黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性菌株に対するその場で調製されたキトサン/銀ナノ粒子溶液の抗菌活性

背景

かなりの数の抗生物質と消毒剤が存在するにもかかわらず、感染症は世界中で罹患率と死亡率の主な原因であり続けています。中等度および重度の感染症では、抗生物質療法は通常、細菌学的検査の結果を得る前に経験的に開始されます。抗生物質の絶え間ない使用は、抗生物質耐性微生物の選択と増殖のための好ましい条件を作り出しました[22]。今日、すべての感染過程の薬剤に対する多剤耐性の高い有病率が文書化されています[6]。最も悪名高い多剤耐性菌は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌です。 （MRSA）[9]。病原体は、皮膚感染症から肺炎、心内膜炎、敗血症などの重篤な障害に至るまで、広範囲にわたるヒトおよび動物の疾患の原因であり、これらの感染症はヒトの健康に影響を与える可能性があります[32]。治療が不十分な患者の感染症の病因の分析により、MRSAベースの感染症の32.6％の症例で治療が不十分であり[12]、年間の医療費が30〜40億米ドルに関連していることが明らかになりました[32]。

MRSAに対する新しい有効な薬の調査は、現代医学の緊急の問題です。抗生物質の代替としての防腐剤は、耐性菌に対して強力で持続的かつ積極的な製剤であり、微生物減少症に違反しません。これらの問題を克服するには、新しく革新的な準備が必要です。ハイブリッドナノ材料を設計することによって抗菌作用の異なるメカニズムを組み合わせるアプローチは、耐性菌との戦いにおける新しいパラダイムを提供します[18]。銅や銀などの金属は、非常に低濃度でバクテリアに対して非常に毒性があります。殺生物活性のために、金属は、農業、ヘルスケア、および一般的な産業に関連する多くの用途で抗菌剤として広く使用されてきました。他の抗菌剤とは異なり、金属は現在業界で見られる条件下で安定しており、添加剤として使用できます[19]。

銀の抗菌特性は古くから知られており、細菌の抗生物質耐性の増加と一部の細菌株に対する合成抗生物質の無効性により、抗菌剤としての銀、銀塩、銀化合物、およびナノ結晶銀への関心が再び高まっています。銀ナノ粒子（Ag NP）には、顕著な抗菌および抗真菌効果があります[26]。 Ag NPは、他の抗生物質や防腐剤（セフタジジム、ストレプトマイシン、カナマイシン、ポリミキシン）との相乗効果を示します[25、38]。しかし、J。Jainsは、クロラムフェニコールがAgNP溶液の抗菌効果を低下させることを示しました[16]。

Ag NPの使用を制限する主な欠点は、凝集が容易であること、銀イオンの放出が制御されていないこと、および細胞毒性の可能性があることです[40]。 Ag NPとキトサン、プロポリス、粘土、ゼオライトなどの天然物質との組み合わせ[33、35]は、追加の効果をもたらします。ポリマーとナノシルバーの組み合わせは、相乗的に抗菌効果を向上させる可能性があり、insitu合成法を使用すると、ポリマーマトリックスに組み込むことができ、均一な分布を実現し、凝集を回避できます[28]。

近年、金属NPを合成するためのグリーンケミストリー法の効率が大幅に向上しています[1]。植物抽出物は、還元剤、安定剤、およびキャッピング剤としてよく使用され[23]、NP合成のための費用効果が高く環境に優しい方法を提供します。植物抽出物の中で、ショウガ抽出物はその化学的および生物学的特性のおかげで科学的に非常に興味深いものです[8]。ショウガの葉の抽出物は、銀NPの合成にすでに使用されています[37]。ただし、生成された粒子の粒子サイズ分布はかなり広い（10〜100 nm）。生姜の根茎は、香辛料や民間療法として広く使用されています。その抽出物には、特定のフェノール化合物が含まれています。ジンゲロールとその誘導体、多くの生物活性フェノールおよび非フェノール成分です[31]。これらの化合物は、抗菌性、抗真菌性、および抗ウイルス性のものを含む幅広い活性を示します。根茎ショウガ抽出物は、抗酸化作用と抗炎症作用も示すため、生物活性と生体適合性のあるナノ粒子の開発に非常に有望な基盤のようです。

