ドラッグリポジショニング

SARS-CoV-2メインプロテアーゼの阻害

新薬の開発は、費用と時間がかかるプロセスです。今日、世界はパンデミックに直面しているため、ウイルスの増殖を阻止する薬剤を迅速に特定することが急務となっています。ドラッグリポジショニングは、人間にとって安全であることが知られている薬が新しい病気の治療に使用できるかどうかを特定しようとすることで、この長いプロセスの魅力的な代替手段を提供します。

このような再配置された薬剤を個別に使用しても、最終的には大きな臨床的利益は得られない可能性がありますが、1990年代のHIVの場合のように、ウイルスの複製と増殖に不可欠ないくつかのタンパク質を標的とする薬剤を注意深く組み合わせると非常に効果的です。緊急の問題は、どちらの組み合わせがより効果的かということです。

ここでは、SARS-CoV-2プロテアーゼ活性部位の構造を理解し、マイクロモル阻害剤と複合体を形成したSARS-CoVプロテアーゼの既存の構造と比較して、優れた阻害剤を作成するために必要な主要な相互作用をよりよく理解できるようにします。 SARS-CoV-2プロテアーゼの場合。

次に、FDA承認薬のライブラリを使用して仮想スクリーニング実験を実施し、これらの一部がプロテアーゼに結合すると予測されるかどうかを確認しました。それらがSARS-CoV-2プロテアーゼに結合することがどのように予測され、したがって併用療法で使用できるかを調べました。

SARS-CoV–2タンパク質

病気の患者からのSARS-CoV–2ゲノムは迅速に分離および配列決定され、可能なタンパク質標的の配列を提供しました。これらのタンパク質はSARS-CoVタンパク質と高い配列類似性を共有しており、当初、研究グループはホモロジーモデルの構築を開始しました。現在、これらの実験的に導出された（X線および低温電子顕微鏡）構造がますます利用可能になっているのを目にしています。

コロナウイルスの中で最も特徴的な創薬ターゲットの1つは、主要なプロテアーゼであるMproであり、3CLプロテアーゼとも呼ばれます。 ¹ この酵素は、パパイン様プロテアーゼとともに、ウイルスRNAから翻訳されるポリタンパク質を処理するために不可欠です。 ² 大きなポリプロテイン1abの11個の切断部位でアミノ酸骨格を切断します（図1）。

この酵素の活性を阻害すると、ウイルスの複製が阻止されます。同様の切断特異性を持つヒトプロテアーゼは知られていないため、この標的に対する阻害剤は毒性が低く、副作用を引き起こす可能性がはるかに低くなります。

ドラッグリポジショニングのための構造ベースのドラッグデザイン：主なプロテアーゼ

この主要なプロテアーゼはホモ二量体であり（図2）、各サブユニットにはHis41 / Cys145触媒ダイアドが含まれています。

SARS-CoV-2は、SARS-CoVプロテアーゼと96.1％の同一性と99％の類似性を共有しています。 （図3）活性部位のアミノ酸の違いは1つだけです。SA​​RS-CoV-2の残基46は、SARS-CoVのアラニンではなくセリンです。

PDBで利用可能なリガンドと複合体を形成したSARS-CoVMproの多くの構造があり、マイクロモル結合親和性を持つリガンドはすべて共有結合リガンドです。

主なプロテアーゼの活性部位はコロナウイルス間で高度に保存されており、通常は4つの部位（S1 '、S1、S2、S4）で構成されています ³ （図4）。

リガンドがそれぞれ0.038μMおよび0.053μMのKi値を有するPDB構造2ZU4および2GX4の場合、S1 '部位のシステイン145のチオールは共有結合で阻害剤と接触します。親和性の低い他の阻害剤と比較すると、これは親和性が高いために重要であるようです。

これらすべてのリガンドがこのプロテアーゼとどのように相互作用するかを注意深く調べると、ドッキング結果を分析するときに監視する重要な相互作用に関する情報が得られる可能性があります。

バーチャルスクリーニング

2月にリリースされた共有結合したペプチド様阻害剤N3（6LU7）と複合体を形成したSARS-COV-2プロテアーゼダイマーの高解像度結晶構造を利用する ⁴ 、この構造を使用して仮想スクリーニング実験を実施しました。共結晶化された阻害剤N3は、拡張されたコンフォメーションで基質結合ポケットに結合します。 （図5）

まず、2,684の化合物を含むFDA承認薬を含むライブラリから始めました。分子量が800kDa未満の化合物を保持し、CCDCのGOLDとドッキングしました。その後、CHARMMおよびGBMV陰溶媒を使用して結合自由エネルギーを計算しました。各ポーズについて、最初に、残基の柔軟性のために直径14Åの球を使用してIn Situリガンド最小化を実行し、結合自由エネルギーを計算するときにリガンドエントロピーを推定しました。ドッキングされている化合物のほとんどは、既知のHCVおよびHIVプロテアーゼ薬です。 （図6）

