配位子ドープ銅オキシヒドロキシドナノ粒子：効果的抗菌戦略

背景

微生物感染は世界で数百万死亡原因[1]。抗菌治療非効率は従来抗生物質への微生物耐性起因多し[2-5]。新規抗菌剤切望。銅は古くから抗菌効果認識、標準抗生物質より長い臨床寿命期待可能。細菌タンパク質・DNA相互作用、反応性酸素種（ROS）生成、膜完全性破壊など多重機構作用[6, 7]。同理由で病原性細菌株銅・他金属耐性獲得可能性限定的[7-9]。さらに銅は比較的安価、微量必須元素でヒト毒性低く恒常性制御進化[10-12]。高リスク領域（病院、介護施設）表面バイオフィルム形成防止等予防感染対策で広く使用[13, 14]。対照的に銀広く外用抗菌製剤採用される中、銅治療的外用抗菌製剤用途見出されず[15]。

細菌は細胞内銅負荷に感受性、銅源効果は銅イオン放出能力関連[16, 17]。この点、銅ベース抗菌剤重要課題は創滲出液等流体へ抗菌銅有効濃度持続放出可能濃縮製剤達成。銅加水分解性金属イオンで濃度上昇と典型外用製剤pH（中性付近）で加水分解誘発、不溶性オキシヒドロキシド形成傾向増大[18]。生理pHでこれらオキシヒドロキシド溶解性銅イオン放出基質不良、潜在的効力なし[16, 19, 20]。

最近、生理条件下濃縮オキシヒドロキシド源から三価鉄イオン効果的放出問題、生物学的利用可能鉄サプリメント探求目的で、一次粒子構造修飾で解決。鉄を結晶ドーピングGRAS配位子（アジピン酸、酒石酸）存在下沈殿、最終三価鉄オキシヒドロキシド構造意図的不安定化。この戦略利点：(a) 三価鉄オキシヒドロキシド粒子不可逆凝集防止、(b) 適切生理条件下溶解性（溶出性）大幅向上。この材料「鉄[オキシ-]ヒドロキシドアジペートタルタレート」IHAT命名[21, 22]。類推で銅[オキシ-]ヒドロキシドアジペートタルタレート（CHAT）合成可能か、高濃度製剤化しても抗菌レベル銅イオン放出可能か検討。特に安価スケーラブル合成プロセス開発し、従来材料と異なり模擬創環境で殺菌濃度銅イオン容易放出する銅オキシヒドロキシドナノ粒子製造目指す。

thus本研究CHAT合成し、生物学的利用可能銅供給能、抗菌活性実証評価。大腸菌をグラム陰性菌「指標」種[19, 23]中心に、黄色ブドウ球菌（多剤耐性獲得多いグラム陽性菌）概念実証効果も実証。CHAT臨床応用外用抗菌療法価値評価目指す。

方法

特記なき限り全実験超高純度（UHP）水（逆浸透精製、18.2 ΩM/cm）、室温（20±2 ℃）、全試薬Sigma Aldrich購入使用。

銅製剤とCHATナノ粒子

塩化銅ストック（40 mM銅）CuCl₂·2H₂O水溶解調製。酸化銅ナノ粒子（CuO NPs；Sigma 544868）ストック不純物フリー市販粉末、一次粒子径34 nm（範囲10-50 nm）、抗菌剤前評価済[24-26]使用。1.3 g/L銅で水分散激撹拌調製。CHATナノ粒子コロイド懸濁液共沈殿法[27]合成。簡略：塩化銅、酒石酸、アジピン酸水溶解、最終懸濁液銅/酒石酸/アジピン酸モル比2:1:1、銅濃度2.5 g/L達成。初期混合物pH常に2.5以下、銅完全溶解。濃縮NaOH（5 M）滴下攪拌徐々pH上昇、pH 8.2±0.2まで。

