配位子をドープしたオキソヒドロキシド銅ナノ粒子は効果的な抗菌剤です

背景

微生物感染は、世界中で何百万人もの死をもたらしています[1]。多くの場合、抗菌治療の非効率性は、従来の抗生物質に対する微生物の耐性が原因です[2、3、4、5]。このように、新しい抗菌剤が熱心に求められています。銅はその抗菌効果で長い間認識されており、細菌のタンパク質やDNAとの相互作用、活性酸素種（ROS）の生成など、細菌に対するさまざまなメカニズムを介して作用するように見えるため、標準的な抗生物質よりも臨床寿命が長い可能性があります。 、および膜の完全性の破壊[6、7]。同じ理由で、銅や他の金属に対する病原性細菌株の抗菌耐性の可能性は限られていることが示唆されています[7,8,9]。さらに、銅は比較的安価であり、微量レベルでのその必須性が厳格な恒常性制御の進化を確実にしているため、人体への毒性が低い[10,11,12]。したがって、主に病院や老人ホームなどのリスクの高い地域の表面での細菌性バイオフィルムの形成を回避するために、感染予防対策のためにこの金属が一般的に使用されています[13、14]。対照的に、銅は、広く使用されている銀とは異なり、局所抗菌製剤での有意な治療的使用は見出されていません[15]。

細菌は細胞内環境で銅の負荷を受けやすく、銅源の有効性は銅イオンを放出する能力に関連しています[16、17]。この点で、銅ベースの抗菌剤の重要な課題は、創傷滲出液などの液体への有効濃度の抗菌性銅の持続放出を可能にする濃縮製剤の達成です。これは、銅が加水分解性金属イオンであり、その濃度が典型的な局所製剤のpHで増加すると（つまり、中性に近い）、加水分解を誘発して不溶性のオキソ水酸化物を形成する傾向があるためです[18]。生理学的pHでは、これらのオキソ水酸化物は、可溶性の、またはしたがって潜在的に有効な銅イオンの放出に適した基質ではありません[16、19、20]。

最近、生物学的に利用可能な鉄サプリメントを見つける目的で、生理学的条件下での濃縮オキソ水酸化物源からの第二鉄イオンの効果的な放出の問題が、一次粒子の構造修飾によって解決された。その研究では、結晶をドーピングするGRAS配位子、すなわちアジピン酸と酒石酸の存在下で鉄を沈殿させ、最終的な第二鉄のオキソ水酸化物構造を意図的に不安定化しました。この戦略には、（a）オキソ水酸化物第二鉄粒子の不可逆的な凝集を防ぎ、（b）適切な生理学的条件下でそれらの不安定性（溶解性の容易さ）を大幅に高めるという利点がありました。この材料は「鉄[オキソ-]水酸化物アジペート酒石酸塩」またはIHATと呼ばれています[21、22]。類推により、ここでは、銅[オキソ-]水酸化物アジピン酸酒石酸塩（CHAT）を高濃度で合成および配合できるが、効果的な抗菌レベルで銅イオンを放出できるかどうかを検討しました。特に、この作業の目的は、以前に報告された材料とは異なり、シミュレートされた創傷環境で銅イオンの殺生物濃度を容易に放出する銅オキソ水酸化物ナノ粒子を生成する安価でスケーラブルな合成プロセスを開発することでした。

したがって、この研究では、CHATを合成し、生物学的に利用可能な銅を送達する能力、したがって抗菌活性を実証する能力を特徴づけました。 Escherichia coli の菌株に集中しました グラム陰性菌の「指標」種として[19、23]、さらに黄色ブドウ球菌に対する原理実証効果を実証しています。 、多剤耐性をしばしば得るグラム陽性菌として。したがって、この研究は、局所抗菌療法の臨床応用のためにCHATをさらに開発することの価値を評価することを目的としています。

メソッド

特に明記されていない限り、すべての実験は超高純度（UHP）水（逆浸透精製;18.2ΩM/ cm）を使用して室温（20±2°C）で実施され、すべての試薬はSigmaAldrichから購入しました。

