還元剤およびキャッピング剤として酵母エキスを使用した銀ナノ粒子の生合成および抗菌活性

はじめに

薬剤耐性感染症は主な死因であり、公衆衛生に深刻なリスクをもたらしています。さらに、抗菌薬に対する耐性の増加は、医学における緊急の問題として浮上しています[1]。 黄色ブドウ球菌のいくつかの菌株 メチシリンに耐性があり、院内感染の主な原因です。さらに、他の抗生物質耐性菌には、ペニシリン耐性の Neisseria gonorrhoeae が含まれます。 多剤耐性 Escherichia coli （ E.coli ）[2、3]。耐性の主なメカニズムは、抗生物質の流出の増加と吸収の減少です[4]。薬剤耐性のもう1つのメカニズムは、抗生物質の分子構造を変更する酵素の発現です[5]。次世代の抗菌剤の開発に多くの努力が注がれていますが、優れた消毒方法の必要性が高まっています。

銀ナノ粒子（Ag NP）は、タンパク質担体、放射線増感剤、太陽燃料電池の効率改善、抗菌剤など、多くの用途で使用されてきました[6、7、8]。金属含有ナノ粒子を含むナノ粒子であるAgNPは、抗菌剤として最も広く使用されています[9]。実際には、銀ナノ粒子は細菌株に対して有意な抗菌活性を示していますが、動物細胞に対する細胞毒性はごくわずかです[10、11]。さらに、Ag NPは、真菌、特定のウイルス、および抗生物質耐性菌株に対して抗菌活性を示しました。それらの作用機序に関しては、DNA複製の抑制、細胞質膜に必要な電位差の遮断、および呼吸鎖の抑制がAgNPの主な作用機序です。したがって、Ag NPのサイズ、表面構造、および制御された形状は、抗菌活性やその他の用途で重要な役割を果たします。 Ag NPを調製するための一般的な方法は、適切な界面活性剤の存在下で銀イオンを還元して、AgNPの制御された成長を達成することです[12]。還元剤と界面活性剤の大部分は、ヒト組織細胞に対して細胞毒性を示し、環境汚染を引き起こす可能性があります。したがって、形状制御されたAgNPを調製するためのグリーンメソッドを開発するためのさらなる努力が不可欠です。

この作業では、酵母エキスを利用してAgNPの生合成のための新しいルートを提示します。その過程で、酵母エキスはアミノ酸、ビタミン、炭水化物などの還元剤とキャッピング剤を供給しますが、銀イオンは電子受容体として機能します。その結果、表面の有機キャッピング剤である単分散Ag NPによって提供される良好な安定性は、沈殿することなく1年以上保存できます。 Ag NPは、アンピシリン耐性 Eに対してアンピシリンと比較して優れた抗菌活性を示すことがわかった。コリ 細胞。従来の合成方法と比較して、本明細書に提示される生合成アプローチは、生体適合性であり、費用効果が高く、環境に優しい。さらに、形状が制御され、十分に分散されたAg NPは、 Eに対して優れた抗菌効果を示しました。コリ 。

メソッド

資料

硝酸銀（AgNO ₃ ）、ショ糖（C ₁₂ H ₂₂ O ₁₁ ）、塩化ナトリウム（NaCl）、および水酸化ナトリウム（NaOH）はSinopharm Co.、Ltdから購入しました。ドライパン酵母はAB / MAURI Co.、Ltd。から入手しました。 E。コリ TransGen Biotech Co.、Ltdから購入しました。CellTiter96®AqueousOneSolution Cell Proliferation Assayキット（MTS）は、Promega Biotech Co.、Ltdから購入しました。pcDNA3.4プラスミド、1×NuPAGE®LDSサンプルバッファー、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）およびウシ胎児血清（FBS）はThermo Fisher Scientific Inc.から購入しました。AmpicillinおよびLuria-Bertani（LB）培地はSangon Biotech Co.、Ltdから購入しました。すべての化学物質は分析試薬であり、さらに精製することなく使用しました。実験全体を通して、脱イオン超純水（18.2MΩ.cm）を使用しました。

AgNPの合成

貯蔵された酵母細胞をルリア-ベルターニ（LB）培地に接種し、活性化のために25°Cで一晩約150rpmで振とうしました。次に、活性化された酵母細胞を0.9％生理食塩水で洗浄し、25°Cで6時間約150rpmで振とうしながら2％スクロース溶液に分散させました。最後に、無細胞酵母エキスを収集して、2000rpmで5分間の遠心分離によりAgNPの生合成を行いました。生合成過程で、酵母エキスのpH値をNaOH溶液で10に調整し、次にAgNO ₃ 激しく磁気攪拌しながら、溶液を上記の溶液に徐々に加えた。最後に、得られたAgNPを1kDaの透析膜で5日間透析し、さらに特性を評価するために凍結乾燥しました。

