[25、27]。これは、CSが癌細胞によるMTX-CS NGの取り込みを促進し、MTXの薬効を高めることができることを意味します。さらに、ナノ粒子は薬物の安定性を改善し、薬物の放出を制御することができます[32、33]。すべての結果は、MTX-CSNGの抗腫瘍活性が遊離MTXおよびCSと混合されたMTXよりも優れていることを証明しました。 MTX薬物分子の細胞内送達効率の向上に伴い、同じ濃度の遊離MTXと比較した場合、MTX-CSNGのターゲティング選択性も向上しました。これらの結果は、MTX-CSNGが遊離MTXよりも優れた抗腫瘍効果を持っていることを示しています。

a 無料のMTX、無料のMTXとCS、およびMTX-CSNGの存在下でのA549Tの細胞生存率（48時間）。 b 無料のMTX、無料のMTXとCS、およびMTX-CSNGの存在下でのHelaの48時間での細胞生存率。 c 48時間での遊離MTX、CS、およびMTX-CSNGの存在下でのHUVECの細胞生存率

MTX-CS NG、遊離MTX、およびCSの悪影響は、HUVEC培養を使用して分析されました。 MTTアッセイ（図5c）で示されているように、MTX-CS NGは副作用を大幅に軽減する可能性があり、遊離MTXはHUVECの生存率を大幅に低下させる可能性があります。 HUVECの生存率は、10μMの薬物濃度で遊離MTXの63.6％からMTX-CS NGの73.5％に増加しました（細胞生存率が9.9％増加）（図5c）。 400μMでのHUVECの細胞生存率は依然として69.95％でした。結果は、MTX-CSNGが正常細胞への副作用を軽減できることを示しました。

動物および実験計画

癌患者の治療に使用されるMTXの主な二次毒性副作用の1つは腸粘膜炎であり、これは体重の急速な減少を引き起こします[34]。次に、オスのSprague-Dawleyラットにおける化学療法誘発性の体重減少に対するMTX-CSNGの保護効果をテストしました。生理食塩水、遊離MTX、およびMTX-CS NGの注射後14日間、生存率と体重を監視しました。 3つのグループのいずれにも死亡は見られませんでした。すべてのMTXグループの体重の急激な減少が観察されました（1.25μmolkg ^-1 日 ^-1 14日間）、MTX-CS NG（4.25 mg kg ^{-1 <）で治療されたラットの体重が、化学療法症候群と化学療法誘発性の損傷を経験し、病気と体重の減少をもたらしたことを明確に示しています。 / sup> 日 -1 14日間）わずかに増加しました（図6）。結果は、MTX-CSNGが悪影響を引き起こさなかったことを示しています。これらの発見は、CD44-CS相互作用を介した腫瘍組織へのMTXの標的送達をサポートし、MTX薬の細胞毒性を低減します。}

ラットの体重に対するMTXおよびMTX-CSNGの影響。最初の注射の日は0日目と見なされました。生理食塩水、MTX（1.25μmolkg ^-1 日 ^-1 ）、およびMTX-CS NG（4.25 mg kg ^-1 日 ^-1 ）対応するグループにそれぞれ腹腔内注射によって別の日に与えられた。結果は平均±SEMとして表され、 t を使用して分析されます テスト。 * P <0日目の日付と比較して0.05

MTX-CSNGのinvivo毒性をさらに調査するために、ラットの脾臓の組織学的分析を行って、MTX-CS NGが組織損傷を引き起こしたかどうかを判断しました（図7）。対照群の切片は、白脾髄（形状）と赤脾髄（RP）で構成され、脾臓の髄に繊維状の小柱（T）が伸びている正常な脾臓の構造を示しました。白脾髄は動脈周囲リンパ鞘と脾臓濾胞を含み、辺縁帯に囲まれていますが、赤脾髄は脾索で構成されており、脾臓の正弦波によって隔てられています（図7aおよび7b）。 MTX治療群は、白脾髄（ブラックボックス）とRPの両方の深刻な狭窄を示しました。ヘモジデリン沈着物は、MTX治療群にも見られます（図7cおよび7d）。 MTX-CS NG治療群は、白脾髄（形状）とRPの両方の軽度の狭窄を示し、ヘモジデリン沈着物は見つかりませんでした。白脾髄と赤脾髄はどちらも、MTXグループと比較して軽度の狭窄を示しました（図7eおよび7f）。上記の結果は、MTX-CS NGが正常組織にほとんど副作用を及ぼさないことを示しています[35、36]。

ラットの脾臓に対するMTXおよびMTX-CSNGの毒性効果。 H＆E染色された脾臓は、7回の腹腔内注射後14日間の治療後にマウスから切除されました。 a 、 b コントロールグループのセクション。 c 、 d MTX治療群。 e 、 f MTX-CSNG治療群

結論

要約すると、高効率の抗腫瘍ドラッグデリバリーのための自己組織化ナノゲルの製造に成功しました。 MTX-CS結合ナノゲルのサイズは約200nmで、優れた安定性と溶解性を示しています。 MTX-CS NGは、MTXよりも強力で特異的な細胞毒性を示しました。インビボ実験は、MTX-CSNGがMTXよりも毒性が低いことを示した。 MTX-CS NGは、MTXの副作用を軽減しながら、抗腫瘍効果を向上させることができます。 CD44結合特性により、コンドロイチン硫酸-薬物コンジュゲートは、難溶性薬物分子の溶解性を改善するだけでなく、癌細胞や腫瘍組織への能動的かつ選択的な標的送達を改善するための有望で効率的なプラットフォームとなります。

略語

¹ H NMR：

1H核磁気共鳴

AFM：

原子間力顕微鏡

CDMT：

2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン

CS：

コンドロイチン硫酸

DLS：

動的光散乱

DMT-MM：

4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド

FTIR：

フーリエ変換赤外

MTT：

3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド

MTX：

メトトレキサート

MTX-CS NG：

メトトレキサート-コンドロイチン硫酸ナノゲル

NG：

ナノゲル

NMM：

4-メチルモルホリン

TEM：

透過型電子顕微鏡

THF：

テトラヒドロフラン

UV-vis：

紫外可視分光法