抗菌剤として銀ナノ粒子で装飾された酸化グラフェンベースのナノコンポジット

背景

抗生物質の開発は、細菌感染の数を制御する上で重要な役割を果たしてきました。しかし、抗生物質の不適切な使用と乱用は、多くの細菌種で多剤耐性の発生をもたらしました。一部の菌株は、ベータラクタム系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質など、一般的に入手可能なすべての薬剤に耐性を示しています[1]。主な耐性病原体は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌です。 、バンコマイシン耐性エンテロコッカス 、および拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ産生 Klebsiella pneumoniae および Escherichia coli [2、3]。非常に大きな集団と速い増殖時間を持つ細菌は、細菌集団のサブセットが抗生物質治療を生き延びたときに、抗生物質耐性のメカニズムを急速に発達させることができます。さらに、抗生物質耐性菌は、他の遠縁の細菌に対する耐性のメカニズムをコードするDNAのコピーを転送することができ、その後、耐性遺伝子を次の世代に受け継ぐことができます。したがって、抗生物質耐性菌の出現は、新しい抗菌剤の開発によって克服できる深刻な問題を表しています。抗菌剤は、繊維産業、水の消毒、薬、および食品包装において非常に重要です。抗生物質の代わりにナノ粒子とナノ材料を使用することができます[4]。ナノ粒子の抗菌活性のメカニズムは、ナノ粒子の種類によって異なります。提案されたメカニズムのいくつかはナノ粒子の物理化学的構造に関連していますが、他のメカニズムはナノ粒子表面からの抗菌イオンの放出の増加に関連しています。微生物に対する複数の同時作用メカニズムは、耐性の発生のために同じ微生物細胞内でのさまざまな同期DNA突然変異を必要とします。したがって、細菌細胞がナノ粒子やナノ材料に耐性を持つようになることは困難です。銀、銅、フラーレン、単層カーボンナノチューブなどの抗菌性ナノ材料は、その独特の物理化学的特性と高表面積により、いくつかの利点を提供する可能性があります[5、6、7、8]。さまざまな細菌に対するナノ粒子（NP）の毒性の正確なメカニズムは、完全には理解されていません。現在の研究によると、NPの抗菌効果の根底にある主なプロセスは、細菌細胞膜の破壊、金属イオンの放出、ROSの生成、細菌細胞膜の浸透、およびDNAとの相互作用を含む細胞内抗菌効果の誘導です。タンパク質[9、10]。 NPは、静電相互作用によって細菌の膜に付着し、細菌の膜の完全性を破壊することができます。 NPの表面の正電荷は接着に不可欠です。正電荷は、NPと微生物の負に帯電した細胞膜との間の静電的付加を可能にします[11]。細菌細胞の表面に存在する硫黄含有タンパク質とNP間の静電接続は、細胞壁構造に不可逆的な変化を引き起こし、細胞壁と膜の損傷をもたらします[12]。細菌の膜は、細胞の恒常性と代謝エネルギーの伝達に選択的な透過性を提供するため、細胞の代謝状態に関係なく重要です。 NPの2番目の抗菌および抗真菌活性は、ROSおよびフリーラジカル種を生成する能力によるものです[13]。 ROSのレベルの上昇は、脂質、タンパク質、およびDNAの過酸化を誘発しました[14]。

さらに、多くの種類のNPの構造は、抗菌剤の運搬に適しています[15、16]。キャリアは、標的細菌による耐性から薬剤を保護するのに役立ちます。ナノ粒子ベースのドラッグデリバリーシステムは、抗生物質を感染部位に標的化するのに役立ち、それによって全身性の副作用を最小限に抑えることができます。その他の利点には、疎水性薬物の溶解性の向上、体循環時間と薬物半減期の延長、および薬物放出の持続が含まれます[4]。

最近、炭素の新しい同素体であるグラフェンが抗菌活性を持っていることが実証されました。グラフェンは、六角形の繰り返しパターンで結合された炭素原子でできた材料です。グラフェンフレークのユニークな特徴は、表面に対するその厚さの比率です。グラフェンの表面は電子雲で覆われています。これにより、おそらくこの材料が電子供与体になりやすくなり、特別な結合を形成できるようになります。グラフェンのエッジには他の結合（ダイヤモンドsp3タイプの結合に特徴的）があり、これらの場所は異なる物理化学的特性を持っている可能性があります[17]。これらの特性は、グラフェンが細菌細胞を含むさまざまな細胞間構造への塑性接着にさらされる可能性があることを示唆しています[18、19、20]。さらに、2つのアクティブな側面（表面とエッジ）があるため、グラフェンはそのエッジに生体分子を付着させ、細胞表面に付着させることができます。酸化型のグラフェンである酸化グラフェン（GO）は、酸素官能基が存在するため、水やその他の有機溶媒に容易に分散します。酸素化された基は、共有および非共有相互作用を介してGOシートの簡単な化学的機能化を可能にします。 GOの強力な抗菌作用が報告されています。 GOの抗菌活性は、酸化グラフェンナノシートの鋭いエッジによって引き起こされる膜応力に割り当てられており、細胞膜に物理的損傷を与え、細菌膜の完全性を失う可能性があります[21]。最近、グラフェンで官能化された抗菌ナノ粒子が有望な抗菌材料として使用されています[22、23]。ナノコンポジットは、個々のコンポーネントの制限を克服することができます。たとえば、グラフェン基板に付着した抗菌性ナノ材料は、より安定しており、十分に分散しています[24]。これらのナノコンポジットには、金属、金属酸化物、およびポリマーが含まれている可能性があります。

薬剤耐性菌に対する最も有望な方法の1つは、殺生物性ナノ粒子を使用した表面修飾材料です。超音波技術は、さまざまな材料を抗菌性および殺菌性の物質でコーティングする効果的な方法として確認されています[25、26、27、28]。多くの研究者は、超音波法を「グリーンテクノロジー」として分類しています[29、30]。この方法は、液体媒体中のキャビテーション気泡の形成、成長、崩壊であるキャビテーション現象の使用に基づいています[31、32]。爆縮する気泡は、5000 Kまでのミクロ地域で膨大な量のエネルギーを生成し、短時間で2000 atmまでの圧力を発生させます[33、34]。その結果、固体表面に向けられた衝撃波といわゆるマイクロジェットが生成されます[35]。液体媒体内にあるNPは、爆発効果によって駆動され、固体表面上で高速（> 100 m / s）のジェット気流によって層を形成します[36]。音響キャビテーションは、超音波処理された物体の物理的特性の変化にもつながる可能性があります。たとえば、GOフレークのサイズ変更などです[37、38] 。

