ルメックス・ヒメノセパルス根エキスで合成した生成Au@Agコアシェルナノ粒子の抗菌応用

概要

本研究では、金-銀二金属ナノ粒子のコア@シェル構造（Au@AgNPs）を逐次合成法で作製しました。カテキンとスチルベンを高含有するRumex hymenosepalus根エキス（Rh）を還元剤として用いました。透過型電子顕微鏡（TEM）によるサイズ分布は、Au@AgNPsで平均36±11 nm、金ナノ粒子（AuNPs）で24±4 nm、銀ナノ粒子（AgNPs）で13±3 nmでした。形状は主に準球形。AuNPs上の銀シェル厚は約6 nmで、表面は生物活性分子で覆われています。ナノ粒子キャラクタリゼーションには、高角環状暗視野像（HAADF-STEM）、エネルギー分散型X線分光（EDS）、X線回折（XRD）、UV-Vis分光、ゼータ電位、動的光散乱（DLS）、フーリエ変換赤外分光（FTIR）、X線光電子分光（XPS）を用いました。FTIRとXPSでナノ粒子がエキス分子により安定化されていることを確認。ゴンペルツモデルを用いた微生物増殖キネティクス解析により、AgNPsとAu@AgNPsがEscherichia coliとCandida albicansの遅延期と増殖率に用量依存的に影響し、Au@AgNPsの方が優れた応答を示すことが明らかになりました。

はじめに

過去25年間でナノ材料合成の化学的手法が多数研究されてきましたが、多くは環境負荷の高い物質、高温、高価な装置を必要とします。本研究ではグリーン合成法を用いて金-銀ナノ構造を合成しました。この手法は当初から汚染を最小限に抑え、「クリーン」なプロセスで廃棄物と有害物質を回避し、健康や環境に脅威を与えない「クリーン」なナノ材料を開発します。

金属ナノ粒子のグリーン合成は、生物システムとの相互作用に良い影響を与えることを目指します。ナノ粒子とポリフェノール分子の自己機能化が、細胞やマクロ分子などの生物システムと適合する生物学的相互作用を生み出します。これらは一般に、がん、糖尿病、神経変性疾患などのナノメディシンとして利用されます。銀シェルとAuNPsコアのコアシェルシステムは、光学診断センサー、分子センサー、光熱療法、抗菌剤、触媒プロセス改良など、単金属NPsに比べて多様な応用があります。

二金属合成には逐次法や同時法、超音波噴霧熱分解、ソノケミカル法、マイクロ流体チップ、逐次ナノ流体ナノ沈殿、マイクロエマルション、リポソームなどが用いられ、還元剤は化学的またはグリーン化学的タイプがあります。ドライ材料（金属酸化物、カーボンナノチューブ、印刷ソフトエレクトロニクス）やウェットナノ粒子（生物システム用、薬物担体、抗菌、センシング、計算ナノテクノロジー）として応用されます。

Khatamiらは植物を用いたコア@シェル型ナノ粒子のグリーン合成をレビューし、Antigonon leptopus、Diospyros kaki、Azadirachta indicaなどでAu@Agナノ粒子（5-500 nm）を合成し非抗菌用途で試験、Asparagus racemosus根エキスでAu-Ag合金ナノ粒子を合成し、E. coli、B. subtilis、K. pneumoniae、P. aeruginosa、S. aureusでMIC 480 µg/mLを報告。化学合成Au@Ag NPsの抗菌MICは銀含有量で約2.5 µg/mL、LuらはNaBH₄とバンコマイシン併用でAu/AgNPs@Vanを調製し、二金属ナノ粒子で60 nmol/mLのMICをグラム陽性/陰性菌で報告しています。

二金属ナノ材料の抗菌特性はAg濃度関数として向上、Au濃度増加は抗菌性を低下させるが細胞毒性を軽減し生体適合性を高めます。単金属材料と比較し、二金属材料には相乗効果と二機能効果が存在することが示されています。ナノ材料機能化は化学環境（pH、硫黄存在、生体適合分子等）が細胞や微生物との相互作用に影響するため重要で、グリーンケミストリーによる生体材料生成が強調されています。二金属粒子の化学組成は単金属ナノ構造の相乗効果により光学特性を決定づけます。