特性

Ag NPの透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、加速電圧200 kVのJEM-2100顕微鏡（JEOL、日本）で観察されました。走査型電子顕微鏡（SEM）画像は、20 kVで動作するエネルギー分散型分光計（EDS）を備えたCarl Zeiss ULTRA plus走査型電子顕微鏡（Carl Zeiss、ドイツ）で取得しました。紫外可視（UV-Vis）吸収スペクトルは、Lambda 950 UV / Vis / NIR分光光度計（Perkin-Elmer、USA）で記録されました。 X線粉末回折（XRD）パターンは、D8 Advance機器（Bruker、ドイツ）を使用して取得しました。フーリエ変換赤外分光法（FTIR）は、4000-500 cm ^-1 で記録されました。 Vertex 70 FTIR分光計（Bruker、ドイツ）でKBrペレットとして調製されたサンプルを使用。 Ag NPのゼータ電位は、Malvern Zeta Nano ZS-90（Malvern、United Kingdom）を使用して25°Cで測定しました。 Ag NPの表面元素は、単色AlKα源（1486.6 eV）を備えたKratos AXIS Ultra DLD装置（島津製作所）を使用したX線光電子分光法（XPS）によって同定されました。アミノ酸成分は、L-8900高速アミノ酸分析装置（日立、日本）で分析しました。

細胞毒性アッセイ

調製したAgNPの生体適合性を調べるために、MTSアッセイを使用してAgNPの細胞毒性を評価しました[13]。 Cos-7細胞は、5％CO ₂ を含む加湿雰囲気インキュベーター内で10％FBS完全培地を添加したDMEMで培養しました。 37°Cで。細胞を96ウェル平底プレートにウェルあたり10000細胞の密度でプレーティングし、24時間培養しました。次に、増殖培地を、異なる濃度のAgNPを含む新鮮なDMEM培地と交換した。さらに24時間培養した後、比較的生存率の高い細胞をMTSで測定しました。 SpectraMax®M5マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、USA）を使用して、490nmで吸光度を測定しました。 DMEM培地で未処理の細胞をコントロールとして使用しました。

SDS-PAGEアッセイ

標準的なSDS-PAGEは、10％（w / v）分離ゲルと4％スタッキングゲルを使用して実施しました。サンプルを1×NuPAGE®LDSサンプルバッファーで5分間煮沸し、12000rpmで5分間遠心分離してからゲルにアプライしました。標準タンパク質マーカーを参照対照として使用した。ゲルは0.5％クマシーブルーで染色されました。ゲルの画像はGelDocXR ⁺ で記録されました ゲルイメージングシステム（Bio-Rad、USA）。

抗菌活性研究

抗菌活性を決定するために、合成されたＡｇ ＮＰを、Ｅに対する殺菌活性について試験した。コリ [14]。 Eの単一コロニー。コリ 150rpmのオービタルシェーカー上でLB培地で37°Cで一晩増殖させました。コロニーは、新鮮なLB培地を使用して600 nmで0.01〜0.02のODに調整されました。次に、100μLのAgNPの段階希釈液を96ウェルマイクロプレートに充填しました。次に、マイクロプレートに100μLの希釈された Eを接種した。コリ 溶液を加え、37°C​​で16時間インキュベートしました。 Eの実行可能性。コリ SpectraMax®M5マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、USA）を使用して600nmでの吸光度を測定することにより測定しました。 Eに対する抗菌感受性を評価するために、経時的分析を行った。コリ 時間とともに。最後に、100μLの E。コリ 溶液を、それぞれ10および20μg/ mLのAgNPを含む滅菌チューブに添加しました。 600 nmでの吸光度は、SpectraMax®M5マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、USA）を使用して、1、2、4、および6時間後に測定されました。

抗生物質耐性菌細胞に対するAgNPを調査するために、コロニー形成単位アッセイが導入されました。 E。コリ モデルとしてアンピシリンへの耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子を含むpcDNA3.4プラスミドを安定して発現します。アンピシリン耐性 Eの場合。コリ （ E.coli -アンプ ⁺ ）細胞は対数増殖期、 Eに達した。コリ -アンプ ⁺ 細胞は、アンピシリン単独処理またはAg NPとの併用処理で、LB寒天プレートで増殖させ、37°C​​で18時間インキュベートしました。 Eの数。コリ -アンプ ⁺ LBプレート上に形成されたコロニーを計算した。すべてのアッセイは少なくとも3回実行されました。