銅の配合とCHATナノ粒子

塩化銅ストック（40 mM銅）は、CuCl ₂ を溶解して調製しました。 ・2H ₂ 水中のO。酸化銅ナノ粒子（CuO NPs; Sigma 544868）のストックは、不純物を含まず、一次粒子サイズが34 nm（10〜50 nmの範囲）で、抗菌剤として以前にテストされた市販の粉末から調製されました[24、 25,26]。これらのストックは、激しく攪拌しながら粉末を水に分散させることにより、1.3 g / Lの銅で調製されました。 CHATナノ粒子のコロイド懸濁液は、共沈法を使用して合成されました[27]。簡単に説明すると、塩化銅、酒石酸、アジピン酸を水に溶解して、最終懸濁液の銅/酒石酸/アジピン酸のモル比を2：1：1にし、銅濃度を2.5 g / Lにしました。混合物の初期pHは常に2.5未満であり、銅は完全に可溶化されていました。次に、pH 8.2±0.2になるまで絶えず攪拌しながらNaOHの濃縮溶液（5 M）を滴下することにより、pHをゆっくりと上げました。

銅含有量とCHAT懸濁液の相分布

コロイド懸濁液中の銅含有量は、誘導結合プラズマ発光分析（ICP-OES、Jobin Yvon 2000、Horiba）によって決定されました。すべてのサンプルは、5％HNO ₃ で100mg / L未満の濃度に希釈されました。 （ v / v ）銅の完全な溶解性を確保するために、分析の少なくとも24時間前。キャリブレーション標準（0.1〜100 mg / L銅）は、5％HNO ₃ でマトリックスマッチングされました 、および銅の定量化は324.754nmで実行されました。銅を凝集、ナノ粒子、および可溶性銅のパーセンテージに分別することは、CHATストックの濾過および限外濾過によって達成された。懸濁液をろ過し（200 nmカットオフ）、保持液を凝集画分と見なしました。可溶性銅を分離し、それをナノ粒子銅と区別するために、コロイド懸濁液を3 KDaフィルター（Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16,000× g ）で限外濾過しました。 、5分）。これは、1 nm未満のカットオフに対応します（Zetasizer Software 7.11、Malvern Instruments Ltd）。すべてのフラクション（合計、200 nmのろ液、3 KDaの限外ろ液）の銅含有量はICP-OESによって決定され、総銅含有量に対するパーセンテージで表されたフラクションは次のとおりです。

ドライチャットナノ粒子の銅含有量と銅と配位子の比率の決定

結合していない成分の回収と除去を可能にするために、CHATナノ粒子を凝集および沈殿させました。これを可能にするために、エタノールを2：1のエタノール/懸濁液（ v ）の比率でCHATのコロイド懸濁液（2.5 g / L銅）に添加しました。 / v ）、得られたCHAT凝集体を遠心分離（4500× g ）によって回収しました。 ミストラル6000で×15分）。非結合リガンド種を含む溶液相は廃棄された。固相CHAT中の銅含有量の測定は以下の通りであった。粉末は、エタノール沈殿ペレットを45°Cで恒量になるまでオーブン乾燥することによって生成されました。次にこれを粉砕し、35.2±0.3 mg（ n =2）11±1 gの70％HNO ₃ で消化しました 、正確な重みが記録されています。完全に消化されたら、この溶液を水で20倍に希釈し、銅濃度をICP-OESで測定しました。リガンドと銅の比率は、乾燥したエタノール沈殿したCHAT凝集体から直接決定しました。凝集体を最初に水に再懸濁して元の容量に戻し、少量のHClでの溶解を促進しました。これは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析の要件です。アリコートを5％HNO ₃ に溶解しました 銅のICP-OES分析（上記のとおり）または80 mM HClでのリガンド（酒石酸およびアジピン酸）のHPLC分析用。リガンド分析は、標準的な逆相クロマトグラフィーシステム（2998PDA検出器を備えたWatersAlliance 2690/5のC18カラム、詳細は追加ファイル1に記載されています）で実行されました。

CHATサスペンションの物理化学的特性

流体力学的粒子サイズ分布は、動的光散乱法（DLS; Zetasizer NanoZS、Malvern Instruments Ltd）によって決定されました。 CHATコロイド懸濁液のアリコート（2.5 g / L銅）を1 mLの使い捨てキュベットに移し、測定しました（ n =3）は25±2°Cで実施されました。繰り返しになりますが、正確な設定は追加ファイル2に示されています。CHAT懸濁液のゼータ電位は、使い捨ての折り畳まれたキャピラリーセル（DTS1070）を使用し、誘電率を78.5と仮定して、レーザードップラーマイクロ電気泳動（Zetasizer NanoZS、Malvern Instruments Ltd）によって決定されました。 0.89cPの粘度。透過型電子顕微鏡（TEM）の特性評価は、CHAT懸濁液の液滴を穴あきカーボン穴あきグリッドに適用し、50°Cで一晩乾燥させて実施しました。次に、グリッドをTEM（FEI-Philips CM100）で120kVの明視野モードで画像化しました。

