Escherichia coliに対する酸化銅ナノ粒子の生体合成、特性評価、および抗菌力の評価

はじめに

土着のハーブとスパイシーな植物には、人間と獣医の治療に使用される貴重な抗酸化作用と抗菌作用があります[1]。抗菌性のある薬用植物には、ニンニク、ショウガ、ニーム、ターメリック、トゥルシーなどがあり、その中でもニンニクとショウガは薬用として有名です[2]。 Zingiber officinale 一般的にショウガとして知られているのは、ショウガ科に属する固有の植物の根です。重要な植物化学物質として、ジンゲロール、ショウガオール、クルクミン、パラドールが含まれています[3]。広範囲の微生物に対する抗菌活性は、治療的性質のフェノール含有量のために、ショウガの水性抽出物によって明らかにされています[4]。 Allium sativum 一般にニンニクとして知られているものには、MDR菌に対しても広域スペクトルの抗菌活性を示すフェノール化合物が含まれています[5]。 Allium sativum 多数のグラム陽性菌およびさまざまなグラム陰性菌に対して広域スペクトルの抗菌活性を示しました[6]。

分子レベルおよび原子レベルでのナノテクノロジーの知識を活用することは、広範囲のアプリケーションで使用するための独自の機能を備えた新規化合物を開発するための統合的アプローチを適用するための基礎として役立ちます[7]。比類のない固有の特性によるナノ粒子の薬用、農業、食品保存および化粧品への応用は、研究者による探索の増加につながりました[8、9]。潜在的な抗菌剤、効果的な治療用化合物、薬物送達担体、光触媒、ガス検知、光起電力安定性、量子閉じ込め効果、生物学的プローブなど、酸化銅ナノ粒子のさまざまな生物学的用途が成功裏に実証されています[10、11、12、13、14]。活性酸素種（ROS）の生成は、その半導体の性質によりナノ粒子によって引き起こされ、細胞レベルで酸化的および変性的変換をもたらし、細菌の細胞壁の破壊と細胞内容物の放出をもたらします[15]。ナノ粒子の合成、すなわち化学的、物理的および生物学的合成のために多くの方法が実践されてきた[16]。金属化合物を還元すると、生化学物質や微生物、植物、またはそれらの抽出物を使用してナノ粒子が生成されます[17]。

大腸菌 （ E.coli ）、腸の自然の住民であり、腸内細菌叢の一部であるが、その潜在的な毒性のために微生物学の世界で独特の位置を占めている[18]。病原性の存在は、 Eの遺伝子の数に依存します。コリ 分離株、場合によっては耐性遺伝子の水平伝播も明らかにされており[19、20]、これは人間、動物[21]に健康上の懸念を引き起こし、食品の安全性と安全性への挑戦[22]を引き起こす可能性があります。 E。コリ 乳牛および水牛の乳房炎の原因物質であり、乳量の大幅な低下とその結果としての経済的損失の原因であることが判明し[23、24]、耐性遺伝子、すなわち拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ（ESBL）または過剰な発現したセファロスポリナーゼ（AmpC）[25]。 Eに関連する治療の失敗。コリ 感染症は、人間医学と動物医学の両方で多剤耐性につながる潜在的な脅威と見なされています[26]。

特徴的な抗菌機能を備えたナノ粒子は、感染性の少数の疾患のみを治療する抗生物質の能力とは対照的に、約600個の細胞を殺す可能性があります[27]。現在の研究は、緑色の化学合成されたCuOナノ粒子と、 Allium sativum の一般的なハーブの根の抽出物の抗菌力の可能性を調査、評価、比較することを目的としています。 （AS）および Zingiber officinale （ZO）、病原性 Eに対して。コリ 新たな耐性の課題を克服するための抗生物質の代替品として。

メソッド

現在の研究は、 Allium sativum のハーブの根に対する植物化学的に還元されたCuONPの殺菌作用を調査することを目的としていました。 （AS）および Zingiber officinale （ZO）、ウシ乳房炎の分離株。

資料

化学的に製造されたCuOのナノ粒子はSigma-Aldrichから調達されましたが、ZOとASの根は、パキスタンのラホールの地元の果物と野菜の市場から購入されました。 ZOとASの根を日陰で乾かし、重量を均一にしました。 Eの増殖培地。コリ 分析グレードの化学物質は変更なしで使用されました。