キチンとキトサンは、静菌性/殺菌性とヒト組織との生体適合性により、医療用途に有望な材料です[20]。キトサンはキチンの誘導体であり、キチンの脱アセチル化によって得られます。どちらも同じモノマー N を含んでいます -アセチル-2-アミノ-2-デオキシ-D-グルコピラノースと2-アミノ-2-デオキシ-D-グルコピラノース。これらはアセチル化モノマーと脱アセチル化モノマーの比率が異なります。キトサンは、AgやCuなどの金属ナノ粒子を含むさまざまな物質との複合材料を形成するための有望な材料です[33]。一方、臭化セトリモニウム（CTAB）は、溶液中のナノ粒子を安定化し、ZnO、TiO2、Niなどの一部のナノ粒子の毒性を低下させることができます[17]。しかし、CTAB-NPs複合体の抗菌活性に関するデータは限られています[7]。

この研究の目的は、MRSA臨床株に対して有効な溶液組成（キトサン/ Ag）に対してCTABによって変更されたキトサンとAgNPの最適な比率を見つけることです。

メソッド

資料

硝酸銀、L-アスコルビン酸、臭化セトリモニウム（C ₁₆ H ₃₃ ）N（CH ₃ ） ₃ Br（CTAB）はSigma-Aldrichから購入し、受け取ったままの状態で使用しました。生姜（ Zingiber officinale 、 Zingiber acae ）根茎は地元のスーパーマーケット（ポーランド、ポズナン）で購入されました。キトサン200kDa、脱アセチル化度82％は、CJSC「Bioprogress」（ロシア、モスクワ）から購入し、さらに精製することなく使用しました。超純水（抵抗率>17MΩcm ^{− 1} ）GZY-P10水システムからの水システムが実験を通して使用されました。抗生物質を含むすべてのメディアとディスクは、Hi Media（インド）から購入しました。

キトサン/ AgNPソリューションのinsitu調製

キトサン/ Ag溶液をその場で調製するために、最初にAg NPを合成し、修飾しました。

AgNPの合成

Ag NPは、グリーンケミストリーアプローチを使用した化学還元法によって合成されました。このアプローチに従って、生姜（ Zingiber officinale ）を使用しました ）界面活性剤として抽出し、還元剤としてアスコルビン酸（ビタミンC）。ショウガの根茎抽出物を調製するために、250 gの根茎を蒸留水で十分に洗浄した後、細かく切りました。刻んだショウガの根茎を水-エタノール溶液（250 ml、1：1の比率）に5日間（室温、暗所で）保管しました。次に、上澄みを（ワットマン濾紙で）真空濾過し、保存しました（4°C）。 Ag NPを合成するために、硝酸銀（840 mg）を水（20 ml）に溶解し、ショウガの根茎抽出物（20 ml）を加えました。次に、L-アスコルビン酸（10％、10 ml）とショウガ抽出物（20 ml）の溶液の混合物を、磁気ステアリングの下で​​硝酸銀溶液に滴下しました。反応混合物は暗くなった。次に、還流下で加熱（60°C、1.5時間）しました。次に、新たに合成したAg NPを、遠心分離（4000 rpm、30分）を使用して、pHが7に達するまで水で洗浄しました。

Ag NPの抗菌活性と分散性を改善するために、CTABによるAg NPの表面修飾が行われました。これは、その表面活性と消毒特性でよく知られています[17]。通常、Ag NPの分散液（3 ml、76.4 mg / ml）をCTAB溶液（20 ml、6.7 mg / ml）と混合し、超音波処理（3時間）しました。次に、UV-Vis測定のために上清を収集し、遠心分離（4000 rpm、30分）を3回使用して、AgNPを水で洗浄しました。上澄み中のCTABの含有量は、190 nmのピークの強度を監視することにより、分光光度法（UV-Vis）を使用して決定されました。 CTABに対するAgNPの吸着率（mg / g）は、溶液中の初期CTAB含有量とサンプルとの相互作用後の上清中の含有量の差から計算されました。吸着率とCTABの負荷量は、次の式から計算されました。