銅製剤の抗菌活性

アッセイは、0.4％のグルコースと0.1％のカゼイン酸加水分解物を添加し、pHを7.2±0.2に調整した、認識されている金属イオン適合性媒体である重金属MOPS（HMM）培地（追加ファイル3）で実施しました[28]。 。銅化合物を添加する前に、 Escherichia coli （NCTC11100）および黄色ブドウ球菌 RN4220 [29]は、Infors HTMinitronインキュベーター内で80rpmで一定に振とうしながら、30°Cで一晩培養しました。その後、細菌懸濁液を0.05〜0.1の光学密度（約10 ⁶ ）に希釈しました。 Eの場合は595nmでcells / mL）。コリ（ Multiskan RC 351 Labsystem）または Sの場合は600nm。アウレウス （Multiskanプレートリーダー、ThermoFisher Scientific）。次に、塩化銅とコロイド状CHATのストックをHMMで希釈し、細菌懸濁液に加えて、最終的な銅濃度を0.4〜100 mg / Lにしました。その後、インキュベーションを6〜9時間行い、細菌バイオマスの尺度として光学密度を監視することにより、細菌の増殖を測定しました。

細菌増殖培地への経時的な銅の溶解度は、HMMの塩化銅とコロイド状CHATストックを12.5、25、および50 mg / Lの銅に希釈し、限外濾過によって0、2、4、および8時間での可溶性銅の割合を決定することによって決定されました。 （3 KDa）および上記のICP-OES分析。

銅製剤の細胞内バイオアベイラビリティ

組換え生物発光Cu感知細菌、 E。コリ MC1061（pSLcueR / pDNPcopAlux）は、生物発光を増加させることにより、毒性以下の量の生物学的に利用可能な銅に反応し、銅化合物の生物学的利用能を定量化するために使用されました[30]。抗菌活性アッセイで説明したように細菌懸濁液を調製し、96ウェルマイクロプレート上で塩化銅とCHAT（0〜50 mg / L銅）の一連の希釈液とともに4時間インキュベートしました。 Orion IIプレートルミノメーター（Berthold Detection Systems）を使用して生物発光を測定し、生物発光の誘導を次のように計算しました。

銅製剤によって誘発される細胞内ストレス

銅化合物が細胞内スーパーオキシドアニオンおよび一本鎖DNA切断を誘導する能力を、組換え生物発光細菌 Eで評価した。コリ K12 ::soxRSsodAluxおよび E。コリ それぞれMC1061（pDEWrecAlux）[17]。抗菌アッセイで説明したように細菌培養物を調製し、白い96ウェルマイクロプレート上で塩化銅とCHAT（0〜50 mg / L銅）の一連の希釈液に4時間にわたって細菌を曝露しました。バイオセンサーの性能は、 Eの陽性対照として、細菌をスーパーオキシドアニオン誘導化学メナジオン（0.04〜30μg / L）または過酸化水素（0.1〜150 mg / L）に曝露することによって制御されました。コリ K12 ::soxRSsodAluxまたは E。コリ それぞれMC1061（pDEWrecAlux）。この場合も、細菌を白色の96ウェルマイクロプレート上でインキュベートし、生​​物発光をOrion IIプレートルミノメーターで測定し、生物発光の誘導を式（1）のように計算しました。 5.