CHAT懸濁液銅含有量と相分布

コロイド懸濁液銅含有量誘導結合プラズマ発光分光法（ICP-OES、Jobin Yvon 2000、Horiba）測定。全試料5% HNO₃（v/v）100 mg/L未満希釈、分析前24時間以上放置銅完全溶解確保。検量線標準（0.1-100 mg/L銅）5% HNO₃マトリックスマッチ、324.754 nm銅定量。濾過と超濾過で銅凝集体、ナノ粒子、可溶分率百分率化。懸濁液200 nmカットオフ濾過、残渣凝集体分率。可溶銅分離ナノ粒子銅区別 위해3 KDaフィルター（Sartorius Vivaspin 500 VS0192、16,000×g、5分）超濾過、1 nm未満カットオフ対応（Zetasizer Software 7.11、Malvern Instruments Ltd）。全分率（全銅、200 nm濾過液、3 KDa超濾過液）銅含有量ICP-OES測定、全銅含有量相対百分率：

乾燥CHATナノ粒子銅含有量と銅-配位子比決定

CHATナノ粒子凝集沈殿させ回収、非結合成分除去。エタノールCHATコロイド懸濁液（2.5 g/L銅）2:1エタノール/懸濁液（v/v）比添加、遠心分離（4500×g×15分、Mistral 6000）CHAT凝集体回収。液相（非結合配位子種含む）廃棄。固相CHAT銅含有量決定：オーブン45 ℃定量乾燥エタノール沈殿ペレット粉末化、35.2±0.3 mg（n=2）70% HNO₃ 11±1 g消化、正確重量記録。完全消化後20倍水希釈、ICP-OES銅濃度測定。配位子-銅比乾燥エタノール沈殿CHAT凝集体直接決定。凝集体元体積水再懸濁、低量HCl溶解促進（HPLC分析要件）。分取分5% HNO₃銅ICP-OES（上記）、80 mM HCl酒石酸・アジピン酸HPLC分析。標準逆相クロマト（C18カラム、Waters Alliance 2690/5、2998 PDA検出器）配位子分析、詳細は追加ファイル1。

CHAT懸濁液物理化学的キャラクタリゼーション

動的光散乱（DLS、Zetasizer NanoZS、Malvern Instruments Ltd）水動力学粒子径分布測定。CHATコロイド懸濁液（2.5 g/L銅）分取1 mL使い捨てセル、測定（n=3）25±2 ℃。詳細設定追加ファイル2。ゼータ電位レーザードップラー微小電気泳動（Zetasizer NanoZS、Malvern Instruments Ltd）使い捨て折りたたみ毛細管セル（DTS1070）、誘電率78.5、粘度0.89 cP仮定。透過型電子顕微鏡（TEM）キャラクタリゼーション：CHAT懸濁液滴下ホリー炭素穿孔グリッド、50 ℃一晩乾燥。TEM（FEI-Philips CM100）120 kV明視野モード撮像。

銅製剤抗菌活性

重金属MOPS（HMM）培地、認定金属イオン相性培地（追加ファイル3）使用、0.4%グルコース、0.1%カゼイン酸加水分解物補給、pH 7.2±0.2調整[28]。銅化合物添加前、大腸菌（NCTC11100）と黄色ブドウ球菌RN4220[29]一晩30 ℃定速撹拌Infors HT Minitronインキュベーター80 rpm培養。後細菌懸濁液光学密度0.05-0.1（ca. 10⁶ cells/mL）595 nm大腸菌（Multiskan RC 351 Labsystem）または600 nm黄色ブドウ球菌（Multiskanプレートリーダー、ThermoFisher Scientific）希釈。次塩化銅ストックとコロイドCHATをHMM希釈、最終銅濃度0.4-100 mg/L細菌懸濁液添加。6-9時間インキュベート、光学密度モニタリング細菌バイオマス測定。

細菌培地銅溶解度経時変化：塩化銅とコロイドCHATストックHMM希釈12.5、25、50 mg/L銅、0、2、4、8時間超濾過（3 KDa）ICP-OES分析可溶銅分率決定。

銅製剤細胞内生物学的利用能

組換え発光Cuセンシング細菌、大腸菌MC1061（pSLcueR/pDNPcopAlux）使用、亜毒性生物学的利用可能銅応答発光増加[30]。細菌懸濁液抗菌アッセイ同調製、96ウェルマイクロプレート銅塩化物とCHAT系列希釈（0-50 mg/L銅）4時間インキュベート。Orion IIプレートルミノメーター（Berthold Detection Systems）発光測定、発光誘導計算：