Salmonella enterica を使用した以前の研究で、有望な結果を達成しました。 およびリステリア菌 手付かずのグラフェン、GO、および還元GOで処理されています[20]。さまざまな種類のグラフェンの中で、GOは低濃度で最高の抗菌活性を持っていることもわかりました。細菌細胞はGOの表面全体に分布していた。この研究では、銀ナノ粒子（GO-Ag）で装飾されたGOは、裸のGOまたは銀ナノ粒子（Ag-NP）よりも微生物細胞に強い毒性影響を与えると仮定しました。 2つのアクティブな側面（表面とエッジ）があるため、GO酸化物はAg-NPをエッジに付着させ、細胞表面に付着させることができます。グラフェンベースのナノコンポジットの抗菌活性は、細胞膜の破壊と酸化ストレスが原因である可能性があります。この研究の目的は、グラム陰性菌（ Escherichia coli ）を使用した裸のGOおよびAg-NPと比較して、Ag-NPで装飾されたGOベースのナノコンポジットの抗菌活性を評価することでした。 ）、グラム陽性菌（黄色ブドウ球菌 および表皮ブドウ球菌 ）、および病原性酵母（カンジダアルビカンス ）invitroモデルを使用します。調査は、X線回折、ラマン分光透過、FT-IR、電子顕微鏡（TEM）、走査型電子顕微鏡（SEM）、原子力顕微鏡（AFM）を使用したナノ複合材料の構造分析、微生物細胞形態の評価、 PrestoBlue™アッセイによる細胞生存率、乳酸塩デヒドロゲナーゼアッセイ（LDH）による細胞膜の完全性の調査、および反応性酸素種（ROS）産生の評価。

メソッド

酸化グラフェンの合成、修飾、および特性評価

この研究では、市販のグラファイト粉末（Acros Organics、ニュージャージー、米国）を修正Hummers法によって酸化しました[39]。 10グラムのグラファイト粉末を230mLの濃硫酸（98％）と10°C未満で混合しました。次に、4.7gの硝酸ナトリウムと30gの過マンガン酸カリウムを、温度を10°C未満に維持しながら、硫酸とグラファイトの混合物に徐々に加えました。次に、混合物を30℃に加熱し、2時間撹拌しました。次のステップでは、100 mLの水を追加し、混合物の温度が約100°Cに達しました。最後に、混合物を10mLの過酸化水素で処理しました。精製のために、スラリーを濾過し、濾液のpHが6.5に達するまで脱イオン水で洗浄した。

GOのX線回折パターンは、X線粉末回折計（ CuK ）を使用して、0.02°のステップで10°から100°までの2シータ角度の範囲内で室温で収集されました。 _α1 ）（X’Pert PRO、PANalytical、アルメロ、オランダ）。

GOの炭素、水素、窒素、硫黄含有量の重量分析は、Elementar Analysensysteme GmbH（Langenselbold、ドイツ）製のVario ELIII装置を使用して実施しました。 GOの化学分析の測定を実行する前に、サンプルを脱着ステーション（VcPrep 061、Micromeritics、米国ジョージア州ノークロス）で50°Cの真空（0.05 mbar）下で24時間脱着しました。酸素含有量は、100％重量から炭素、水素、窒素、硫黄の測定された含有量を差し引くことによって計算されました。

ラマン分光法は、inViaラマン顕微鏡（レニショー、英国）を使用して実行されました。酸化グラフェンは、初期出力の5％の514nmレーザー波長で分析されました。スペクトルは、サンプル上の5つの異なるスポットから収集されました。露出時間は10秒で、2回のスキャンが収集されました。

FT-IR測定は、Nicolet iS10分光計（Thermo Fisher Scientific、USA）を使用して、ダイヤモンド結晶の減衰全反射モードで実行されました。ダイヤモンド結晶の表面に5マイクロリットルの酸化グラフェン水懸濁液を滴下し、乾燥させた。乾燥後、400〜4000 cm ^-1 の範囲でスペクトルを収集しました。 。

平均粒子サイズとゼータ電位の測定は、Malvern Instruments Ltd.（Malvern、UK）が製造したZetasizer Nano-ZS ZEN 3600を使用して、動的光散乱（DLS）モードとレーザードップラー電気泳動をそれぞれ室温（23°）で使用して行いました。 C）。

ナノマテリアルのTEM / SEM / AFM分析

粉末と箔の形態は、透過型電子顕微鏡（TEM; JEM-1220 JEOL、東京、日本、加速電圧80 kV）と走査型電子顕微鏡（SEM; Zeiss、Ultra Plus、オーバーコッヘン、ドイツ）を使用して決定しました。 TEM観察用のサンプルは、ハイドロコロイドの液滴をTEMグリッド（3 mm 200メッシュCuグリッド上のFormvar、Agar Scientific、スタンステッド、英国）に配置することによって準備されました。液滴を風乾した直後に、グリッドを顕微鏡に挿入しました。

SEM分析では、スパッタコーター（SCD 005 / CEA 035、BAL-TEC、スイス、プフェフィコーン）を使用してサンプルを薄い炭素層でコーティングしました。内部実験室測定手順が適用されました（P5.10、2015年8月26日のエディション6）。

AFM（原子間力顕微鏡）イメージングは​​、Asylum Research MFP3D Bioソフトウェア（バージョン：Asylum Research MFP3D 15.106.09）を使用して実行されました。表面トポグラフィーイメージングとテストされたフォイル表面のGOの検出は、位相差イメージング用のACモードとGO検出用の横力顕微鏡（LFM）の2つのイメージングモードを使用して実行されました。これは、GOが摩擦力を低減するためです[40] 。