ヒドロキシエチルセルロースゲルへの銅配合物の組み込み

塩化銅、CHAT、および市販の未修飾の酸化銅ナノ粒子（CuO NP）のストックを、UHP水で250 mg / Lの銅に希釈しました。得られたCHATおよびCuONPの懸濁液は、ほぼ中性のpHであり、ゲルに直接組み込むことができましたが、塩化銅溶液は希釈後も酸性であったため、pH7.0±0.2に調整しました。次に、ヒドロキシエチルセルロース（HEC）を直接溶解しました（2％ w / v ）均一なゲルが形成されるまで、ローラーミキサー（Denley Spiramix 5）を使用してさまざまな希釈ストックに入れます。各ゲル10グラムをファルコンチューブに移し、一晩静置しました。次に、新たに調製した50 mM重炭酸ナトリウムバッファー（NaHCO ₃ から溶解）10mLを使用します。 粉末をpH7.0±0.2に調整して、ゲルと液体の界面（比表面積7.1 cm ² ）での乱れを最小限に抑えるように注意して各チューブに移しました。 ）。次に、アリコートを収集し、ICP-OESで分析して、経時的な銅の放出を測定しました。

結果

「方法」のセクションで説明したように、CHATは、鉄の類似体であるIHAT [21、22]と同様の方法で、銅オキソ水酸化物（2.5 g / L銅）に酒石酸とアジピン酸をドープすることによって合成されました。これにより、すべての銅が200 nmフィルターを通過したが、3 KDaフィルターを通過した銅はごくわずか（5％）である安定したコロイド懸濁液が生成されました。これは、ほとんどの銅がナノ粒子（95％、図1a）であり、「遊離」銅がほとんどなく、検出可能な大きな凝集体がないことを示しています。これもIHATアナログのようです[21、22]。エタノールで沈殿させ、結合していないリガンド種を除去してから乾燥させた場合、CHATには31±1％の銅が含まれていました（ w / w ）ICP-OES分析による。後者はＨＰＬＣによって決定された銅対配位子のモル比は、銅対酒石酸塩については２：１であり、銅対アジピン酸塩については２：０．３であった。 CHAT粒子は、TEMイメージングにより、直径2〜3 nmでほぼ単分散に見えました（図1b）。これらの調査結果は、UHP水中の体積の中央値が3.4 nmであり（図1c）、サイズ分布が狭い（体積の80％で2.4〜5.6 nm）ため、CHATと水和シェルの流体力学的サイジングデータと一致していました。動的光散乱で評価。平均ゼータ電位は-39mVであり（図1d）、安定したアクア分散液を形成するナノ粒子と一致しており[27]、実際、CHATストック懸濁液は数年間安定していることが示されました（追加ファイル4）。

CHATストック溶液の特性評価。 a 2.5 g / Lチャットでの銅相分布：可溶性（<3 KDa）およびナノ粒子の割合。 b TEMによるナノ粒子分散イメージング。 c 動的光散乱によって決定された、新たに調製された粒子の流体力学的粒子サイズ分布。 d ゼータ電位分布（ n =3;エラーバーは標準偏差を表します）

次に、ストック懸濁液を細菌増殖培地で銅塩の抗菌活性に関連する濃度に希釈したときのCHATの抗菌活性を検討しました。 CHATと塩化銅の場合、成長阻害曲線は両方の Eで非常に類似していた。コリ および S。アウレウス ほとんどの活動は、12.5〜50 mg / Lの範囲の総銅濃度で発生します（図2）。 Eを完了します。コリ 18.8（CuCl ₂ ）とのインキュベーションで成長阻害が観察された ）および25（CHAT）mg / L銅、 Sの場合。アウレウス 、完全な成長阻害は75（CuCl ₂ ）および100（CHAT）mg / L銅（図2;成長阻害率と銅濃度の関係は追加ファイル5に記載されています）。

大腸菌 （上）および黄色ブドウ球菌 （下）補足されたHMMでさまざまな濃度の塩化銅（左）またはCHAT（右）にさらされたときの、ここでは光学密度として表される成長曲線。

実際、これらの抗菌濃度では、CHATの少なくとも94％が急速に可溶化されました（15分以内）。これも限外ろ過とICP-OES分析で判断されます（図3a）。したがって、CHATの抗菌効果は、ナノ粒子の急速な溶解により銅イオンの細胞内細菌獲得を可能にすることで、この化学的不安定性に関連していると予想しました。これをテストするために、Cuセンシング Eに挑戦しました。コリ 、MC1061（pSLcueR / pDNPcopAlux）。CHATまたは塩化銅として0〜50 mg / Lの銅を使用し、細胞内銅イオンの亜毒性濃度に応じて生物発光が増加します[30]。両方の銅源の培地中の濃度を増加させると、 Eの生物発光が増加した。コリ 銅センサーひずみ（図3b）、細胞内銅の上昇と一致。用量反応曲線の傾きは、両方の銅源で最大6.25 mg / Lと同じであり、CHATからの生物学的に利用可能な銅が完全に可溶化された銅源に匹敵することを確認しました。その後、最大50 mg / Lの銅の濃度では、両方の銅化合物の毒性のために発光は増加しませんでした（図3b）。