銅製剤誘導細胞内ストレス

組換え発光細菌大腸菌K12::soxRSsodAluxとMC1061（pDEWrecAlux）で銅化合物誘導細胞内スーパーオキシドアニオンと一本鎖DNA切断評価[17]。細菌培養抗菌アッセイ同調製、白96ウェルマイクロプレート銅塩化物とCHAT系列希釈（0-50 mg/L銅）4時間曝露。バイオセンサー性能メナジオン（0.04-30 μg/L）スーパーオキシドアニオン誘導化学、過酸化水素（0.1-150 mg/L）各々大腸菌K12::soxRSsodAluxとMC1061（pDEWrecAlux）陽性対照曝露制御。白96ウェルマイクロプレートインキュベート、Orion IIプレートルミノメーター発光測定、式5同発光誘導計算。

ヒドロキシエチルセルロースゲルへの銅製剤組み込み

塩化銅、CHAT、市販未修飾酸化銅ナノ粒子（CuO NPs）ストックUHP水250 mg/L銅希釈。CHATとCuO NPs懸濁液中性pH付近ゲル直接組込可能、塩化銅溶液希釈後酸性残存pH 7.0±0.2調整。ヒドロキシエチルセルロース（HEC）各希釈ストック直接2% w/v溶解ローラーミキサー（Denley Spiramix 5）均一ゲル形成まで。各ゲル10 gファルコンチューブ移し一晩静置。新調50 mM炭酸水素ナトリウム緩衝液（NaHCO₃粉末溶解pH 7.0±0.2調整）10 mL各チューブ慎重移しゲル-液界面攪乱最小化（比表面積7.1 cm²）。分取分ICP-OES銅放出経時分析。

結果

「方法」記載通りCHATは鉄類縁体IHAT[21, 22]同様、酒石酸とアジピン酸ドープ銅オキシヒドロキシド（2.5 g/L銅）類似手法合成。全銅200 nmフィルター通過、3 KDaフィルター通過極少（5%）安定コロイド懸濁液生成。銅大部分ナノ粒子状（95%、図1a）、遊離銅極少、大凝集体検出なし、IHAT類縁体同様[21, 22]。エタノール沈殿非結合配位子除去後乾燥、CHAT ICP-OES分析で31±1%銅（w/w）含有。HPLC決定配位子銅モル比：銅/酒石酸塩2:1、銅/アジピン酸塩2:0.3。TEM像でCHAT粒子ほぼ単分散2-3 nm径（図1b）。水動力学サイズデータ整合（水和シェル込み）、UHP水中体積中央径3.4 nm（図1c）、動的光散乱評価80%体積2.4-5.6 nm狭分布。平均ゼータ電位−39 mV（図1d）、安定水和分散形成ナノ粒子と整合[27]、CHATストック懸濁液数年安定（追加ファイル4）。

次にCHATストック懸濁液銅塩抗菌活性関連濃度で細菌培地希釈時抗菌活性検討。CHATと塩化銅で大腸菌と黄色ブドウ球菌生育阻害曲線非常に類似、主活性総銅濃度12.5-50 mg/L範囲（図2）。大腸菌完全生育阻害：塩化銅18.8、CHAT 25 mg/L銅。黄色ブドウ球菌：塩化銅75、CHAT 100 mg/L銅（図2、百分率生育阻害vs銅濃度追加ファイル5）。

これら抗菌濃度でCHAT少なくとも94%急速溶解化（15分以内）、超濾過ICP-OES判定（図3a）。抗菌効果この化学的不安定性、ナノ粒子急速溶解による細胞内銅イオン取得関連と推測。Cuセンシング大腸菌MC1061（pSLcueR/pDNPcopAlux）で0-50 mg/L銅CHAT/塩化銅チャレンジ、亜毒性細胞内銅イオン応答発光増加[30]。培地両銅源濃度増加で発光増加（図3b）、細胞内銅上昇整合。6.25 mg/Lまで両銅源用量反応曲線傾き同一、CHAT生物学的利用可能銅完全溶解源と同等確認。以降50 mg/Lまで発光増加せず両銅化合物毒性（図3b）。

CHAT/塩化銅調製溶液細胞内銅並行研究し、別大腸菌ベースバイオセンサーで細胞内スーパーオキシドアニオン誘導、DNA損傷誘導能力評価。どちらも有意観察効果なし、センサー各々過酸化水素、メナジオン陽性対照応答（図3c, d）。以上3細菌バイオセンサー銅異なる化学形態溶液同等応答、両場合細菌同一可溶銅曝露強く支持、一方ナノ粒子状出発にもかかわらず。