本研究では、スチルベンとカテキンを含み強力な抗酸化作用で金属イオンを還元するRumex hymenosepalusエキスを還元剤として金と銀ナノ粒子を合成しました。AuNPsを核として逐次合成法でAu@Agコア@シェル型二金属ナノ粒子を得ました。ナノ材料キャラクタリゼーションにはHAADF-STEM、EDS付きTEM、HRTEMを用いました。合成した各種ナノ粒子を用い、E. coli、S. aureus、Candida albicansの増殖動力学比較研究を実施しました。

実験セクション

材料

Rumex hymenosepalus根を地元業者から入手。前駆体HAuCl₄とAgNO₃（99%純度）はSigma-Aldrichから購入。微生物アッセイ用のBHIブイヨンとPDBはSigma-Aldrichから。ナノ粒子洗浄用エタノール（99%）はFermontから、超純水（ミリQ）を実験に使用。

Rumex hymenosepalusエキス調製

根150 gをスライスし脱水後、エタノール/水（70/30 V/V）1000 mLでマセラシオン。室温、遮光下、密閉ガラス容器で21日間、吸光度変化がなくなるまで実施。ワットマン濾紙（8 µm、2 µm）とアクロディスクフィルター（0.22 µm）で逐次濾過。ロータリーエバポレーターでエタノール除去後、水性エキス濃縮液を-80 ℃で凍結乾燥（Labconco FreeZone 1L）。得られた粉末を遮光下、室温で無菌容器に保存。

AuNPs合成

凍結乾燥エキスから10 mg/mL水溶液調製。16 mLエキス溶液に32 mL超純水を加え、1000 rpm撹拌下でHAuCl₄（0.01 M）16 mLを徐々に添加。室温、室内照明下で1時間反応。表面プラズモン共鳴（λ_SPR=540 nm）強度をUV-Vis分光で経時監視、変化なしで合成完了と判断。12,000 rpm遠心分離、上清を超純水に置換、1時間超音波処理で再分散。計3回繰返し（最初2回は水、最後はエタノール）。エタノール分散液を遠心分離、沈殿を40 ℃対流オーブンで乾燥、2300 µg/mL水性分散液を調製。

Au@AgNPs合成

AuNPs水性分散液（2300 µg/mL）2 mL、AgNO₃（0.1 M）0.8 mL、Rumex hymenosepalus溶液（10 mg/mL）0.8 mLを無菌ガラス培養チューブに混合。超音波洗浄機（Branson 2510）で3時間ソニケーション。12,000 rpm、1時間遠心分離、固形分を超純水でソニケーション再分散し、1000 µg/mL濃度調製。

AgNPs合成

エキス溶液（10 mg/mL）16 mLに超純水64 mL、AgNO₃（0.1 M）8 mLを混合。室温（25 ℃）、室内照明下で1時間反応。表面プラズモン共鳴（λ_SPR^Ag=440 nm）をUV-Visで経時監視。遠心分離、上清置換、超音波処理をAuNPsと同様に3回繰返し、最後にエタノール分散液を遠心分離、沈殿乾燥後、超純水でソニケーション再分散し2000 µg/mLコロイド分散液調製。

キャラクタリゼーション

UV-Vis吸収スペクトルはPerkinElmer Lambda 45二光束分光計で測定（スリット0.5 nm、480 nm/min、200-900 nm）。ナノ粒子50 µL、エキス5 µLを用い、最終体積3 mL（超純水溶媒）。ゼータ電位はZetasizer-Nano ZS（Malvern）で25 ℃、三重測定、濃度1、10、50、100 µg/mLで実施。DLSも同装置（633 nm He-Neレーザー）で同条件測定。ポリ分散指数（PDI）はMalvernソフトで (σ/D̄)² から算出。PDI ≤0.10で高単分散とみなす。

タウプロットで光学バンドギャップE_gを算出（補足図S2）。半導体伝導帯E_g<3 eV（Ge <0.7 eV、Si=1.1 eV）。本研究ではAu@AgNPs 1.93 eV、AuNPs 2.03 eV、AgNPs 2.33 eVで、量子閉じ込め効果によるバンドギャップ拡大を示し、センサー、電池、光電子デバイス応用可能。