多くの化合物は、S1、S’1、S2、S4の4つのサブサイトで接触し、一部はHIS41とCYS145の両方、特にHIVプロテアーゼ阻害剤と接触します。

最高得点の化合物は、フラボノイドであるトロキセルチンです。

• フラボノイドはいくつかのプロテアーゼを阻害することが示されています ⁵ そして最近IC ₅₀ 値は、SARS-CoVでのヘルバセチン、ロイフォリン、ペクトリナリンの用量依存性阻害曲線から計算されました。測定値はそれぞれ33.17、27.45、37.78μMでした。

5番目にランク付けされた化合物であるジピリダモール（図7）は、凝固機能障害のあるCOVID-19患者に対するジピリダモールの治療効果がプレプリントで最近言及され、100 nM invitro。

図7 ：メインプロテアーゼ中のジピリダモールの3Dレンダリングと2D相互作用マップ。触媒残基との相互作用が存在し、SARS-CoV阻害剤について前述したいくつかの残基との相互作用があります。

最近のプレプリントでは、いくつかのHIVプロテアーゼ阻害剤の細胞アッセイが報告されています。「ネルフィナビルは、invitroでの重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2の複製を阻害します。 。」

プレプリントから表を報告しています（表1）。これらはIC50ではなくEC50であるため、これらの分子がプロテアーゼにどれだけよく結合するかはわかりません。ただし、これは、これらすべての化合物がSARS-CoV-2の複製を阻害しており、一部の化合物が他の化合物よりも活性が高いことを示しています。

リトナビルとロピナビルは、SARS-CoVプロテアーゼを標的とする他​​の化合物で以前に見られた多くの残基と相互作用しています（図8および9）。これら2つの分子を組み合わせたいくつかの臨床試験が進行中ですが、残念ながら、SARS-CoV-2のリトナビルまたはロピナビルのIC50データはありません。

図8 ：リトナビルの最高スコアのポーズ：および2D相互作用図は、リトナビルが2つの触媒残基（CYS145およびHIS41）と相互作用していることを示していますが、SARS-CoVの他の既知の阻害剤で見られるようにGLU166、PRO168、およびGLN189も相互作用しています。

図9 ：ロピナビルの最高スコアのポーズ：および2D相互作用図は、ロピナビルが2つの触媒残基CYS145およびHIS41と相互作用していることを示していますが、SARS-Co Vの他の既知の阻害剤で見られるようにGLU166、PRO168およびGLN189も相互作用しています。

ネルフィナビル（図10）は、私たちの計算で予測される結合親和性が高く、最近のプレプリントでCOVID19に対しても特徴付けられています：「ネルフィナビルはVeroE6細胞のSARS-CoV-2に対して活性があります。」

2番目のプレプリントは、アタザナビルがSARS-CoV-2感染細胞に対して活性があることを示しています。「アタザナビルはSARS-CoV-2の複製と炎症性サイトカインの産生を阻害します。」

この作業を開始した後、SARS-CoV-2の新しい阻害剤を含むPDB構造6W63が公開されました（図11）。この化合物のSARS-CoV-2Mproへの結合親和性に関する公表された情報はありません。結合部位の側鎖は、6LU7の場合とほぼ同じ方向にあります。化合物をドッキングし、以前と同様にMMGBSAアプローチで再スコアリングしたところ、非常に類似した結果が得られました。

図11 ：PDB構造6W63：阻害剤X77と複合体を形成したSARS-CoV-2メインプロテアーゼ。

展望

SARS-CoV-2プロテアーゼの結合部位は非常に大きく、4つのサブ部位を含み、中程度の結合親和性で多くの異なるリガンドに対応できます。ここで説明するように、仮想スクリーニングは、考えられる阻害剤を特定するための便利なツールであり、考えられる阻害剤がプロテアーゼとどのように相互作用するかについて、構造的な説明を与えることができました。

ただし、これらすべての仮説では、より堅牢なモデルを構築するために、IC50の測定などの実験的証拠による確認が必要です。

ここでは共有結合ドッキングを実行していませんが、SARS-CoVプロテアーゼに対して最も活性の高い化合物は共有結合であったため、これは強力な阻害剤の要件である可能性があります。共有結合阻害剤は、強力な標的親和性や患者の作用寿命の延長など、可逆的阻害剤と比較して利点も示します。

薬が患者に有効であるためには、薬物動態などの他の薬理学的側面を考慮する必要があります。ヒトへの承認された投与後、これらの薬剤が目標の血漿および肺濃度を達成する能力を評価する必要があります。

現在の流行にはタイムリーではないため、他の構造ベースの設計研究についてコメントすることは、この作業の範囲内ではありませんでした。私たちの目的は、COVID19に対する潜在的な候補薬のすぐに使用できる治療法を評価することでした。

この作業での仮想スクリーニングにGOLDを使用する許可を与えてくれた、Cambridge Crystallographic Data Center（CCDC）に感謝します。 GOLDは、仮想スクリーニング、リードの最適化、および活性分子の正しい結合モードの特定に成功していることが証明されています。 GOLDへのインターフェースはDiscoveryStudio内で利用できます。

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