吸着率（mg / g）=（溶液中のCTABの重量−上澄み中のCTABの重量）/（Ag NPの重量）、

CTAB負荷量（％）=（1 −（Ag NPの重量）/（CTAB負荷Ag NPの重量））×100％。

キトサン/ AgNPソリューションのinsitu調製

キトサン/ AgNP溶液を得るには、200 kDaのキトサン（1 g）を2％酢酸（100 ml）に室温で24時間溶解し、1％キトサン溶液を形成しました。実験では、AgNPの2つのサンプル（純粋なAgNPとAgNP-CTAB）を使用しました。

AgNPとキトサンの物理化学的特性評価

粉末X線回折（XRD）研究は、エンパイア回折計（PANalytical）で、CuKα放射線（1.54Å）、反射透過スピナー（サンプルステージ）、およびブラッグ-ブレンターノ形状で動作するPIXcel3D検出器を使用して実施されました。 。 2Thetaスキャンは、室温で10°から95°の範囲の角度で、0.007°のステップサイズで、連続スキャンモードで記録されました。

透過型電子顕微鏡（TEM）測定は、加速電圧200kVで動作するJEM-ARM-200F透過型電子顕微鏡を使用して実行されました。

赤外線スペクトルは、グローバルソースとMCT検出器を備えたTensor 27（Bruker Optics）分光計を使用して取得しました。サンプルは、臭化カリウムをマトリックス材料として使用して調製し、1mgのサンプルと200mgのKBrの比率で混合しました。ペレットは、10トン/ cmの圧力下で標準的な手法を使用して準備されました ² 直径16mmのバレルを備えています。測定は室温で行った。スペクトルごとに、4000〜400 cm ^{− 1} のスペクトル範囲で512回のスキャン 4 cm ^{−1の解像度で撮影されました。} データは、Opusソフトウェアパッケージを使用して処理されました。

分光光度測定（UV-Vis）は、UV / VIS / NIR Spectrometer Lambda 950（Perkin Elmer）を使用して、波長200〜800 nmで、参照溶液として水を使用して実行されました。

微生物学的検査

細菌培養

細菌培養物は、中鼻道の領域および70人の入院患者の喉から、先端が綿棒で滅菌されたワイヤースワブを使用して収集されました。検体は輸送媒体で直ちに実験室に輸送され、次に血液寒天培地に接種された。細菌培養物は、スミー州立大学の細菌学研究所の一般細菌学のための方法のマニュアルに従った標準的な実験室手順によって形態学的および生化学的に同定された。 50個の黄色ブドウ球菌を分離しました 株。各培養物はグラム染色を受け、カタラーゼ、遊離コアグラーゼ、黄色色素、マンニトール発酵、高塩濃度での増殖、および卵黄寒天培地（Hi Media、ムンバイ）でのリパーゼ産生についてテストされました。

抗菌薬感受性試験

抗生物質感受性試験はすべての S で実施されました 。 アウレウス それらの抗生物質耐性プロファイルを決定するために分離します。 Kirby-Bauerディスク拡散法を使用して、分離株の抗生物質感受性を評価しました。抗菌薬感受性試験は、アジスロマイシン、レボフロキサシン、クラリスロマイシン、シプロフロキサシン、およびメチシリンに対するミューラーヒントン寒天培地で実施されました（National Committee for Clinical Laboratory Standards、1999）。新鮮な一晩培養物を調製し、試験に使用した。 S の標準株 。 アウレウス ATCC25923を対照として使用した。各分離懸濁液からのアリコート（100μL）をミューラーヒントン寒天培地にスプレッドプレートしました。抗生物質ディスクを接種したミューラーヒントン寒天培地に静かに押し付けて表面との密接な接触を確保し、プレートを37°Cで18〜24時間好気的にインキュベートしました。抑制ゾーンの直径を測定した。臨床検査標準協会（CLSI）のガイドライン[24]によって開発された評価基準に従って、臨床株は感受性および耐性として分類されました。 黄色ブドウ球菌の菌株 メチシリンに耐性があることが判明したものは、MRSAとしてスクリーニングされました。