FTIR（PerkinElmer Spectrum Two、分解能4 cm^-1、16スキャン、4000-900 cm^-1）でAgNPs、AuNPs、Au@AgNPs、Rhを分析。XPS（PerkinElmer PHI 5100、Mg/Al二重源、300 W、15 kV、Mg Kα 1253.6 eV、真空2×10^-9 Torr）で酸化状態解析。サンプルはカバースリップに薄膜形成後測定。

HAADF-STEM（JEOL JEM-ARM200、200 kV、CEOS補正器、40 µmコンデンサーレンズアパーチャー、32-36 mrad収束角、9 pAスポットサイズ）でZコントラスト像取得。TEM（Jeol 2010F、1.9 Å分解能、200 kV）とEDS（QUANTAX 200-TEM、XFlash 4010）で形態と元素分析。HRTEM（>100,000倍）で格子間隔測定（Digital Micrograph 3.0）。XRD（Bruker D8 QUEST、Cu Kα、λ=1.54178 Å、300 K、ω/φスキャン）で相同定（High Score Plus、ICSDデータベース）。

抗菌活性アッセイ

試験菌：Escherichia coli（ATCC 25922）、Staphylococcus aureus（ATCC 5538P）、Candida albicans（尿路感染症患者尿から分離、ヘルシンキ宣言準拠）。BHIとPDBで一晩培養（37 ℃）、OD540 nm（細菌）、OD600 nm（酵母）でCFU/mL算出。96ウェルプレートで液体培地にナノ粒子と微生物を添加、37 ℃で培養。三重測定。Synergy HTX Biotekマルチモードプレートリーダー（Gen5ソフト）で吸光度測定。増殖曲線はOriginLab 8.0で作成。各ウェルに70 µL培地+ナノ粒子、30 µL菌液を添加、総量100 µL。15分間隔で円盤振盪しながら37 ℃、24時間培養、OD測定で増殖速度算出。

ゴンペルツモデルによる増殖曲線解析

微生物増殖はゴンペルツモデルでよく記述され、適応期（遅延期）と増殖率という2重要パラメータが得られます。遅延期の挙動研究は、微生物の治療適応応答や耐性発現示唆に有用です。修正ゴンペルツモデル（Zwieteringら、Liららによる適応）を用い、

y = A exp{ -exp[ (μe/A)(λ - t) + 1 ] }

で増殖曲線をフィッティング。Aは細胞数（OD₅₄₀またはOD₆₀₀）、μは指数期増殖率、λは遅延期。Origin 9.1でフィッティングし、AuNPs、AgNPs、Au@AgNPsのS. aureus、E. coli、C. albicansへの影響を解析。

E. coli、S. aureus、C. albicans増殖へのナノ粒子影響

各菌を一晩培養後、吸光度調整（E. coli 1、S. aureus 0.7、C. albicans 1、λ=540 nm）。ナノ粒子を50 µg/mLに調整。96ウェルプレートで培養液とナノ粒子を7:3比で混合（最終200 µL/ウェル）。滅菌水を対照、培地のみとナノ粒子のみも対照として用意。1、7、13、19時間後にサンプリング、生理食塩水で1:10希釈系列、ミューラー・ヒントン寒天平板に塗布、36 ℃、24時間培養後CFU/mL直接計数。

最小殺菌濃度（MBC）決定

各菌をミューラー・ヒントンブイヨンで一晩培養、0.5マクファーランド基準に調整。マイクロディリューション法でMIC決定。96ウェルプレートに調整菌液160 µLを5ウェル分注。AuNPs、AgNPs、Au@AgNPs 1000 µg/mL調製液から750、500、250 µg/mL調製。滅菌水を0 µg/mLとし、各濃度40 µLを菌液160 µLに添加し最終濃度200、150、100、50、0 µg/mLで暴露。36 ℃、24時間培養後、各ウェルサンプルを寒天平板塗布、同条件培養。増殖シグナルなしの濃度をMBCとして記録。