GOおよびAg-NPでコーティングされたポリウレタンフォイルの準備

ポリウレタン箔を覆うために、Ag-NP（HydroSilver1000、Amepox、ウッチ、ポーランド）とGOの懸濁液が使用されました。 GO、Ag-NP、およびGO-Ag（GO（200μg/ mL）、Ag-NP（100μg/ mL）、GO（200μg/ mL）+ Ag-NP（100μg/ mL））の懸濁液は脱イオン水で調製（コンダクタンス0.09μS/ cm、脱イオン剤：HLP 20UV、Hydrolab、Staszyn、ポーランド）。懸濁液は、追加の精製および濾過なしで使用された。

ポリウレタンホイル（15×15×0.05 mm）の超音波コーティングは、50mlの容量のガラスフラスコで行われました。箔のサンプルをスタンド（テフロン）に固定し、続いて準備した懸濁液に浸しました。コーティングプロセスは、懸濁液中に存在するホイルサンプルに対して直角に配置された超音波ホーン（Tiホーン、Ø13mm、60％効率、20 kHz、Sonics＆Materials、Inc。、米国コネチカット州ニュータウン）を使用して実行されました。プロセス温度は30±1°Cでした。覆われたサンプルを脱イオン水で洗い流し、層流チャンバーで乾燥させた後、滅菌パッケージに詰めました。

表面エネルギー

湿潤性試験は、Data Physics OCA – 20ゴニオメーター（DataPhysics Instruments GmbH、ドイツ、フィルダーシュタット）を使用して実施しました。表面自由エネルギー（SFE）は、脱イオン水とジヨードメタンの2つの試験液を使用したOwens、Wendt、Rabel、およびKaelble（OWRK）法を使用して計算されました[41]。

細菌と酵母の培養と準備

黄色ブドウ球菌 （ATCC 25923）および表皮ブドウ球菌 （ATCC 14990）、 Escherichia coli （ATCC 25922）、およびカンジダアルビカンス （90028）は、LGC Standards（Lomianki、Poland）から入手しました。菌株は胞子懸濁液として20％（ v / v ）−20°Cでのグリセロール。実験に使用する前に、菌株を解凍し、細菌細胞を蒸留水で洗浄することによりグリセロールを除去した。次に、細菌と酵母を次の栄養培地で増殖させました。 S 用のトリプチケースソイ寒天培地 。 アウレウス および E 。 コリ 、 S 用ブレインハートインフュージョン 。 表皮ブドウ球菌 、および C 用のサブロー寒天培地 。 アルビカンス （Merck Millipore、ダルムシュタット、ドイツ）。寒天プレート上で増殖した細菌および酵母は、プレートを滅菌蒸留食塩水で穏やかに洗浄することによって収集された。細胞懸濁液中の細菌数を計算するには、600 nmでの懸濁液の光学密度（OD ₆₀₀ ）分光光度計（Helios Epsilon、Unicam、Milwaukee、WI、USA）を使用して測定しました。各微生物の検量線は、10倍段階希釈（最大10 ^{− 5} ）を実行して作成しました。 ）既知の光学密度の細菌および酵母懸濁液。各希釈液の1ミリリットルを栄養培地を含むペトリ皿に広げました。 37°Cで24時間培養した後、ペトリ皿に形成されたコロニーの数を数えました。列挙の結果（3回実施）に基づいて、コロニー形成単位（CFU）/ mLでの元の細菌懸濁液の密度を計算しました。

抗菌アッセイ

抗菌アッセイ用の接種材料は、活発に成長している生物から調製されました（対数期）。すべての微生物の接種材料は、37°C​​のミューラーヒントン（MH）培地で好気的に増殖させた一晩培養物から調製しました。細菌と酵母の濃度は、600 nmでの光学密度を測定することによって決定されました（OD ₆₀₀ ）。簡単に説明すると、細菌と酵母の懸濁液を一晩培養して調製し、10 ⁶ に調整しました。 CFU / ml。接種物は、拭き取りによってペトリ皿のMH寒天培地の表面に均一に接種された。 GO、Ag-NP、およびGO-Agでコーティングされた滅菌フォイルが寒天表面に沈着しました。ナノ粒子を含まないフォイルを対照群として使用した。フォイルの下での細菌と酵母の増殖は、37°C​​で24時間培養した後に測定されました。

生存率アッセイ

細胞生存率は、PrestoBlue™細胞生存率アッセイ（Life Technologies、Taastrup、デンマーク）を使用して評価しました。 PrestoBlue™試薬は、代謝的に活性な細胞によって迅速に還元され、生存率と細胞毒性の定量的測定を提供します。細菌および酵母細胞は、6ウェルプレート（5×10 ³ を含む200μLのMHブロス）に挿入されたインサート上にあるGO、Ag-NP、およびGO-Agでコーティングされたホイル上で培養されました。 フォイルあたりの細胞数）、24時間インキュベートします。次のステップでは、90μLの各サンプルを96ウェルプレートに移し、10μLのPrestoBlue™試薬を各ウェルに加え、37°C​​でさらに2時間インキュベートしました。各ウェルの光学密度は、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）リーダー（Infinite M200、Tecan、米国ノースカロライナ州ダーラム）で570nmで記録されました。細胞生存率はパーセンテージで表されました（OD _テスト − OD _空白 ）/（OD _{コントロール} − OD _空白 ）×100％、ここでOD _テスト テストされたフォイルにさらされた細胞の光学密度、OD _{コントロール} はコントロールサンプルの光学密度であり、OD _ブランク は細菌や酵母細胞を含まないウェルの光学密度です。