キトサン-AgNPソリューションの最小発育阻止濃度の決定

キトサン溶液、Ag NP、およびキトサン-Ag NP溶液の抗菌活性は、ブロスマクロ希釈法を使用してNCCLS（1999）の推奨に従って決定されました。各メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対する試験溶液の最小発育阻止濃度（MIC）を決定しました。 （合計10のMRSA株）。細菌の視覚的増殖を完全に阻害する（濁りがない）最低濃度のチューブをMICと見なしました。

簡単に説明すると、最初に、7つの濃度の純粋なAgNPとAg / CTAB NPを、2倍段階希釈法で栄養ブロスを使用して調製しました。すべてのタイプのAgNP希釈液の3つの同一の行がありました。次に、各列のすべてのチューブに、1、2、または3 mlの1％キトサン溶液を追加しました。テストしたチューブ内のキトサンとAgNPの最終濃度を表1に示します。

試験細菌株を適切なブロスで増殖させ、滅菌生理食塩水で1回洗浄し、蒸留水で希釈した。細菌濃度は、600 nmで0.08の光学密度に標準化されました（約1.5×10 ⁸ UFC / mL）マクファーランドスケールを使用。次に、100μlの S 。 アウレウス 懸濁液を、Ag NP、キトサン溶液、およびAgNP-キトサン溶液をチューブに接種しました。増殖培地を含むチューブおよび接種物を含まない試験サンプルを対照として使用した。すべてのチューブを37°Cで24時間好気的に培養しました。すべての対策は3回行われました。

結果

InSitu溶液調製に使用されるAgNPとキトサンの特性評価

合成されたAgNPの一部は、CTAB（Ag / CTAB NP）によって変更されました（Ag NP分散液の生物活性と安定性を向上させるため）。 CTABに対するAgNPの吸着率は70.0mg / gであることがわかりました。これは、サンプルの約6.54％のCTAB含有量に相当します。

Ag NPのXRD測定の結果は、38.15、44.33、64.48、77.47、および81.54°2Thetaに4つの鋭いピークの存在を示しました（図1a）。 American Mineralogist Crystal Structure Database（AMCSD）[5]によると、これらのピークは銀に起因していました。 12.00〜21.06°2Theta内の広いピークは、合成に由来する有機化合物（L-アスコルビン酸と生姜）に起因する可能性があります。キトサンのXRDパターン（図1a、挿入図）は、半結晶性キトサンの典型的な指紋である約9および20°2Thetaに回折ピークを示します[5]。キトサンの結晶化度は、対応するヒドロキシルと N の間の水素結合から生成されます。 -アセチル基。各結晶ピークは、ポリマー鎖またはシートの平行および逆平行配列から生成される結晶構造を特徴づけます。半結晶性キトサンには、アモルファス領域と結晶領域があります。

AgNPとキトサンの特性評価。 a XRDパターン、 b FTIRスペクトル、 c Ag NP（水）のUV-Vis吸光度スペクトル、 d AgNPのTEM画像

キトサンとAgNPのFTIRスペクトルを図1bに示します。キトサンのスペクトルは、3450〜3200 cm ^{− 1} で広く強いバンドを示しています。 （水素結合したOH伸縮振動）NH伸縮バンド、2783 cm ^{− 1} のCH伸縮バンドと重なっている 、および1652 cm ^{− 1} のアミドIのバンド （図1b）。メチレン基とメチル基の曲げ振動もνで見られます =1375 cm ^{− 1} およびν =1426 cm ^{− 1} 、 それぞれ。 1160〜1000cmの範囲での吸収 ^{− 1} CO基の振動によるものとされています。 νの近くにあるバンド =1150 cm ^{− 1} キトサンの脱アセチル化に起因する酸素ブリッジ内のCOの非対称振動に関連しています。 1080〜1025 cm ^{− 1} 付近のバンド νに起因します _CO リングのCOH、COC、およびCH ₂ ああ。 〜890 cm ^{− 1} の小さなピーク キトサンの糖構造の揺れに対応します[11、13]。