結果と考察

AgNPの合成

スキーム1に概略的に示されているように、Ag NPの調製は、酵母エキス中の生体分子の自己組織化から始まり、酵母ミセルを形成しました。次に、Ag ⁺ アミノ酸、ビタミン、炭水化物など、酵母エキス中の還元剤によってその場で還元されました。形成されたAgナノ粒子は生体分子によって安定化されました。 Ag NPの表面コーティングは、細菌膜への親和性を高め、細胞壁の透過性を高めました。 Ag NPとペプチドグリカンの間の相互作用により、ペプチドグリカンの構成が変化し、最終的にアポトーシスプロセスが発生して細菌に損傷を与えました。

AgNPの生合成の提案された概略図

AgNPの構造特性

図1aに示すように、典型的なSEM画像は、合成されたAgNPが球形で微細なサイズであることを示しました。 EDXはAgNPの形成を確認しました（図1b）。表面プラズモン共鳴の銀ナノクリスタライトの典型的な光吸収ピークである約3keVに強い光吸収ピークが観察されました。少量の酸素と炭素は、合成されたAgNPの有機キャッピングの薄層に起因する可能性があります。 AgNO ₃ の反応 NaOHを含む溶液は、少量のAg ₂ を形成します。 O.したがって、少量のOは、Ag ₂ の存在に起因する可能性もあります。 O. Ag NPの形態とサイズは、高分解能TEM（HRTEM）によってさらに特徴づけられました。 Ag NPの直径は10.3〜18.9 nm（図1c）で、平均サイズは13.8 nm（図1d）でした。 Ag NPのサイズ、形状、および表面化学は、抗菌活性に重要な影響を示しました。より小さなサイズとより大きな表面積により、Ag NPは細菌膜とよりよく相互作用し、抗菌活性をさらに高めることができました[15、16、17]。 HRTEM画像の明確な格子縞は0.15nmの縞間隔を示し（図2a）、これは銀の（220）面に対応します。図2bに示すように、Ag NPの結晶性は、典型的な制限視野回折（SAED）パターンによって示されました。ここで、明るい円形のリングは（311）、（220）、（200）、および（ 111）平面[18、19]。

a Ag NPの電界放出SEM画像、 b Ag NPのEDXスペクトル、 c Ag NPのTEM画像、および d AgNPのサイズ分布

a HR-TEM画像のAgNPの格子縞 b 典型的な制限視野回折（SAED）パターンからのAgNPの円形リング

Ag NPのUV-Visスペクトルは、表面プラズモン共鳴による418 nmで強いピークを示しました（図3a）。合成されたAgNPの黄色の溶液を図3bに示します。これは、AgNPの形成を示しています。合成されたAgNPのXRDパターン分析は、77.36°、64.30°、43.52°、および38.16°に4つの強いピークを示しました。これは、銀の（311）、（220）、（200）、および（111）面に対応します。それぞれ（図3c）。データは、JCPDSカードNo. 04-0783 [20]の標準シルバーデータによって確認されました。 XRDパターンは、以前の報告[21]と一致して、合成されたAgNPの結晶性を示しました。 FTIR分析を使用して、合成されたAg NP上の潜在的な生体分子を特性評価および特定しました（図3d）。 3405 cm ^-1 の広帯域 -OH伸縮に対応します[22]。 2915 cm ^-1 の弱いピーク -CH2伸縮振動に割り当てられます。 1655 cm ^-1 のバンド 酵母エキスでは、カルボキシル部分のC =O伸縮振動が原因であり、このバンドは1573 cm ^-1 にシフトします。 Ag NPでは、カルボキシル部分とAgNP間の相互作用による[23]。 1375 cm ^-1 の鋭いピーク C–N伸縮振動に起因します。 1048 cm ^-1 のバンド および1083cm ^-1 それぞれC–O–CとC–OHの伸縮振動に割り当てられます[24、25]。これらの結果は、酵母エキスの生体分子がAgNPの生合成に関与していることを示しています。 Ag NPの表面コーティングは、細菌膜に対する親和性に影響を及ぼしました[26、27]。 Ag NPの状態は、XPSによってさらに特徴づけられました。図4aに示すように、明確なピークを持つXPSスペクトルのフルスキャンは、C 1 s に起因していました。 、Ag 3 d 、Ag 3 p 、Ag 3 s 、およびO 1 s 。 Ag 3 d （5/2）およびAg 3 d （3/2）ピークは、それぞれ約368.5および374.5 eVの結合エネルギーで観察されました（図4b）。 6.0 eVのこのエネルギー分割値は、Ag NPの形成を示しました[28、29]。