a 12.5、25、および50 mg / Lの銅で補足されたHMMでのCHATの溶解プロファイル。組換え発光バクテリアの生物発光誘導の用量反応： b 細胞内銅イオン応答 E。コリ MC1061 pSLcueR / pDNPcopAluxバクテリア、 c DNA損傷に対応する E。コリ MC1061（pDEWrecAlux）、および d スーパーオキシドアニオン応答性 E。コリ K12 ::soxRSsodAluxは、塩化銅、CHAT（mg Cu / Lでの濃度）、およびそれぞれのコントロール（ c でのメナジオン）に補足されたHMMで4時間曝露されたとき およびH ₂ O ₂ d で ）

Eでの細胞内銅の研究と並行して。コリ CHATまたは塩化銅で調製された溶液にさらされた場合、これらの溶液が細胞内スーパーオキシドアニオンを誘発したり、さまざまな Eで細菌のDNA損傷を引き起こしたりする能力もテストしました。コリ ベースのバイオセンサー。どちらの場合も、センサーが関連するポジティブコントロール、つまりそれぞれ過酸化水素とメナジオンに反応したにもかかわらず、有意に観察可能な効果はありませんでした（図3c、d）。まとめると、異なる化学形態の銅から調製された溶液に対する3つの細菌バイオセンサーの同等の応答は、どちらの場合も、1つの製剤がナノ粒子として始まったにもかかわらず、細菌が同じ可溶性銅にさらされていたという概念を強く支持します。

最後に、上記のように、可溶性銅塩に対するCHATの利点は、濃縮製剤が後者とは異なり、前者がその化学的不安定性を保持できる場合にのみ明らかになります。局所製剤の一般的な水性ベースであるヒドロキシエチルセルロース（HEC）[31,32,33]を使用して、塩化銅、CHAT、または市販のCuONPとして250mg / Lの銅を組み込みました。 50 mM NaHCO ₃ が10mLの場合 単純化された創傷滲出液としてのバッファーを、銅を組み込んだ各HECゲル（つまり、2.5 mgの銅）の10 gに追加すると、CHATを含む調製物からの銅の持続放出が60 mg / Lを超えました。 24時間（図4）。さらに、放出は比較的迅速で、抗菌活性濃度は2〜4時間で達成されました。対照的に、pHで中和された塩化銅は、加水分解して銅オキソ水酸化物の凝集体を形成する傾向から予想されるように、銅放出の基質としては不十分でした。そのため、24時間までに、溶液中で達成された銅はわずか10±7 mg / Lでした。 （図4）。市販のCuONPは、認識できる銅の放出をまったくもたらしませんでした（図4）。

CHAT、塩化銅、または酸化銅ナノ粒子（CuO NP）を含むHECマトリックスからの銅の放出、すべて250 mg / L銅

ディスカッション

ここでは、銅ベースのナノ材料、つまりCHATが、前述の銅ベースのナノ粒子[34、35]とは異なり、抗菌効果のある生体利用可能な銅の不安定な供給源としての特性を維持しながら、高濃度で処方できることを示します。上記のように、CHATの合成は、鉄の類似体であるIHATに関する長年の研究[21、22]に続いて着想を得ました。これは、次に、必須金属イオンの効率的なリサイクルのための、生体内での迅速なミネラル代謝回転に対する自然の解決策に触発されました。これにより、有機分子が一次ミネラル粒子の結晶構造を不安定化するために使用されます[21、22]。合成バージョンでは、GRAS配位子は、架橋ポリマーから溶液中で形成されるときに金属オキソ水酸化物に組み込まれます[21、22]。構造の不安定化により、これは最終的な鉱物相の不安定性を保証し、ゼータ電位測定によって示されるように、凝集と凝集をはじく非常に負のナノ粒子を生成し、したがって何年も安定したナノ粒子懸濁液を生成します。ここで、そして以前にIHATについて示したように、酒石酸塩は、銅オキソ水酸化物構造へのこれらの物理化学的変化を達成する上での主要な配位子でした。アジピン酸塩の3倍の大きさで、後者は合成中の緩衝液としてより多くの挙動を示します[21、22]。