Ag NPのFTIRスペクトルは、1226、1366、1636、1714、2851、2924、および3438 cm ^{− 1} にいくつかの強いピークを示しました。 。後者は、H結合したOH基に起因していました。 1226および1366cm ^{− 1} のピーク COおよびCHの曲げ振動によるものです。 1636および1714cm ^{− 1} の二重ピーク C =CおよびC =O基の存在を示します（伸縮振動）。 2851および2924cm ^{− 1} のピーク CH伸縮振動に関連しています[13]。 Ag NP表面に有機基が存在するのは、FTIRスペクトルが知られているL-アスコルビン酸とショウガの合成に使用される有機化合物によるものです[10]。後者のスペクトルをAgNPのスペクトルと比較すると、1636および1714 cm ^{− 1} の二重ピークに気付く場合があります。 L-アスコルビン酸と赤方偏移のスペクトルに固有です。 1000〜1200 cm ^{− 1} 内にある最も強い生姜のピーク （COC振動）は、AgNPスペクトルでは集中的に表現されません。したがって、L-アスコルビン酸は、銀イオンの還元、2つの電子の移動、およびデヒドロアスコルビン酸への変換において主要な役割を果たします[29]。 L-アスコルビン酸のピーク位置の青方偏移は、AgNP表面でのこの分子の化学結合の証拠を示しています。

水に分散したAgNPのUV-Vis吸光度スペクトル（図1c）は、約387nmに非対称ピークを示しました。 387〜420 nm内のピークは、Ag NPの特徴的なピークとして知られており、通常、表面プラズモン共鳴効果に起因します[30]。このピーク（プラトー）の非対称性は、AgNPの急速な沈殿に起因する可能性があります。約264nmのピークは、Ag NPでも知られており、通常、AgNPで実行される高エネルギー状態への電子の遷移に関連しています[38]。一方、L-アスコルビン酸のUV-Visスペクトルでも、255nmにピークが見られました[4]。したがって、AgNPスペクトルの264nmのピークは、L-アスコルビン酸の赤方偏移したピークと見なすことができ、AgNP表面にこれらの化学結合した分子が存在することを確認します。

Ag / CTAB NPのUV-Visスペクトル（図1c、青い線）が417nmに対称的なピークを示したことは興味深いことです。これにより、CTAB分子による表面修飾により水中でのAgNPの安定性が向上することが確認されました。

TEM測定により、Ag NPは丸みを帯びた形状であり、その大部分は10〜12 nmのサイズであることが明らかになりました（図1d）。

Staphylococcus aureus のメチシリン耐性菌に対するその場で調製されたキトサン/ AgNPソリューションの抗菌活性

100％MRSAに対する純粋なAgNPおよびAg / CTABNPのMICは9.6μg/ mlでした。最も低い濃度では、活動が少ないことが示されています（表2）。キトサン溶液は、MRSAの100％臨床株に対して、MIC6μg/ mlで抗菌活性を示します。その中で、菌株の60％はMIC3.3と5μg/ mlキトサン溶液を持っていました。

MRSAに対するキトサン-AgNPs溶液の阻害効果を図2aに示します。キトサン-AgNPs溶液は、純粋な形態と比較して優れた抗菌効果を示すことがわかりました。同時に、キトサン-Ag NPs / CTAB溶液（キトサン6.0μg/ ml、Ag / CTAB NPs）のその場での調製は、成分の沈殿のために不可能でした：灰黒色環の凝集の形成とコンポーネントを2つのフェーズに分けます。この場合、抗菌活性は評価できませんでした。キトサンとCTABの混合による予期しない結果と、Ag NPs-CTABの最も低い抗菌活性（図2bを参照）を考慮して、CTABによるAgNPsの表面修飾は有望ではないと結論付けました。 Ag NP表面にCTAB分子が存在すると、水分散液の安定性が向上しましたが、抗菌活性が大幅に低下し、溶液が沈殿しました。

治療後のMRSAの感受性株の割合。キトサン-AgNPsソリューション（ a ）およびキトサン-AgNPs-CTAB溶液（ b ）。 3.3、5、および6μg/ ml-これらは溶液中のキトサンの濃度です