ZOおよびASルートの水性抽出

ZOとASの乾燥した根を超微粉砕して微粉末にし、気密ジャーに保管しました。微粉末の根を蒸留水と混合するために、70°Cで30分間の強力な攪拌-DIWを1:10の比率で実施しました。調製した溶液のろ過は、溶液を冷却した後、ワットマン濾紙No. 1を使用して行い、濾液の保管は、図1aに示すように次の実験[28]のために4°Cで行いました。

a の概要 Zingiber officinale の水抽出 および Allium sativum 根、 b CuONPのグリーン合成

CuOのグリーン合成

硝酸第二銅四水和物（0.1 M）をさまざまな濃度、つまり3 mL、6 mL、12mLのZOおよびAS抽出物と連続的に攪拌しながらブレンドしました。沈殿物を形成するために、NaOH（2 M）を使用して、攪拌した溶液のpH12を90°Cで2時間維持しました。沈殿物の遠心分離は10,000rpmで20分間行い、続いてDI水で洗浄し、図1bに示すように90°Cの熱風オーブンで一晩乾燥させました[29]。

特性評価

紫外可視GENESYS-10S分光光度計を使用して、200〜500nmの波長範囲でCuOナノ粒子とZOおよびASの水性抽出物の吸収スペクトルをチェックしました[30]。 CuO NPの構造および位相分析は、2 θのX線回折（XRD）BRUKER D2Phaserを使用して実行されました。 =（10°–80°）λのCuKα放射を装備 =1.540Å[31]。フーリエ変換赤外分光法（ATR-FTIR）は、CuONPおよびZOとASの水性抽出物の官能基の分析のために実行されました[31]。 CuO NPの元素および形態学的構成を観察するために、EDS検出器と組み合わせた走査型電子顕微鏡（JSM-6610LV SEM）を実施しました。高分解能TEM画像とSAEDパターンは、JEOLJEM-2100F顕微鏡を使用して撮影されました[32]。

E。コリ 分離と識別

サンプルのコレクション

臨床型乳房炎に苦しむ牛と水牛は、牛乳サンプルの収集のためにさまざまな畜産農場から追跡され、特定されました。

E。コリ 分離

マッコンキー寒天培地は、 Eの精製コロニーを分離するために、ミルクのストリークと培養に3回使用されました。コリ [33]。 Eの特徴的なコロニーのディスク拡散。コリ Eを分離するための国立臨床検査基準委員会（NCCLS）のガイドラインに従って、特定の抗生物質に対する感受性をチェックするために評価されました。コリ 。

Eの識別。コリ

Eの識別と確認。コリ コロニーはグラム染色に基づいて実施されました。形態学的特徴と生化学的検査、すなわち、Bergey's Manual of SystematicBacteriologyの観点からのメチルレッドとカタラーゼ検査の区別。エオシンメチレンブルー（EMB）寒天培地での分離株の培養を Eのために行った。コリ 関連するグラム陰性菌との区別と批准。

Eに対するinvitro抗菌能のCuONPの評価。コリ

invitro を評価するために、いくつかの実験が行われました。 病原性 Eに対する抽出物をドープしたCuONPの抗菌力。コリ 。 invitro 試験は、10の代表的な病原性 Eを使用して実施されました。コリ CuONPの抗菌力を評価するための分離株。ディスク拡散法の評価は、 invitro を評価するために使用されました 抗菌力。 Eの活性化成長でペトリ皿を拭いた。コリ 1.5× 108 CFU / mL（0.5 マクファーランド 標準）マッコンキー寒天培地[34]。滅菌コルクボーラーを使用して、ペトリ皿に直径6mmのウェルを準備しました。 ZOおよびASの水抽出物、 緑色にドープされた抽出物および化学的に合成されたさまざまな濃度の酸化銅ナノ粒子とともに、ウェルに適用されました。 ZOおよびASの水性抽出物と、グリーンドープ抽出物および化学的に合成された酸化銅ナノ粒子の抗菌力は、ノギスを使用して阻害ゾーン（mm）を測定することにより、ペトリ皿を37°Cで一晩好気的にインキュベートすることによって評価されました。一元配置分散分析と視覚化（ p ）を使用して、抑制ゾーン（mm）の統計分析を実行しました。 <0.05）。