膜の完全性

LDHテスト（In Vitro Toxicology Assay Kit、乳酸デヒドロゲナーゼベース、Sigma-Aldrich、ハンブルク、ドイツ）を使用して、細胞膜の完全性を評価しました。結果として生じるNADの減少（NADH ⁺ ）テトラゾリウム染料の化学量論的変換に利用された。培養物からの培地の無細胞アリコートをアッセイした場合、LDH活性の量を膜の完全性の指標として使用することができます。膜が損傷した場合、細胞内LDH分子が培地に放出されました。細菌および酵母細胞は、6ウェルプレート（5×10 ³ を含む200μLのMHブロス）に挿入されたインサート上にあるホイル（GO、Ag-NP、およびGO-Ag）で培養されました。 フォイルあたりの細胞数）、24時間インキュベートします。ナノ粒子なしでホイル上で培養された細胞を対照として使用した。この後、サンプルをマイクロ遠心チューブに移し、1200rpmで5分間遠心分離しました。 100マイクロリットルの上清を96ウェルプレートに移し、100μLのLDHアッセイ混合物を各ウェルに添加しました。プレートを覆い、室温で30分間インキュベートしました。各ウェルの光学密度は、ELISAリーダー（Infinite M200、Tecan、メンネドルフ、スイス）で450nmで記録されました。 LDHリークはパーセンテージ{（OD _テスト − OD _空白 ）−（OD _{コントロール} − OD _空白 ）/（OD _{コントロール} − OD _空白 ）}×100％、ここでOD _テスト テストされたフォイルにさらされた細胞の光学密度、OD _{コントロール} はコントロールサンプルの光学密度であり、OD _ブランク は細胞のないウェルの光学密度です。

微生物のSEM分析

SEM分析の前に、GO-Agを含むホイル上で培養された細菌と酵母、および未処理の細菌のサンプルが準備されました。簡単に説明すると、細菌と酵母の培養液を1滴（10 ⁶ CFU / ml）をGO-Agナノコンポジットとともにホイル上でインキュベートするか、未処理の細菌を滅菌カバーガラスの表面に付着させ、空のペトリ皿内で37°Cで24時間インキュベートしました。すべてのサンプルを乾燥させ、金で覆った。最後に、サンプルをSEM（FEI Quanta 200、東京、日本）で加速電圧15kVで画像化しました。

ROSプロダクション

ROSの生成は、DCFDA、Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit（Abcam、Cambridge、UK）を使用して評価しました。 DCFDAは、細胞透過試薬2 '、7'-ジクロロフルオレセインジアセテートを使用します。これは、細胞内のヒドロキシル、ペルオキシル、およびその他のROS活性を測定する蛍光発生色素です。細胞内に拡散した後、DCFDAは細胞エステラーゼによって非蛍光化合物に脱アセチル化され、後でROSによって2 '、7'-ジクロロフルオレセイン（DCF）に酸化されます。細菌および酵母細胞は、6ウェルプレート（5×10 ³ を含む200μLのMHブロス）に挿入されたインサート上にあるホイル（GO、Ag-NP、およびGO-Ag）で培養されました。 フォイルあたりの細胞数）、24時間インキュベートします。ナノ粒子なしでホイル上で培養された細胞を対照として使用した。この後、サンプルをマイクロ遠心チューブに移し、1200rpmで5分間遠心分離しました。 100マイクロリットルの上清を96ウェルプレートに移し、100μLの希釈DCFDAを各ウェルに加え、暗所で37℃でさらに45分間インキュベートしました。 DCF生成は、ELISAリーダー（Infinite M200、Tecan、ノースカロライナ州ダーラム、米国）で、励起波長485nmおよび発光波長535nmの蛍光分光法によって測定されました。

結果

GOおよびAg-NPの特性

化学分析により、窒素、炭素、硫黄、水素、および酸素の存在が明らかになりました（表1）。

GOサンプルの相分析（図1）により、微量のグラファイト、硝酸ナトリウム、およびおそらく還元型の酸化グラフェンに由来する不純物の存在が明らかになりました。

GO粉末のX線回折パターン。 GOサンプルの相分析により、微量のグラファイト、硝酸ナトリウム、およびおそらく還元型の酸化グラフェンに由来する不純物の存在が明らかになりました。

ラマン分光法は、酸化グラフェンの構造的特徴に関する情報を提供することができます。 Dバンドは構造の乱れに起因し、Gバンドは炭素sp ² の結合伸縮に由来します。 原子[42]。追加のバンド（D '、2D、およびD + Gを含む）は、炭素材料のグラファイト構造に存在する欠陥から生じます。 私 _D / 私 _G 比率（DおよびGバンドの強度から計算）を使用して、炭素材料のグラファイト構造の乱れを特徴付けることができます。図2に示すように、GOは、グラファイト粉末の酸化中に形成される構造内の多くの官能基のために、非常に無秩序な構造を持っています。 Dバンドの位置は1351cm ^-1 とGバンド1590cm ^-1 ; 私 _D / 私 _G 比率は1.15です。

D、G、D '、2D、およびD + Gバンドのデコンボリューションが提案されている酸化グラフェンのラマンスペクトル。 GOは、グラファイト粉末の酸化中に形成される構造に多くの官能基があるため、非常に無秩序な構造になっています。 Dバンドの位置は1351cm ^-1 とGバンド1590cm ^-1 ; 私 _D / 私 _G 比率は1.15

ATRモードで収集された酸化グラフェンのFT-IRスペクトルは、GOが構造内に多くの官能基を持っていることを明らかにしました。最も顕著なピークは〜3500 cm ^-1 で観察できます。 、主に水とヒドロキシル基に割り当てられます（図3）。 1080 cm ^-1 付近の非常に強いピーク ヒドロキシル基に起因することもあります。 1600 cm ^-1 付近のピーク 通常、グラファイト状炭素に存在するC =C結合に割り当てられます。ただし、以前のXPS研究では、酸化グラフェンにいくつかのC =C結合があることが示されています[43]。したがって、このピークは、ほとんどが酸化グラフェンにまだ存在する水に起因すると考えられます。 FT-IRスペクトルで観察された他のピークは、GOがC =O結合を含むグループ（主にカルボキシル基）に富んでおり、1720 cm ^-1 付近にピークがあることを示しています。 、エポキシ（C–O–C）、1200 cm ^-1 付近にピークが見える 、およびC–H結合（ピークは約2800 cm ^-1 ）。 FT-IR分析は、酸化グラフェンに対して実行されたXPS測定とよく一致しており、ヒドロキシル、カルボキシル、エポキシ、およびカルボニル基も同定されています[44]。 10分間の超音波均質化後のGOとGOを比較し（図4および5）、同様に、10分間の超音波均質化後のAg-NPとAg-NP（図4および6）を比較しました。化合物の形態の変化を避けるために、すべての化合物を液体窒素で急速に冷却し、凍結乾燥機で乾燥させました。図5a、bはGOフレークを示し、図5c、dは部分的な折り畳みと断片化を受けるGOフレークに対する超音波の影響を示しています。図6は、Ag-NPの同様の効果を示しており、材料の形態の変化が見られます。図6a、bは、Ag-NPの水懸濁液を安定化するために使用された乾燥ポリ（ビニルアルコール）を示しています。超音波均質化の破壊的な影響は、ポリビニルアルコール構造が小さな球形の開口部を持つ長い不均一な部分に分解されたために顕著でした（図6c、d）。