a Ag NPのUV-Visスペクトル、 b 合成されたAgNPの写真、 c Ag NPのXRDパターン、および d AgNPと酵母エキスのFTIRスペクトル

a AgNPおよび b のXPSスペクトルのフルスキャン Ag 3dXPSスペクトル

Ag NPの表面電荷は、コロイド溶液の安定性と分散の重要なパラメーターであるMalvern Zeta NanoZS-90装置によって決定されました。ゼータ電位は、ナノ粒子の拡散層とコンパクト層の間の境界での表面静電ポテンシャルであり、生物医学的ポリマーの用途の指標です[30]。追加ファイル1：図S1に示すように、より低いpH値3で、Ag NPのゼータ電位はわずかに負の電荷（-3.2 mV）を示しました。 Ag NPのゼータ電位は、pH7.0の-12.1mVからpH11.0の-24.4mVに単調に減少し、AgNPの表面に負に帯電した基が確認されました。 Gao etal。 Ag NPの分散と安定性は、主に表面電荷に起因すると報告されています[31]。負に帯電した基の存在は、水溶液中のAgNPの安定性と分散を改善します[32]。

AgNPの細胞毒性と生体分子の分析

合成されたAgNPの生体適合性は、それらのさらなる生物医学的応用にとって重要です。 Ag NPの細胞毒性を調査するために、Cos-7細胞の細胞生存率をMTSアッセイで検出しました。 Cos-7細胞は、さまざまな濃度のAgNPとともに24時間インキュベートされました。図5aに示すように、細胞を200μg/ mLの高濃度のAgNPで処理した場合、有意な細胞毒性は見られませんでした。 Ag NPは、Cos-7細胞に対してごくわずかな細胞毒性と良好な生体適合性を示したと結論付けることができます。

a Cos-7細胞におけるAgNPの細胞毒性および b SDS-PAGE分析。レーン1：バッファー制御のロード。レーン2〜4：合成されたAgNP。レーン5：8000rpmで遠心分離した酵母エキス

合成されたAgNPの合成メカニズムを調べるために、AgNPと酵母エキスの表面にある生体分子を分析しました。図5bに示すように、SDS-PAGE分析では、合成されたAgNPの表面または酵母エキスに検出可能なタンパク質または限界タンパク質は示されませんでした。さらに、高速アミノ酸分析装置を使用して、酵母エキス中の生体分子を測定しました。追加ファイル1：補足情報の表S1に要約されているように、酵母エキスには、グルタミン酸、γ-アミノ酪酸、装飾品、およびα-リノレン酸が豊富な約22種類のアミノ酸が含まれています。これらのアミノ酸の等電点は約6ですが、リジンとアルギニンの等電点は約10〜11です。さらに、-NH ₂ を含むさまざまなコンポーネント 尿素、アンモニア、アスパラギン、グルタミンなどが見つかりました。酵母エキス中の還元性アミノ酸、α-リノレン酸、および炭水化物の生体分子は、AgNPの形成に重要な役割を果たします。 NADH依存性レダクターゼ[33、34]または硝酸レダクターゼ酵素が微生物抽出物を介したAgNPの生合成における還元プロセス[35,36,37]に関与していることが報告されました。

酵母エキスの生体分子は、凝集から保護することにより、AgNPの形成に決定的な役割を果たします。生体分子の安定剤は、AgNP間の冗長な反応を防ぐのに役立ちます[38]。アミノ酸の両性分子には、塩基性基と酸性基の両方が含まれています。これらのアミノ酸化合物の正味電荷は、酵母エキス溶液のpH変化に応じて負または正になり、AgNPの合成中の結合能力にさらに影響します[39]。アルカリ性溶液では、Ag NPの表面のアミノ酸は、静電反発相互作用を最大化する正味の負電荷を帯びています[40、41、42]。酵母エキスからの生体分子はキャッピング剤として機能し、Ag NPの形成におけるサイズ分布、形状、および形態を制御する上で重要な役割を果たします。 pHの値は、研究におけるAgNPの制御された合成に影響を与える重要な要素です。 pH値が7未満の場合、核生成は低速で発生します。 Ag NPは、より高いpH値で数分で形成され、粒子サイズは溶液のpH値の増加とともに減少します。成長過程と核形成の間で最適なバランスが実証されました[43]。不安定で凝集したAgNPは、極端なpH値（> 11）の溶液の還元プロセスで常に発生します[44]。