結果と考察

図2a、bに示すように、ドープされたCuO NPとZOおよびASの水性抽出物のUV-Vis分光法を実行して、光学的挙動を調査しました。その後のCuONPの形成では、ワインから石炭黒への段階的な色の変化に気づき、アーチ型の音響抽出物による合成NPの最適化が行われました。水性抽出物のZOおよびAS吸収ピークは、275および280nmで観察されました。描かれた結果λ _max 250 nmでZOおよびASをドープしたCuOの場合、それぞれ特徴的な赤方偏移と青方偏移を伴う6 mL：1の比率を示します[35]。広いピークは、粒子クラスターと、強い吸収帯によって明らかにされたCuO中の濃縮抽出物による価電子帯から伝導帯への電子の遷移を指定しました[36]。緑で合成されたCuONPでは、最適化された値（6 mL：1）に加えて、抽出物の量を増減することで吸収の低下が見られました。

a をドープしたCuONPの吸収スペクトル ZO b AS抽出およびPLスペクトル c を使用したCuONP ZOと d AS抽出物それぞれ

さらに、半導体構造が既存のナノメートル量子サイズ効果に対する物理的特徴を確認したことを観察することは注目に値しました。 300nmの励起UV波長を持つZOおよびASドープCuONPのPLスペクトルを図2c、dに示します。 418、561、および664 nmの3つの発光ピークは、CuO（UV領域）の純粋でドープされた各PLグラフで表されました[37]。 418 nmに見られる紫青の光バンドは、バンドの近くの端にある標準的なCuO発光ピークです[38、39]。 430 nmでは、ショルダーエッジはp型半導体であるCuO空孔が原因である可能性があります。黄緑色のエッジは、561nmの低温下での深さの欠陥の原因です。 664 nmの赤色発光ピークは、さまざまな銅の状態または個々のイオン化酸素空孔の存在の原因です[40、41]。紫-青、黄-緑、赤のスペクトルに目に見える発光が多様に存在することは、研究対象のCuO粒子が表面積対体積比が高く、表面積対体積の状態と欠陥（空孔または格子間原子）が多数あることを示しています。トラップから放出までの範囲[40、42]。

XRDを実行して、図3a、dにそれぞれZOとASをドープしたCuO NPの結晶構造、組成、スケールを評価しました。結晶化度の増加は、2 θで検出されたピークによって示されました。 =38.7°、48.6°、53.5°、58.3°、61.7°、66.2°、それぞれ対応する結晶面（111）、（-202）、（020）、（202）、（-113）、（022）。検出されたピークは、JCPDSカード番号：00–002–1040 [43]と同期して、CuO単斜晶相の存在を保証しました。 D を使用して測定された特徴的な結晶子サイズ =0.9 λ / β cos θ ZOおよびASをドープしたCuOではそれぞれ24.7および47.6nmであることがわかり、元のサンプルの結晶子サイズは27.4nmでした。 ASおよびZO抽出物の平均結晶子サイズのキャッピングおよび還元剤として、いくつかの天然物が特定されています[44]。

a のドーピングなしとドーピングありのCuONPのXRDパターン AS b ZO

ASおよびZO抽出物をドープしたCuONPの官能基を、それぞれ図4a、bに示すようにFTIRで調べました。 3314 cm ^-1 の広いピーク ヒドロキシル基の存在を承認し、ピーク幅は（N–H）アミンによる直接C =Oを表します[45]。 1638 cm ^-1 の強いピーク CH ₂ に対応 –OCH ₃ ZOの6-snogalおよび6-gingerolに存在するグループは、CuOの大幅な減少が見られました。 478.8 cm ^-1 で見られるCu–Oの典型的な単結合 ねじれの形での振動の強いモードによるものでした[46]。すべてのピークは、アルコール、アミン、およびケトン基がフラボノイド、植物化学物質、およびタンパク質のキレート化とキャッピングをもたらしたことを示唆しています[47]。

a のFTIRスペクトル AS b ZOドープCuONP

図5a–d 'に示すように、FE-SEMを使用して、ZOおよびAS抽出物をドープしたCuONPの表面特性とスケールを研究しました。 FE-SEM画像は、CuONPが球状の形態で非常に凝集していることを示しています。磁気干渉と粒子間のポリマーの適合性は、粒子間の凝集を示す可能性があります[48]。 CuOによるZOおよびASのドーピングは、クラスター形成を示す画像から明らかであり、図5b–d 'に示すように粒子サイズは<1μmのようです。