ディスカッション

毒性とは、ナノ粒子とその塩への曝露中に生物に有害な影響を与えることを指します。目的が特定の生物を滅菌または消毒することである場合、毒性は肯定的な結果（抗菌、抗ウイルス）として解釈される可能性があります[15]。ナノテクノロジーにおける現在の基本的な必要性は、金属ナノ粒子を合成するための環境に優しく信頼できる方法の開発です。危険で有毒な溶媒の存在を回避するために、銀ナノ粒子を生成するための天然で低コストで環境に優しい材料である生物学的還元剤の使用を確認しました[37]。哺乳動物細胞に対する細胞毒性のため、治療薬としてのAgNPの使用は制限されています。 Ag NPのサイズ、形状、安定性、濃度など、いくつかの要因が微生物に対するAgNPの効果に影響を与える可能性があります[4]。

私たちの調査では、5〜18nmのサイズのAgNPを取得しました。これは、Ag NPの光学的[39]、抗菌性[27]、および抗ウイルス性[21]に影響を与える最も基本的なパラメーターの1つです。粒子が小さいほど、抗菌活性が高くなります。一部の研究では、10 nmを超えるNPが細胞表面に蓄積し、細胞の透過性を損なうことが明らかになりました。ただし、10 nm未満のNPは細菌に浸透し、DNAや酵素に影響を与えて細胞死を引き起こします[14]。結果の大部分は、粒子サイズが小さくなると毒性の仮説が増加することを証明しましたが、小さいNPは毒性が低いか、サイズに依存する毒性がないことを示す実験データもあります[15]。サイズの範囲が3〜100nmのAgNPの抗菌活性を示した多くの研究があります[19]。

前述のように、合成されたAgNPの安定性と抗菌特性に対するキトサンの影響を評価しました。感受性試験の前に、合成されたナノ粒子は、それらの純度を決定するために特性評価のさまざまな方法にかけられました。私たちの調査によると、9.6μg/ mlの濃度のAgNPは100％のMRSA菌株に対して有効であり、CTABはAgNPの有効性を増加させませんでした。

キトサンは広域スペクトルのバクテリアに対して顕著な抗菌活性を持っていることが知られています[2]。それにもかかわらず、いくつかの報告は、純粋なキトサンが重度の感染を予防しないことを示しています[3]。抗菌特性が改善されたキトサンと銀のさまざまな組み合わせを報告している出版物がいくつかあります[11]。銀キトサンナノコンポジットは、生物医学工学および食品包装用途および創傷被覆材用途のコーティングとして提案されました[2、3]。しかし、MRSAに対するキトサン-AgNPs溶液の抗菌効果に関するデータは限られています[34]。私たちのデータは、キトサン溶液にAg NPを単純に混合すると、両方の成分の抗菌活性を高めることができることを示しています。調査したすべての物質の抗菌活性が増加します。キトサンのMICは3.3μg/ mlであり、純粋なAg NPMICおよびCTABMICを含むAgNPは、それぞれ1.2および2.4μg/ mlでした。カウルら。 （2013）は、 S に対する銀/キトサンナノコンポジットの抗菌活性も報告しました。 。 アウレウス 、同様の結果を示した[36]が、MICを決定しなかった。この発見は、キトサン-Ag NPs溶液の有効性を示していますが、抗菌剤としてのCTABの利点は見られませんでした。それどころか、別の研究では、CTABで安定化されたAgNPが S に対して顕著な抗菌効果を示したことが示されました。 。 アウレウス および Escherichia coli 。おそらく、私たちの実験では、キトサンはバクテリア細胞に対するAgNPの効果を減少させるCTABとリンクしています。

結論

この研究では、患者から分離されたMRSAに対して、異なる成分比でinsituで調製されたキトサン-AgNP溶液の活性をテストしました。私たちの結果は、キトサン溶液とAg NPを単純に混合すると、物質の最小発育阻止濃度がそれぞれ2倍と4倍（3.3と1.2μg/ ml）に減少することを示しました。この結果は非常に有望であり、薬剤耐性菌と戦うための効果的な解決策と見なすことができます。それはまた、個別化医療への方向への進歩でもあります。キトサン-AgNPs溶液の将来の細胞毒性研究は、臨床使用に適した用量についての答えを与えるでしょう。

略語

Ag NP：

銀ナノ粒子

ARI：

急性呼吸器感染症

CTAB：

臭化セトリモニウム

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

MRSA：

M 黄色ブドウ球菌のエチシリン耐性株

TEM：

透過型電子顕微鏡

UV–Vis：

紫外可視分光法

XRD：

X線回折