結果と考察

キャラクタリゼーション

UV-Vis吸収スペクトル（図1a）で各ナノ粒子系の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）最大値で正規化。Au@AgNPsは474 nmに単一バンドを示し、AgNPs LSPR（445 nm）とAuNPs LSPR（544 nm）の間に位置。Au@AgNPsにAu様吸収ピークがないことは、逐次合成でコア@シェル構造が得られたことを示唆。一部報告ではシェル厚3-4 nmで二重バンド、厚い場合は単一バンドになるとされています。Samalらの報告（Auコア32 nm、Agシェル>15 nmで単一バンド~450 nm、Au表面プラズモン抑制）と一致。

280 nm付近の吸収（青色領域）はRumex hymenosepalusエキス由来分子に対応（補足図S1）。278 nm特徴バンドは芳香環-カルボニル共役ポリフェノール化合物の電子遷移に由来。ナノ粒子スペクトルにこのバンドが見られることは、エキス分子が最終生成物に残存し安定化していることを示す。Rivero-CruzらはR. hymenosepalusから4スチルベノイド、2フラバン-3-オール、3アントラキノンを分離、Rodríguez-LeónらはNMRでスチルベン配糖体、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート（EGCG）を同定。これらが還元剤として参加し、フェノール-OH脱プロトン化でC=O形成、ポリフェノール酸化で放出電子がAg⁺/Au³⁺をAu⁰/Ag⁰に還元。

ゼータ電位（図1b）：全濃度範囲で-30 mVより負、100 µg/mLでAuNPsとAu@AgNPs -40 mV、AgNPs -38 mV。高負値は粒子間反発を示し凝集防止とコロイド長期安定性を意味。UV-Vis結果と相関し、エキスポリフェノール分子のナノ粒子表面複合化によるものと推察。

DLSとPDI（図1c, d）：生物応用には単分散サイズが望ましい。Au@AgNPs平均径約250 nm、濃度非依存。AuNPs約122 nm、AgNPs約135 nmも同様。PDIは単金属約0.3、Au@AgNPs約0.2。サイズが濃度非依存で中程度のポリ分散性（0.2-0.3）を示し、良好な安定性。

XPSとFTIRで有機化合物存在確認（図2）。サーベイスペクトルで全ナノ粒子系にエキス由来の炭素（C 1s、284.6 eV）と酸素（O 1s、532.2 eV）信号観察（図2a）。高分解能XPSで銀と金の酸化状態解析（補足図S3）。AgNPs：373.76 eVと367.76 eV（ΔBE=6.0 eV）でAg⁰確認。AuNPs：4f_7/2 83.98 eV、4f_5/2 87.65 eV（ΔBE=3.67 eV、強度比正常）でAu³⁺が完全還元されAu⁰に。Au@AgNPsでも単金属と同様の振る舞い、コア@シェルで両金属がゼロ価。

FTIR（図2b）：3296 cm^-1（OH）、2974 cm^-1（芳香環C-H）、1689 cm^-1（C=O伸縮）、1689-1400 cm^-1（カルボキシレートC-O、C-C伸縮）、1212 cm^-1（フェノールC-O伸縮、AuNPsと共役）、1049 cm^-1（カテキンエステルC-O）、799 cm^-1（フェノール面外曲げ）、レスベラトール由来964.4と829.39 cm^-1がエキスで1031と867 cm^-1にシフト、ナノ粒子でもシフト観察されポリフェノール分子のナノ粒子複合化を示唆。

STEM像（図3）：低倍率（100 nmスケール）で凝集なし、準球形Au@AgNPs観察（図3a）。HAADF暗視野（図3b）でコア@シェル構造明確、Auコア（原子番号大）がAgシェルより強いコントラスト。高倍率（20 nm、図3c, d）で明確なAuコアと薄いAgシェル、シェル厚3-5 nm変動。補足図S4でAgシェル均一性確認。

TEMとサイズ分布（図4）：AuNPs（図4a, b）、AgNPs（図4c, d）、Au@AgNPs（図4e, f）全て球状で良好分離。エキス分子がスペーサーとして作用。500粒子（15-20視野）からヒストグラム作成、ガウス分布。平均サイズ：AuNPs 24±4 nm、AgNPs 13±3 nm、Au@AgNPs 36±11 nm。DLSとTEMの差は、DLSが金属+水和層+溶媒、TEMが乾燥金属のみを測定するため。DLSでは複合化分子（分散剤）がサイズ測定誤差を生じ高値傾向。