FESEM a で撮影されたCuONPの画像 CuO、 b – d ZOドープCuOおよび b ' – d ' ASをドープしたCuONP、それぞれ

エネルギー分散型X線分光法（EDS）は、図6a〜d 'に示すように、未処理のサンプルと、ZOおよびASルート抽出物をドープしたCuONPの元素調査による化学組成を示しています。 1〜10keVの前駆体酸素と比較してテストされたサンプルのEDSによって確認されたCuの高純度に対応する3つのピーク。 CuO NPの表面プラズモン共鳴（SPR）は、吸収ピークをもたらしました[49]。対照サンプルのCu、O、Caのスペクトルでは、原子量がそれぞれ83.7％、15.2％、0.6％でしたが、ZOをドープして最適化したサンプル（6 mL：1）では82.8％、14.8％、2.4％でした。それぞれCu、O、Znのスペクトルを通して観察されます。同様に、ASをドーピングしたCu、O、Sについては、それぞれ65.3、29.6、4.6が見つかりました。 EDSに現れる補足的な原子化合物は、分析中に使用されたSEMサンプルホルダーに応答しました[50]。

CuONPのEDSスペクトル a 純粋なCuO b – d ZOドープCuOおよび b ' – d ' ASをドープしたCuONP、それぞれ

図7a–lに示すように、CuO NPの排他的で特徴的な構造は、50nmでHR-TEMを使用してさらに評価されました。 HR-TEM写真は、FE-SEM画像に似た装飾されたナノ粒子と、50nm未満のサイズでより高い凝集を示しました。 ZOおよびASをドープしたCuONPに植物化学物質が存在することも、HR-TEM画像で確認されました[51]。 ZOおよびASをドープしたCuONPの積分格子構造には欠陥も変形も観察されませんでした[52]。フィルタリングされた顕微鏡写真は、HR-TEMの結果と、図7b、d、f、h、j、lの黄色い四角で示された特定の領域の高速フーリエ変換[FFT]によって示され、高分解能の構造的および原子的特性を示しています。 HR-TEMの平均粒子寸法は、XRDおよびSEM分析中に観察された結晶子サイズと正確に一致しています[53]。

a 、 b HR-TEM、 a – f 3 mL、6 mL、および12mLのZOドープCuOの格子縞 g – l それぞれ3mL、6 mL、12 mLのASドープCuONPの格子縞

C 1 s を表すGiおよびGaCAEをドープしたCuOのXPS分析 およびCu2 p スペクトルを図8a、bに示します。 C1 s 範囲は、C（H、C）（284.39 eV）、C（N）（285.6 eV）、C（O、=N）（287.0 eV）、C–Oなどの特徴的な官能基を持つ4つの異なるピークの存在を示しています。 –C（288.75 eV）[54,55,56]。主に、図8bはCu 2 p を示しています。 Cu 2 p に対応する933.3および953.3eVの結合エネルギーにピークを持つドープされたCuOのパターン _3/2 およびCu2 p _1/2 スピン軌道相互作用は、調製したサンプルの二価酸化状態を示します。 942.2および962eVの関連するピークは、Cu 2 p の衛星ピークに関連しています。 _3/2 およびCu2 p _1/2 これは主に3 d が部分的に埋められたためと思われます ⁹ 二価酸化状態の軌道[57]。

a 、 b ドープされたCuONPのXPS分析 a C1s b Cu 2p

図9a〜d、追加ファイル1：図S1および表1に表にまとめました。調査結果は、NP濃度と阻害ゾーンが相乗的に反応することを明らかにしました。サンプル1（3 mL：1）、サンプル2（6 mL：1）、およびサンプル3（12 mL：1）で検出された有意な阻害ゾーンは、減少した（↓​​）を使用して（1.05–1.85 mm）および（1.85–2.30 mm）でした。 ZOドープCuOナノ粒子（ p ）の濃度の増加（↑） <0.05）、図9a。同様に、ASをドープしたNPは、最大濃度でのみ（0.65〜1.00 mm）阻害ゾーンを示しました（図9b）。 ASをドープしたNPは、病原性 Eに対してゼロの有効性を示しました。コリ 最小濃度で。 ZO抽出物は、1.55 mmゾーンを示す増加（↑）濃度と比較して減少（↓）濃度での効果を示しました。同様に、減少（↓）および増加（↑）濃度の両方でAS抽出物の抗菌効果は見つかりませんでした。シプロフロキサシンで治療された対照陽性は4.25mmのゾーンを示し、DIWで治療された対照陰性は0mmを示しました。殺菌効果の％ageは、最小濃度と最大濃度のZOドープNPでそれぞれ24.7％から43.5％と43.5–54.1％に上昇しました（図9c）。同様に、15.3〜23.5％の有効性は、ASをドープしたNPに対してのみ最大濃度で得られました（図9d）。要約すると、ZO抽出物をドープし、6 mL：1で最適化されたCuOは、病原性 Eに対してより高い殺菌力を示しました。コリ 牛乳腺炎由来（ p <0.05）図9a、bに示すように。