修飾がない場合、新たに沈殿した金属オキソ水酸化物は凝集して凝集し、老化を開始します。これにより、凝縮して結晶化度が徐々に増加します。これらのサイズと鉱物の相転移は、構造が逆反応に関与する能力、つまり再溶解する能力を低下させます。したがって、塩化銅溶液のpH中和から酸化銅オキソ水酸化物が新たに形成された場合、ゲル放出アッセイで少なくとも一部の可溶性銅が放出されたのは当然のことでした（図4）。凝集し、より凝縮した鉱物相（すなわち酸化銅）を含み、検出できない銅が放出された。市販の30nmナノ粒子からの溶解がないことは、凝集状態に関係なく、溶解のための大きな表面積を示していたはずですが、鉱物相が銅イオンの放出の重要な推進力であり、上記のように修飾されていることを示しています。ここでリガンドドーピングによって達成される鉱物の一次粒子の分析は、溶解特性に著しい変化をもたらすために実際に必要です。さらに、CHATの合成は室温で実施されました。これは、合成温度が高いとアモルファス相が少なくなり、その結果、溶解速度が低下する可能性があるためです。また、室温合成には、大規模な製造時にエネルギーコストを削減できるという利点があります。

必要に応じてイオンの徐放と迅速な溶解を可能にする高濃度の銅を処方する他の方法があるかもしれませんが、これほど簡単で商品のコスト（反応物の場合）が非常に低い別の合成を想定することはできません。局所感染と細菌耐性の問題は決して先進国に限定されていないため、これらは重要な要素です。発展途上国は細菌耐性の問題にますます悩まされているため、手頃な価格の効果的な解決策が緊急に必要とされています[36、37]。具体的な解決策に到達するための研究は不十分ですが、有毒な金属イオンに対する耐性は、従来の抗生物質に対する耐性よりも細菌が達成するのが難しいという証拠があります[7]。この理論は、銅と銀にはおそらく抗菌活性の個別の経路がないが、さまざまな酵素システムを含む複数の標的に影響を与え、細菌の細胞構造全体を不安定にする可能性があるという考えに基づいています[17、19、38]。実際、何世紀にもわたって曝露されたにもかかわらず、バクテリアは銅や他の特定の金属イオンの影響を受けやすいままであることが示されています[6、7、39]。興味深いことに、金属ベースの抗菌薬は、以前の耐性にもかかわらず、従来の抗生物質に対して細菌の感受性を戻すことさえできるという最近の証拠があります[40、41]。

結論

ここでは、以前に鉄類似体に利用されていたのと同様の戦略で、銅ナノミネラルに有機酸をドープすることにより、生理学的pHおよび高濃度での生物学的に利用可能な銅イオンの問題を解決できることを示しました[21、22]。これらの銅ベースのナノ粒子（CHATと呼ばれる）は細菌培地に容易に溶解し、可溶性銅塩と同等の細胞内銅取り込みと抗菌活性を示します。ただし、重要なことに、単純な銅塩とは異なり、CHATはpH中性の製剤に濃縮でき、銅イオンの放出に関してその不安定性を維持できます。確かに、CHATは殺菌範囲内で銅イオンを放出し、したがって、単独で、または抗生物質に抵抗する効果を高める、新規の局所抗菌剤の基礎となる可能性があります。抗生物質耐性の増加に伴い、新しい局所抗菌剤が必要になり、CHATは安価で、容易に合成され、一般に安全と認められている成分（GRAS）を使用しています。インビボ研究にはメリットがあります。

略語

チャット：

銅[oxo]-水酸化物アジピン酸酒石酸ナノ粒子

CuO NP：

酸化銅ナノ粒子

DLS：

動的光散乱

Escherichia coli ：

E。コリ

GRAS：

一般的に安全と認められている

HEC：

ヒドロキシエチルセルロース

HMM：

ヘビーメタルMOPSミディアム

HPLC：

高速液体クロマトグラフィー

ICP-OES：

誘導結合プラズマ発光分光法

IHAT：

鉄[oxo]-水酸化物アジピン酸酒石酸ナノ粒子

MOPS：

3-（ N -モルホリン）プロパンスルホン酸

黄色ブドウ球菌 ：

S。アウレウス

UHP：

超高純度