HAADF-HRTEM（図5）：単一Au@AgNPsでAu核とAgシェル明確に区別（図5a）。赤枠領域拡大でシェル部分HRTEM（図5b）、FFT像（図5c）、逆FFT像で面間隔2.3 Å、2.0 Å、1.4 Å推定（図5d）。これらは面心立方（fcc）Agの(111)、(200)、(220)面に対応（ICSD、JEMSデータベース）。単金属NPsもfcc構造（補足図S5, S6）。

EDS分析（図6）：Au@AgNPs群でAg 77 at%、Au 23 at%（図6a, b）。単一粒子でAg 80 at%、Au 20 at%（図6c, d）。準球形近似で原子含有率推定：AuNPs平均径24 nmでコア体積、Au@AgNPs平均径36 nmでコアシェル体積、シェル体積=差分。fcc構造（単位格子4原子）、Au格子定数4.0783 Å、Ag 4.0862 Åで原子含有率計算：Ag 70%、Au 30%。EDS測定値と10%差。図7でシェル厚増加に伴う原子含有率変化示す（Auコア径24 nm固定）。Au@AgNPs径>30.2 nmでAg原子含有率がAu超過。補足で詳細計算、他コア径でも推定（補足図S7A-B）。

XRDパターン（図8）：全試料fcc結晶構造。Au@AgNPsピーク：2θ=38.25°、44.4°、64.9°、77.85°、81.25°。AuNPsとAgNPsピークも同位置±0.5°。AuとAgの格子定数極めて類似のためfcc回折パターンほぼ同一。JCPDS 4-0783（Au）、4-0784（Ag）に基づき(111)、(200)、(220)、(311)、(222)面に帰属。

抗菌活性

単金属（AgNPs、AuNPs）と二金属（Au@AgNPs）を1、10、50、100 µg/mLで試験。対象微生物：酵母Candida albicans、グラム陽性S. aureus、グラム陰性E. coli。24時間増殖キネティクス曲線（図9）。

Candida albicans

AuNPsは10時間まで影響なし（図9a）、50 µg/mL以上で10時間以降急峻な負傾斜、24時間で45%減少、抗真菌効果示唆。AuNPsが真菌関連タンパク質（H⁺-ATPase等）と相互作用しプロトンポンプ阻害、栄養取り込み不能で死滅させると推察。AgNPs（図9b）とAu@AgNPs（図9c）は10 µg/mLからC. albicans増殖抑制。用量反応曲線（補足図S8）からMIC₅₀推定：AgNPs 2.21 µg/mL、Au@AgNPs 2.37 µg/mL。しかしEDS結果（図6b）でAu@AgNPs銀含有量64.85質量%のため、Au@AgNPsのMIC₅₀における実効銀濃度は1.53 µg/mLでAgNPsより30%低い。PadmosらはAgNPsが重要抗菌特性持つが哺乳類細胞に細胞毒性、二金属ナノ粒子（特にAuコア）で軽減可能と報告。

Escherichia coli

AuNPsは有意な抑制（<15%）なし、増殖キネティクス不変（図9d）。AgNPs（図9e）は低濃度で遅延期不変だが増殖率低下（傾斜減少）。50 µg/mLで遅延期16時間まで延長、24時間生存率最大20%。100 µg/mLで明確な増殖相分離観察されず。Au@AgNPs（図9f）は最初2濃度で増殖相不変だが対照比2時間位相遅延。50 µg/mLで遅延期21時間まで延長、100 µg/mLで明確な増殖挙動なし。

Staphylococcus aureus

50 µg/mLでAu（図9g）、Ag（図9h）、Au@AgNPs（図9i）の遅延期再増殖比較（12時間後）。100 µg/mLで全材料が増殖完全抑制。1、10 µg/mLでも対照比傾斜変化観察。AuNPsとグラム陽性菌の相互作用は帯電表面による静電的相互作用で膜構造不安定化と推察。パイナップル果実エキス合成AuNPsやスピルリナ蛋白合成AuNPsで類似結果（より高濃度必要）。YangらはS. aureusでMIC>500 µg/mL報告、本AuNPsは10倍低濃度で抑制、ポリフェノール分子の表面コーティング/安定化とのクリティカルな相乗効果存在。ROS生成強度：AuNPs<ポリフェノールS. aureus抗菌応答促進が最も妥当機構。Pendersらも250-500 µg/mL AuNPsでS. aureus遅延期延長と抗菌効果報告。