GOに存在する官能基の割り当てを提案した酸化グラフェンのFT-IR（ATR、減衰全反射）スペクトル。最も顕著なピークは〜3500 cm ^-1 で観察されました 、（水およびヒドロキシル基に起因）、〜1080 cm ^-1 （ヒドロキシル基）、〜1600 cm ^-1 （グラファイト状炭素に存在するC =C結合に割り当てられます）。 FT-IRスペクトルで観察された他のピークは、GOがC =Oを含むグループ（主にカルボキシル基）に富んでおり、1720 cm ^-1 付近にピークがあることを示しています。 、エポキシ（C–O–C）、1200 cm ^-1 付近にピークが見える 、およびC–H結合（ピークは約2800 cm ^-1 ）

凝集したGOフレークのTEM画像（ a ）、超音波処理後のGOフレーク（ b ）、凝集したAg-NP（ c ）、超音波処理後のAg-NP（ d ）、およびGO-Ag（ e 、 f ）。超音波処理後の平均GO粒子サイズの減少は、GOフレークのデフラグまたはフォールディングによって引き起こされました。超音波処理後の平均Agサイズの減少は、Ag凝集体のデフラグメンテーションによって引き起こされました。注：矢印はAg-NP /凝集体を指しています

凍結乾燥したGOフレークの形態の比較（ a 、 b ）および超音波処理後のGOフレーク（ c 、 d ）走査型電子顕微鏡を使用します。超音波処理後の平均GO粒子サイズの減少は、GOフレークのデフラグまたはフォールディングによって引き起こされました

凍結乾燥したAg-NP混合物の形態の比較（ a 、 b ）および超音波処理後のAg-NP混合物（ c 、 d ）走査型電子顕微鏡を使用する

平均サイズとゼータ電位

水懸濁液の平均粒子/凝集体サイズの結果を表2に示します。平均サイズの分析は、超音波均質化（受け取ったまま）を受けていない濃縮懸濁液と希釈懸濁液について実行されました。試験前に希釈された懸濁液は、超音波均質化にかけられ、均質化パラメーターは、ナノ材料層（Ag-NPs、GO）によるフォイルの超音波コーティング中に使用されたものと同じでした。 Ag-NP懸濁液の場合、超音波の作用により、平均粒子サイズが80nmから218nmに増加しました。懸濁液中の超音波均質化後の平均粒子サイズの増加の主な原因（Ag-NP凝集のプロセスは別として）は、Ag-NPが懸濁液の安定化に使用されるポリ（ビニルアルコール）に打ち込まれたことでした。超音波によって均質化されたAg-NPサンプルの大きな標準偏差は、懸濁液中のポリ（ビニルアルコール）に打ち込まれた緩いAg-NPとAg-NPの両方の存在に起因していました。 GO懸濁液の場合、超音波均質化を行ったサンプルの平均粒子サイズは263 nmであり、均質化を行わなかったサンプルの平均粒子サイズの約7.7分の1でした。得られた結果は、GOフレークに対する超音波の破壊的影響を示すSEMテスト（図5）と収束しています。平均GO粒子サイズの減少は、GOフレークのデフラグまたはフォールディングによって引き起こされました。ただし、GO懸濁液サンプルの平均粒子サイズの結果には、ナノマテリアルの形状に関連する誤差が含まれることを強調しておく必要があります。 DLS法で得られた結果は、測定された粒子と同じ拡散係数を持つ球の形状に基づいて計算された流体力学的平均です。ただし、GOの形状はフレークであり、SEM画像で確認できました。

サンプルのゼータ電位分析のテスト結果を表3に示します。水懸濁液中のAg-NPのゼータ電位はわずか-5.9mVであり、サンプルの静電安定性が不足していました。 Ag-NP懸濁液のサンプルは、Ag-NPの凝集/凝集を防ぐポリ（ビニルアルコール）添加によってAg-NP距離を維持することにより、立体的に安定化されました。次に、GO懸濁液サンプルのゼータ電位は-41 mVであり、サンプルに適度な静電安定性を与えました。サンプルの適度な静電安定性は、懸濁液の適合性が宣言されている期間中の粒子サイズの変化が事実上無視できるほどゆっくりと沈降することを特徴としています。 Ag-NPとGOの混合物のゼータ電位の結果は-7.1mVでした。これは、超音波の作用中に、GOフレークがポリ（ビニルアルコール）とAg-NPでコーティングされたことを意味する可能性があります。水懸濁液中のAg-NPとGOサンプルの混合物から得られたゼータ電位の結果は、静電安定性が存在しないことを意味しました。

フォイルの特性

作成された層の形態を決定するために、4種類のフォイルサンプルを比較しました（図7）：純粋なポリウレタンフォイル（A、B）、GOコーティングされたポリウレタンフォイル（C、D）、Ag-NPコーティングされたポリウレタンホイル（E、F）、およびGO-Ag混合コーティングポリウレタンホイル（G、H）。

a の走査型電子顕微鏡画像 、 b 単一の不純物を含む滑らかな表面を備えたコーティングされていないポリウレタンホイル。 c 、 d GOでコーティングされたフォイル、ポリウレタンフォイル表面に堆積した分解されたGOフレーク。 e 、 f ポリビニルアルコールとAg-NPで構成されるグリッド構造が観察されるAg-NPでコーティングされた箔。および g 、 h 超音波の影響下で混合され、ホイル表面に堆積されたGO-Agでコーティングされたホイル