最後に上記利点CHAT可溶銅塩対比濃縮製剤で前者化学的不安定性保持、後者保持せず場合のみ明明。ヒドロキシエチルセルロース（HEC）一般水性外用基剤[31-33]用い、銅250 mg/L各塩化銅、CHAT、市販CuO NPs組込。各銅組込HECゲル10 g（銅2.5 mg）に簡易創滲出液模倣50 mM NaHCO₃緩衝液10 mL添加時、CHAT含有製剤から24時間で60 mg/L超持続銅放出（図4）。放出比較的速やか、抗菌活性濃度2-4時間達成。対照的にpH中性化塩化銅予想通り加水分解・銅オキシヒドロキシド凝集体形成傾向で銅放出不良基質、24時間10±7 mg/L銅のみ達成（図4）。市販CuO NPs全く銅放出検出せず（図4）。

考察

ここでは銅ベースナノ材料CHATが高濃度製剤化可能で、先行銅ベースナノ粒子[34, 35]と異なり生物学的利用可能銅不安定源として抗菌効力保持実証。上記CHAT合成は鉄類縁体IHAT[21, 22]長年先行研究触発。IHATさらに自然界in vivo必須金属イオン効率的リサイクル迅速鉱物ターンオーバー解、有機分子一次鉱物粒子結晶構造不安定化利用[21, 22]触発。合成版ではGRAS配位子金属オキシヒドロキシド形成時架橋ポリマー溶液中組込み[21, 22]。構造不安定化通じ最終鉱物相不安定性確保、高負ゼータ電位ナノ粒子生成（ゼータ電位測定実証）、凝集・集合反発し数年安定ナノ粒子懸濁液生成。ここでもIHAT同様酒石酸酸が銅オキシヒドロキシド構造物理化学的変化達成優位配位子、取り込み約3倍アジピン酸上回る、後者合成中緩衝剤様振舞[21, 22]。

修飾なし新規沈殿金属オキシヒドロキシド凝集・集合、老化開始、凝縮徐々に結晶性増大。サイズ・鉱物相遷移逆反応、再溶解参加能力低下。故銅塩化物溶液pH中和新規形成銅オキシヒドロキシド、ゲル放出アッセイ（図4）少なくとも一部可溶銅放出理解可能、市販CuO NPs凝集体より凝縮鉱物相（酸化銅）で検出不能銅放出当然。凝集状態無関係大表面積提示30 nmナノ粒子溶解なし示す鉱物相銅イオン放出主要駆動因子、一次粒子修飾（ここ配位子ドーピング達成）溶解特性顕著シフト必須。さらにCHAT合成室温実施、高合成温度非晶質相減少溶解速度低下懸念。室温合成スケール製造時エネルギーコスト削減利点。

高安定濃度銅製剤持続放出・必要時急速イオン溶解実現他手法存在可能性も、これほど直截的合成・反応原料原価安価想定困難。外用感染・細菌耐性問題先進国限定でなく、開発途上国細菌耐性増大、安価効果的解決策緊急要請[36, 37]。毒性金属イオン耐性獲得が従来抗生物質より細菌困難エビデンス存在[7]。理論前提：銅・銀離散抗菌経路でなく複数標的（様々酵素系等）影響、全体細菌細胞構造不安定化[17, 19, 38]。細菌数世紀曝露後も銅・特定金属イオン感受性保持報告[6, 7, 39]。興味深く金属抗菌剤先行耐性不問従来抗生物質感受性回復可能性近年示唆[40, 41]。

結論

ここでは生理pH高濃度生物学的利用可能銅イオン問題、鉄類縁体先行利用戦略同様有機酸ドープ銅ナノミネラルで解決実証。銅ベースナノ粒子（CHAT命名）細菌培地易溶解、可溶銅塩同等細胞内銅取り込みと抗菌活性示す。決定的に単純銅塩と異なりCHAT pH中性製剤高濃度化可能、銅イオン放出不安定性保持。CHAT殺菌濃度域銅イオン放出、新規外用抗菌剤単独または耐性抗生物質効力増強基盤可能。抗生物質耐性増大で新規外用抗菌剤必要、CHAT安価、容易合成、一般に安全認識（GRAS）成分使用。in vivo研究価値あり。