AgNPsによる抑制は、NPs表面電荷促進の静電的相互作用による細菌膜への蓄積・浸透・損傷と推察。E. coliバイオフィルムとAgNPs相互作用で記述された機構と類似。Au@AgNPs結果は他研究グループ報告と比較可能。異なる著者は微生物増殖抑制がシェル厚に直接関連と示唆。コアシェルNPsはNIH-3T3線維芽細胞（正常哺乳類細胞）で低細胞毒性。Agシェル内Ag割合低くてもAgNPsと類似結果、Auコアが抗菌効果増強し細胞毒性最小化。

修正ゴンペルツモデルによる増殖曲線解析

増殖率（μ）と遅延期（λ）の定量的変化を知るため、ナノ材料暴露増殖曲線（図10）をゴンペルツモデル（式2）でフィッティング。

図10a：全ナノ材料でS. aureus増殖率が濃度依存的に低下、AuNPsでやや高感受性。50 µg/mLで対照比30%増殖率、100 µg/mLで全材料増殖抑制。図10b：S. aureus遅延期挙動、材質差なし、50 µg/mLで対照比約5倍延長。全ナノ材料がS. aureusで用量依存的に増殖率低下と遅延期延長、100 µg/mLで抑制。

図10c：AuNPsはE. coli増殖率μに影響なし。AgNPsはμ低下、50 µg/mLで対照比19%まで減少（補足表S52）。対照的にAu@AgNPsは100 µg/mLでE. coli増殖完全抑制。図10d：E. coli遅延期、材質ごとに特徴的応答。AuNPsは遅延期不変、AgNPsとAu@AgNPsは用量依存的効果、Au@AgNPsが顕著。AuNPsはE. coliに無効、Au@AgNPsは複製抑制し遅延期を無限に延長可能。興味深いことに、実効銀含有量がAu@AgNPsより高いAgNPsでもこの効果達成せず。コア@シェル構造での両金属相乗効果が抗菌活性を促進することを示唆。Fengらはコアシェル/合金構造でAuからAgへの電子補償現象報告、細胞毒性増強しつつ抗菌特性維持、AuとAgの相乗効果想定されるが更研究必要。

直接計数法（図11）で増殖キネティクス結果再現。図11a：C. albicansでAuNPsが19時間に92%殺菌。銀含有NPs（図11b, c）でより顕著な個体数減少。Au@AgNPs 50 µg/mLでS. aureusを7時間で99.5%殺菌（後再増殖）。MBC決定は試験濃度範囲では不能（補足図S9-11）、より高濃度（>200 µg/mL）必要。C. albicansではAgNPsでMBC 50 µg/mL（補足表S55）。

結論

初めてRumex hymenosepalus根エキスを還元剤とする金ナノ粒子とコア@シェル（Au@Ag）生成を報告。Au@AgNPs得るための二段階逐次法提案、中程度ポリ分散性と均質Agシェルを実現。ゴンペルツモデルで得た増殖曲線パラメータは、ナノ材料が微生物に異なる効果示すこと示す。AuNPsのS. aureus抑制濃度は他プロセス合成AuNPs報告値の5分の1、合成プロセスとナノ粒子表面環境の重要性示唆。一方、AgNPsとAu@AgNPsは遅延期大幅延長（>12時間）もたらすが、亜阻害濃度で細菌適応再増殖し耐性獲得リスク。適切な期間での増殖キネティクス研究重要性強調。興味深く、ゴンペルツ解析でAu@AgNPsが単金属NPsより微生物増殖キネティクスへの高効果示す、コア@シェル構造での両金属相乗効果に起因。殺菌効果（MBC）はC. albicansへのAgNPs暴露でのみ達成。研究対象微生物のMBC決定には、これらナノ材料のより高濃度範囲（>200 µg/mL）での更実験必要。