図7a、bは、単一の不純物を含む滑らかな表面を備えたコーティングされていないポリウレタンホイルを示しています。図4c、dでは、ポリウレタンフォイルの表面に堆積した分解されたGOフレークが目立ちます。図7e、fは、Ag-NPでコーティングされた箔の表面を示しており、その上にポリビニルアルコールとAg-NPで構成されるグリッド構造が観察されます。図7g、hは、超音波の影響下で混合され、ホイル表面に堆積したGO-Ag組成の混合物を示しています。

AFM分析と表面自由エネルギー

AFMとLFMは、SEMによって調査された表面形態に関する情報を補完するために使用されました。調査により、箔上でAg-NP、GO、およびGO-AgNP溶液を使用してポリビニルアルコールを超音波処理することにより表面形態の変化が確認されました。超音波法でコーティングされた箔に関連して、純粋なポリウレタン箔が参照箔として使用された。図8の画像は、ACで作成されたAFM位相差画像です。さらに、GOフレークの断面が対応する画像の下に添付されています。図8aは純粋なポリウレタンフィルムの画像です。図7bは、Ag-NPコーティングされたフィルムを示しています。ここでは、図8e、fと同様に、特徴的で均質なグリッド構造が観察されます。図8c、dは、GO-Ag-NPでコーティングされたフィルムを示しています。図8eは、ほぼ完全にGOフレークで覆われたホイルの表面を示しています。位相差画像は、これら2つの位相を観察するのに役立ちます。暗い領域はGOで、明るい領域はポリマーフォイルです。 Ag-NPコーティング後、コーティングされていないフォイルと比較して、フォイルの形態が変化していることがわかりました。 GO-Ag-NPコーティングは、前述のように、画像上に小さな黒い斑点として見られる少量のGOフレークも含まれているため、前のコーティングとは異なります。図8fは、LFMで作成された1つのGOフレークの拡大図を示しています。摩擦の減少は、それが実際にGOフレークであることを確認します。

グラフェンフレークのAFM位相差画像と断面トポグラフィー画像： a コーティングされていないフォイルポリウレタンフォイル; b 特徴的で均質なグリッド構造が観察されるAg-NPコーティングフォイル。 c 、 d GO-Agコーティングされたフォイル; e GOコーティングされたホイル。ホイルの表面はほぼ完全にGOフレークで覆われています。位相差画像は、これら2つの位相を観察するのに役立ちます。暗い領域はGOで、明るい領域はポリマーフォイルです。 f グラフェンフレークのLFM画像。赤いマーク、断面積

GOコーティングされたホイルの極性成分は、純粋なホイルに比べて2.3±0.6から68.9±2.8 mJ / m ² に増加しました。 、分散成分は34.4±1.3から8.2±1.2 mJ / m ² に減少しました。 。 SFEは36.7±1.4から77.0±3.4mJ / m ² に増加しました 。同様の効果は、Ag-NPとGO-Ag混合物でコーティングされたホイル表面では観察されませんでした。 Ag-NPとGO-Ag混合物でコーティングされたホイルサンプルのSFEは、統計的に異なりません（表4）。

抗菌特性

GO、Ag-NP、およびGO-Agでコーティングされたさまざまなフォイルの抗菌活性を E でテストしました。 。 コリ 、 S 。 アウレウス 、 S 。 表皮ブドウ球菌 、および C 。 アルビカンス。 結果は、37°C​​で24時間バクテリアと共培養した後、ホイルはテストされたすべての微生物の成長をさまざまな程度で抑制したことを示しました。試験したすべての微生物に対する最大の抗菌効果は、GO-Agナノコンポジットでコーティングされたホイルでした。 GOおよびAg-NPでコーティングされたホイルで処理された細胞の細菌増殖は、対照群の細胞のそれよりわずかに低かったが、GO-Agでコーティングされたホイルで処理された細菌細胞の増殖は大幅に阻害され、 E 。 コリ 、 S の79.6％ 。 アウレウス 、 S の76.5％ 。 表皮ブドウ球菌 、および C の77.5％ 。 アルビカンス （図9、10、および11）。

GO-Agコーティングフォイルの抗菌特性。 E の成長 。 コリ （ b 、 c ）、 S 。 アウレウス （ c 、 d ）、 S 。 表皮ブドウ球菌 （ e 、 f ）、および C 。 アルビカンス （ g – i ）GO-Agでコーティングされたホイルと37°Cで24時間共培養すると、コロニーが減少します。 a GO-Agコーティングホイルを使用した代表的な寒天プレート。注：黒い矢印はGO-Agコーティングされたフォイルを指しています。矢印は微生物のコロニーを指しています

GO-Agでコーティングされたホイルとの共培養後の微生物の形態。コントロールフォイル内の細菌と酵母の走査型電子顕微鏡画像（ a 、 c 、 e 、 g ）およびGO-Agでコーティングされたフォイル（ b 、 d 、 f 、 h ）37°Cで24時間インキュベートした後。 E 。 コリ （ a 、 b ）、 S 。 アウレウス （ c 、 d ）、 S 。 表皮ブドウ球菌 （ e 、 f ）、および C 。 アルビカンス （ g 、 h ）GO-Agでコーティングされたホイルとの共培養後、成長の低下と形態の変形を示します

ナノマテリアルでコーティングされた箔は E を減少させます 。 コリ 、 S 。 アウレウス 、 S 。 表皮ブドウ球菌 、および C 。 アルビカンス 実行可能性。 Presto Blueアッセイを使用して、Ag-NP、GO、およびGO-Agでコーティングされたホイル上で37°Cで24時間培養した後の、細菌と酵母の生存率を評価しました。 Cコントロールグループ（ナノ粒子なしのフォイル）、銀ナノ粒子でコーティングされたAgフォイル、酸化グラフェンでコーティングされたGOフォイル、酸化グラフェンと銀ナノ粒子の複合材料でコーティングされたGO-Agフォイル。注：異なる文字（a〜d）の列は、濃度間の有意差を示します（ P =0.001）;エラーバーは標準偏差です