a – d CuONPのinvitro抗菌活性 a ↓および↑線量でZOをドープ、 b それぞれ↓および↑用量でASをドープ c ZOと d をドープした有効性％age ASをドープした有効性％age

ナノ粒子の殺菌力は、NPのサイズ、形態学的構造、および表面と質量の比率に依存します。活性酸素種（ROS）は、CuOナノ粒子による抑制ゾーンの形成に関与していると考えられています[58、59]。細胞タンパク質の変性は、有害な活性酸素種（ROS）の生成によって生じました[60]。ヒドロキシルラジカルやスーパーオキシドラジカル、正孔など、いくつかの反応種は光触媒作用において重要な役割を果たしました[61]。活性酸素種（ROS）の合成と金属イオンの放出は、酵素とタンパク質の構造変化を示す主要な特徴であり、その結果、DNAに修復不可能な損傷を与え、その後細菌を死に至らしめます[62]。同様に、活性酸素種（ROS）によって生成される酸化ストレスは、光触媒作用の主な原因であると考えられています[63]。 ROSの生成は、ナノ粒子のサイズに反比例します。つまり、NPのサイズが小さいほど、ROSの生成が高くなり、その結果、細菌の膜が損傷し、細胞質の内容物が押し出され、DNAが分解されて、図10に示すように細菌が破裂します。同時に、正に帯電したCuは、負に帯電した細菌膜と静電的に相互作用し、細胞を崩壊させ、最終的に細菌を破壊します[58、64、65]。ナノ構造の殺菌メカニズムの可能性として、2つの応答が提案されています。 1つは、陽イオンCu ²⁺ 間のより良い結合を含みます。 細菌細胞は、陰性化された切片の形成と最終的な崩壊につながります。もう1つは、励起によるCuOバランスバンド表面の電子励起です。さらに、電気的O ₂ 反応によりO ^2- が生成されます ラジカル、H ₂ の形成につながる O ₂ 。生成されたO ^2- 種は、細菌の外部細胞膜上の脂質またはタンパク質分子の分解に不可欠です[58、66]。

CuONPの殺菌作用の図解

結論

Zingiber officinale をドープしたCuONPの殺菌力 および Allium sativum 病原性 Eに対する抽出物。コリ この研究では、代替の経済的で効果的な抗菌剤を目的として製造されたものが評価されました。 ZOおよびAS抽出物の植物化学成分の重要な役割は、CuO NPの生体合成で明らかになりましたが、フラボノイドとCuOの相乗効果は、病原性 Eに対する殺菌力を利用して濃度依存性であることがわかりました。コリ 。 ZOおよびAS抽出物のドーピングを確認するためにFTIRを実行し、XRDピークにより、平均サイズが24.7 nm（ZOドープ）および47.6 nm（ASドープ）の単斜晶相および球状構造が確認されました。球状の形態は、CuONPの法外な集合体とともにFESEM画像で確認されました。装飾されたナノ粒子は、50nm未満のサイズのTEM画像でより高い凝集を示しました。ルート抽出物をドープしたサンプルの場合、0.23nmと測定されたCuOナノ粒子の層間間隔はXRDパターンと互換性があることがわかりました。この研究の結果は、グリーン合成されたCuO NPの抗菌力が、抗生物質耐性と残留物に関連する懸念を是正するための代替殺菌剤として期待される可能性があることを示唆しています。固有のハーブをドープしたCuONPは、経済的で効果的で自然に優しい抗菌剤であると結論付けることができます。

データと資料の可用性

すべてのデータは制限なしで完全に利用可能です。

略語

EDS：

エネルギー分散型X線分光法

fcc：

面心立方

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

G + ve：

グラム陽性

G −ve：

グラム陰性菌

JCPDS：

粉末回折標準に関する合同委員会

CuO：

酸化銅

nm：

ナノメートル