抗菌作用

E。コリ AgNPの抗菌活性について広く評価されています。 Eの成長。コリ Ag NPの存在下または非存在下で、抗菌能力が証明されます。図６ａに示されるように、合成されたＡｇ ＮＰは、Ｅに対して濃度依存的に有意な抗菌活性を示した。コリ 。成長阻害アッセイは、 Eの完全な減少を示した。コリ ネガティブコントロールと比較して、20.0μg/ mLを超えるAgNP濃度で。最小発育阻止濃度（EC ₅₀ ）のAgNPは13.4μg/ mLでした。 20.0μg/ mLのAgNPの用量は、 Eに対して有意な抗菌効果を示しました。コリ テスト期間中、10.0μg/ mLのAgNPは部分的な阻害効果を示しました（図6b）。

a Eの成長阻害。コリ および b 抗菌効果の経時分析

Ag NPが抗生物質耐性菌細胞に実際に影響を与えるかどうかを調べるために、アンピシリン耐性 Eに対するAgNPの抗菌活性を評価しました。コリ コロニー形成単位アッセイによる。 E。コリ -アンプ ⁺ アンピシリン耐性を Eに付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子を含む高コピー数のpcDNA3.4プラスミドを安定して発現する。コリ [45] 。 E。コリ -アンプ ⁺ 細胞は、アンピシリン単独での処理またはAg NPとの併用処理で、LB寒天プレートで増殖させました。調製したAgNPの阻害活性を図7に示します。アンピシリンとの併用治療におけるAgNPは、アンピシリン単独と比較して優れた抗菌活性を示したことが注目されました。対照的に、アンピシリン単独の治療は、 Eに対する阻害活性を有さない。コリ -アンプ ⁺ 。抗生物質とAgNPの併用療法は、抗生物質耐性菌細胞を克服するための補完的な戦略を提供し、現在の治療アプローチをさらに改善します。この研究で提示された全体的な結果は、多剤耐性菌株によって引き起こされる細菌感染症を治療するための代替抗菌阻害剤の開発に貢献しています。

Eの成長。コリ -アンプ ⁺ アンピシリン単独（50μg/ mL）またはAg NPとの併用（25μg/ mL）での治療。 a 高密度で b Eの低密度。コリ -アンプ ⁺ セル

細菌耐性と戦うためのさまざまなメカニズムを備えた新薬が大いに必要とされています。 Ag NPは強力な抗菌作用があるため、医療製品、パーソナルケア製品、繊維製品に使用されています。 AgNPが微生物耐性と戦うメカニズムは複数あります[46]。 Ag NPは細菌の膜表面に蓄積し、細胞壁の透過性を高めます。 Ag NPとペプチドグリカンの相互作用により、ペプチドグリカンの構成が変化し、細菌の膜が損傷しました[47]。 Ag NPの形状、表面構造、形態、分散性、および生体適合性の特性は、抗菌活性に重要な役割を果たします。

結論

ここでは、酵母エキスを使用してAgNPsを調製するための新しい生合成法を報告します。 Ag ⁺ のときに形成される酵母ミセル 溶液を酵母エキスと混合した。生体還元生体分子は、Ag ⁺ の還元に大きな役割を果たします。 。さらに、生体分子は、合成されたAg NPに好ましい安定性、単分散性、および制御可能なサイズ分布を提供し、沈殿することなく1年以上にわたって良好な安定性を示します。高速アミノ酸分析により、酵母エキスはアミノ酸、α-リノレン酸、アミノ酪酸などの生体分子が豊富であることが明らかになりました。 Ａｇ ＮＰは、Ｅに対して濃度依存的に有意な抗菌活性を示した。コリ 。成長阻害アッセイは、 Eの完全な減少を示した。コリ 20.0μg/ mLを超えるAgNPの濃度で。アンピシリンとの併用治療におけるAgNPは、アンピシリン耐性 Eに対してアンピシリン単独と比較して優れた抗菌活性を示します。コリ （ E.coli -アンプ ⁺ ）セル。 Ag NPの表面コーティングは、細菌膜への親和性を高め、細胞壁の透過性を高めました。 Ag NPとペプチドグリカンの間の相互作用は、ペプチドグリカンの構成を変化させ、最終的に細菌のアポトーシスを引き起こしました。さらに、生体分子によって安定化されたこれらのAg NPは、Cos-7細胞に対して低い細胞毒性と良好な生体適合性を示しました。

データと資料の可用性

この現在の研究の結論を裏付けるデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

Ag NP：

銀ナノ粒子

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

E。コリ ：

大腸菌

EDS：

エネルギー分散型分光計

FBS：

ウシ胎児血清

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

HRTEM：

高分解能TEM

LB：

ルリア-ベルターニ

SAED：

制限視野回折

SEM：

走査型電子顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡

UV-Vis：

紫外可視

XRD：

X線粉末回折