膜の完全性

細胞膜が損傷した場合、細胞内LDH分子が培地に放出される可能性があります。細胞外のLDHレベルは細胞膜の完全性を示しています。 GO、Ag-NP、およびGO-Agでコーティングされた箔は、細胞膜の機能と完全性を破壊し、対照群とAg-NPおよびGO-Ag群の間に有意差がありました（図12）。細胞膜の破壊が最も高かったのはGO-Agグループで、 E の66.3％でした。 。 コリ 、 S の59.4％ 。 アウレウス 、 S の54.8％ 。 表皮ブドウ球菌 、および C の48.5％ 。 アルビカンス 。

ナノマテリアルでコーティングされた箔は E 減少しました 。 コリ 、 S 。 アウレウス 、 S 。 表皮ブドウ球菌 、および C 。 アルビカンス 膜の完全性。 Ag-NP、GO、およびGO-Agでコーティングされたホイル上で37°Cで24時間培養した後の、細菌と酵母の膜の完全性をLDHアッセイで評価しました。 Cコントロールグループ（ナノ粒子なしのフォイル）、銀ナノ粒子でコーティングされたAgフォイル、酸化グラフェンでコーティングされたGOフォイル、酸化グラフェンと銀ナノ粒子の複合材料でコーティングされたGO-Agフォイル。注：異なる文字（a〜c）の列は、濃度間の有意差を示します（ P =0.000）;エラーバーは標準偏差です

ROSプロダクション

低レベル（または最適レベル）のROSは、シグナル伝達経路において重要な役割を果たします。ただし、ROSの生成が増加し、細胞の抗酸化能力を圧倒すると、高分子の損傷を引き起こし（DNA、タンパク質、脂質と反応することにより）、チオールの酸化還元回路を破壊する可能性があります。 Ag-NPとGO-Ag（ P ）でコーティングされた箔 <0.05）は、対照群と比較して、試験したすべての微生物のROS産生を増加させました。 GOでコーティングされた箔は、 C のROS生成を増加させるだけでした 。 アルビカンス 。最高のROS産生は、GO-Agグループで観察されました（図13）。

活性酸素種の生成に対するナノ材料でコーティングされた箔の効果。 E 。 コリ 、 S 。 アウレウス 、 S 。 表皮ブドウ球菌 、および C 。 アルビカンス Ag-NP、GO、およびGO-Agでコーティングされたホイル上で37°Cで24時間培養しました。活性酸素種の生成は、DCFDA、細胞反応性酸素種検出アッセイキットで評価されました。 Cコントロールグループ（ナノ粒子なしのフォイル）、銀ナノ粒子でコーティングされたAgフォイル、酸化グラフェンでコーティングされたGOフォイル、酸化グラフェンと銀ナノ粒子の複合材料でコーティングされたGO-Agフォイル。注：異なる文字（a〜d）の列は、濃度間の有意差を示します（ P =0.000）;エラーバーは標準偏差です

ディスカッション

抗生物質の発見は、細菌の増殖を防ぎ、感染症を治療することができる微生物によって生成される天然産物であり、医学療法に革命をもたらしました。しかし、抗生物質の乱用と誤用は、抗生物質耐性に寄与する重要な要因でした。今、抗生物質の時代は終わりに近づいており、新しい抗菌剤が必要とされています。近年、いくつかの生物医学的用途における抗菌活性のために、ナノ粒子が抗菌試薬の有望な代替物として研究によって報告されています[19、45]。ナノ粒子は、多くの病原性および抗生物質耐性微生物を制御するための効果的な方法です。多くの金属ナノ粒子の中で、Ag-NPは、その抗菌活性の明確な特性のために熱心に研究されてきました[7]。 Ag-NPは、細菌（グラム陽性菌と陰性菌の両方）、真菌、ウイルスを含む650を超える微生物に対して有効であることが証明されています。しかし、抗菌作用の正確なメカニズムは完全には理解されていません[46]。微生物へのAg-NP曝露は、ペプチドグリカンおよび細胞膜へのナノ粒子の接着[47]、細胞内への浸透[48]、ROSの誘導[49]、および細胞内構造の損傷[50]を引き起こす可能性があります。ただし、裸のAg-NPは、バクテリアと接触すると凝集します。したがって、それらはそれらの活性表面積を失い、より弱い抗菌活性を示す[51]。この問題を克服するために、グラフェン材料とAg-NPまたは他の金属ナノ粒子で構成されるナノコンポジットを製造することができます。酸素含有官能基を持つGOは水溶性であるため、元のグラフェンよりも生体適合性が高くなります。結果として、AgベースのGOナノコンポジットは抗菌剤として使用される可能性があります。ただし、グラフェンベースの複合材料の抗菌特性に関する情報は限られており、毒性または毒性の欠如のメカニズムは完全には説明されていません。

この作業の目的は、 S に対するAgナノ粒子で装飾された酸化グラフェンベースのナノコンポジットの作用を研究することでした。 。 アウレウス 、 S 。 表皮ブドウ球菌 、 E 。 コリ 、および C 。 アルビカンス 成長;膜の完全性;とROSの生産。細菌および酵母細胞と24時間共培養した後、GO-Agナノコンポジットでコーティングされたホイルは、さまざまな程度で、 E の88.6％で、テストされたすべての微生物の増殖を抑制しました。 。 コリ 、 S の79.6％ 。 アウレウス 、 S の76.5％ 。 表皮ブドウ球菌 、および C の77.5％ 。 アルビカンス 。この作用は、おそらくナノ粒子による細胞膜と壁の浸透の増加によるものです。一部の研究者は、グラフェンベースのナノコンポジットの抗菌活性は、細胞膜の完全性と酸化ストレスの破壊に起因する可能性があると示唆しています[52]。

GO、Ag-NP、およびGO-Agでコーティングされた箔は、細胞膜の機能と完全性を破壊し、対照群とAg-NPおよびGO-Ag群の間に有意差がありました。細胞膜の破壊が最も高かったのはGO-Agグループで、 E の66.3％でした。 。 コリ 、 S の59.4％ 。 アウレウス 、 S の54.8％ 。 表皮ブドウ球菌 、および C の48.5％ 。 アルビカンス 。しかし、裸のAg-NPでコーティングされたホイルも細胞膜を破壊しました。 Ag-NPは、透過性を高め、膜の構造を変化させることで細菌の膜と相互作用し、最終的に細胞死を引き起こすことが提案されています[50]。 Ag-NPは、細菌の細胞膜に直接損傷を与える可能性があります。バクテリアは、放出されたAg ⁺ の複合殺菌効果によって殺される可能性があります イオンとAgナノ粒子。さらに、Ag-NPの抗菌力は、微生物の細胞壁の厚さにも影響されます[53]。グラム陽性菌の壁には、テイコ酸に付着したペプチドグリカンの厚い層（20〜80 nm）が含まれています。グラム陰性菌では、細胞壁は薄い（7〜8 nm）ペプチドグリカン層で構成され、外膜を含みます。 S などのグラム陽性菌のより厚いペプチドグリカン層 。 アウレウス および S 。 表皮ブドウ球菌 、これらの細菌がGO-Agの抗菌効果に対してより耐性がある理由を説明するかもしれません。

多くの研究は、コロイドとイオンの両方の形で銀が示す抗菌活性の作用機序を確立しようと努めてきました。放出されたAg ⁺ 間の相互作用による膜機能の破壊 イオンと細胞膜、およびROSの形成によって引き起こされる広範な細胞膜の損傷は、最終的に酸化ストレスによる細胞の損傷を引き起こします。さらに、Ag ⁺ イオンは、呼吸鎖酵素を阻害することによって酸化的リン酸化からそれを切り離すことによって、呼吸電子伝達系の機能不全を引き起こす可能性があります[54]。 Ag-NPsとGO-Agでコーティングされた箔は、コントロールグループと比較してすべてのテストされた微生物のROS生産を増加させました。生物学的標的は、DNA、RNA、タンパク質、脂質です。脂質は、酸化ストレス中の主要なターゲットの1つです。フリーラジカルは、細菌や酵母の膜にある多価不飽和脂肪酸を直接攻撃し、脂質の過酸化を活性化する可能性があります。脂質過酸化の基本的な影響は、膜流動性の低下であり、これは膜結合タンパク質を著しく破壊する可能性があります。 DNAも主なターゲットです。 DNA損傷のメカニズムには、炭素中心の糖ラジカルと複素環式塩基のOHまたはH付加物ラジカルにつながるフリーラジカルによる引き抜きと付加反応が含まれます。バックボーンで一本鎖および二本鎖切断を生成する糖部分、塩基および糖基の付加物、および他の分子への架橋は、複製をブロックする可能性があります。 GOでコーティングされた箔は、非常に低いレベルでROS生成を増加させました。ただし、Hu etal。 [55]は、GOが E に悪影響を及ぼしたことを示しました 。 コリ ATPの生産が減少し、ROSの生産が増加したためです。趙ら[56]は、GOの抗菌活性とGOの低下を報告しました。また、Gurunathan etal。 [57]は、GOおよび還元GOが濃度および時間依存的に有意な抗菌活性を示すことを示しました。彼らの結果は、酸化ストレスがGOの抗菌活性の重要なメカニズムであり、ROS生成を通じてGOを減少させることを示しました。ナンダら。 [53]は、 E に対するシスタミン結合GOの効果を報告しました 。 コリ 、 S 。 サルモネラ菌 、 E 。 フェカリス 、および B 。 枯草菌 ROS産生と高い抗菌活性を備えています。

Kurantowicz etal。 [20]は、バクテリアがGO表面に付着し、最高の抗菌活性をもたらすことを確認しました。 GOは、高度な酸素化官能基（カルボニル、カルボキシレート、およびヒドロキシル）を特徴としています。これらのグループは、細菌や酵母の付着にとって魅力的なグループである可能性があると仮定します。これらのグループは、微生物によって一般的に認識されている広範囲の栄養素（アミノ酸、脂肪酸）に存在します。本研究では、GOでコーティングされたフォイルは、Ag-NPおよびAg-GOグループよりも低いレベルで膜破壊とROS生成を誘発しました。ただし、細胞の生存率は低下しました。これは、超音波修正後のGOのより小さな活性表面に関連している可能性があります。

結論

Ag-NP、GO、およびAg-GOナノコンポジットは、グラム陰性菌（ E ）に対してより強力な抗菌活性を示しました。 。 コリ ）対グラム陽性菌（ S 。 アウレウス および S 。 表皮ブドウ球菌 ）および酵母（ C 。 アルビカンス ）。結果は、Ag-NPによるGOの装飾が相乗効果を促進し、テストされたすべての細菌および酵母菌株を阻害するために必要な濃度を劇的に減少させることを示しました。 Ag-GOの抗菌力は、微生物の細胞壁の厚さにも影響されます。 S などのグラム陽性菌のより厚いペプチドグリカン層 。 アウレウス および S 。 表皮ブドウ球菌 、これらの細菌がGO-Agの抗菌効果に対してより耐性がある理由を説明するかもしれません。放出されたAgナノ粒子/ Ag ⁺ 間の相互作用による膜機能の破壊 イオンと細胞膜、およびROSの形成によって引き起こされる広範な細胞膜の損傷は、最終的に酸化ストレスによる細胞の損傷を引き起こしました。 ROS産生のメカニズムを説明するために、追加の研究が必要です。私たちの研究は、抗菌剤としてのGO-Agの潜在的な適用可能性を示しています。

略語

AFM：

原子間力顕微鏡

Ag-NPs：

銀ナノ粒子

DLS：

動的光散乱

GO：

酸化グラフェン

GO-Ag：

銀ナノ粒子で装飾された酸化グラフェン

LDE：

レーザードップラー電気泳動

LDH：

乳酸デヒドロゲナーゼ

ROS：

活性酸素種

SEM：

走査型電子顕微鏡

XRD：

X線回折