インビボでのDNAとのジフェニル-N-（トリクロロアセチル）-アミドホスフェート相互作用に対するC60フラーレンの効果およびinvitroでのヒト白血病細胞株に対するその細胞毒性活性

要約

ホスホリル基の近くに2つのフェノキシ置換基を含むジフェニル-N-（トリクロロアセチル）-アミドホスフェート（HL）が合成され、元素分析とIRおよびNMR分光法によって同定され、細胞毒性剤自体としてテストされました。 C ₆₀との組み合わせフラーレン。

分子シミュレーションの結果によると、C ₆₀ フラーレンとHLはDNAと相互作用し、HLフェニル基とC ₆₀との相互作用を積み重ねることによって安定化された剛直な複合体を形成する可能性があります。フラーレンとDNAGヌクレオチド、およびHL CCl ₃の相互作用による C ₆₀とのイオン-π結合によるグループ化分子およびDNAGヌクレオチドとの静電結合による。

MTTテストを使用すると、IC ₅₀を使用したヒト白血病CCRF-CM細胞に対するHLの細胞毒性活性 72時間の細胞処理で10μMの濃度で検出された値が示されました。 16μMC₆₀の複合作用下フラーレンとHL、IC ₅₀の値より低い5μMのHL濃度と、より早い48時間のインキュベーションで検出されたほか、HLの細胞毒性効果は、HL自体が細胞生存率に影響を及ぼさない低い2.5μMの濃度で観察されました。 C ₆₀の結合安定した複合体の形成を伴うマイナーなDNA溝を伴うフラーレンおよびHLは、CCRF-CЕM細胞増殖の相乗的阻害の考えられる理由の1つであると考えられています。

C ₆₀の適用 2.5μMのHLと組み合わせたフラーレンは、血液赤血球膜の構造安定性に有害な影響を及ぼさないことが示されました。したがって、C ₆₀の複合アクション低濃度のフラーレンとHLは、ヒト白血病細胞に対するHL細胞毒性効果を増強し、溶血効果は続きませんでした。

背景

カーボンナノ構造の代表C ₆₀ フラーレンは、抗酸化剤または光増感剤としてだけでなく、細胞内に浸透して薬物担体として機能する能力により、抗癌剤の毒性作用の修飾因子としても独特の物理化学的特性および生物学的活性を有することが示されています[1,2,3,4 ]。 C ₆₀ 分子は、ドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキセルなどの化学療法薬と相互作用し、それらと複合体を形成して治療効果を高めることができます[5,6,7,8]。

カルバシルアミドホスフェート（CAPh）は、その特定の構造、生物学的活性、および生物医学的応用の展望のために注目を集めている有機分子です[9、10、11、12]。分子のフラグメントC（O）N（H）P（O）で一緒に結合されたペプチドおよびホスホルアミド基の存在は、生体分子および細胞膜との相互作用を決定します。ホスホリル基とカルボニル基の近くの置換基の変化は、CAPhの立体化学的および薬理学的特性を調節する可能性を与えます。特に、さまざまなCAPhの代表者が抗腫瘍活性を有することが示されました[13、14]。

最近、ミリモル濃度範囲で使用されるCAPhの代表的なジメチル-N-（ベンゾイル）-アミドホスフェートが白血病L1210細胞の生存率を低下させ、その毒性効果がC ₆₀によって促進されることを確認しました。フラーレン[15]。また、追加の芳香族置換基と電気陰性CCl ₃の導入も示しました。 CAPh構造へのグループ化は、その毒性の増強をもたらしました[16]。したがって、異なる起源のヒト白血病細胞に対してジモルフォリド-N-トリクロロアセチルホスホルアミドの有意な毒性効果が示されたが、その有効濃度は依然として高く、C ₆₀との併用作用後の毒性の増強はなかった。フラーレンが観察された。これらの調査を継続して、ホスホリル基の近くにモルフォリド基の代わりに2つのフェノキシ置換基を持つCAPhジフェニル-N-（トリクロロアセチル）-アミドホスフェート（HL）の新しい代表を合成しました（図1）。

研究の目的は、ジフェニル-N-（トリクロロアセチル）-アミドホスフェート（HL）の単独またはC ₆₀との組み合わせの生物活性を推定することでした。 DNAとの相互作用のinsilico分析とヒト白血病細胞株に対する細胞毒性効果のinvitro研究を使用したフラーレン。

メソッド/実験

化学薬品

RPMI 1640液体培地、ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびL-グルタミン（Biochrom、ドイツ）、ジメチルスルホキシド（DMSO）（Carl Roth GmbH + Co、ドイツ）、MTT [3-（4,5-ジメチルチアゾール- 2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド]（Sigma-Aldrich Co、Ltd。、米国）、HCl（Kharkivreachim、ウクライナ）。

化合物の特性評価

溶解性を高めるために、以下の反応によりジフェニル-N-（トリクロロアセチル）-アミドホスフェート（HL）のナトリウム塩を取得しました（図2）。

200 mlのクロロホルム中のトリクロロホスファゾスリクロロアセチル溶液（0.035 M）を、150 mlのクロロホルム中のよく攪拌されたナトリウムフェノキシド懸濁液（0.106 M、12.3 g）にゆっくりと加えました（図2;ステージ1）。混合物の温度が40〜50°Cを超えることは許されませんでした。撹拌を約1時間続けた後、溶液を70°Cまで加熱し、これらの条件で20分間撹拌しました。得られた生成物トリフェノキシホスファゾスリクロロアセチルを蒸発させた。次に、40mlの1M NaOHを添加し、90分間還流しました（図2;ステージ2）。得られた混合物を蒸発させた。ナトリウムHLの固体沈殿物をジエチルエーテルで3回洗浄し、 i から再結晶させた。 -白色の結晶性粉末としてのプロパノール（80％の収率）。 NaL・3H ₂の無色の結晶 X線分析に適したOは i によって得られました -PrOH：H ₂ O（9：1 v / v ）溶液のゆっくりとした蒸発。この化合物は空気安定性があり、水やアルコールに非常によく溶けます。 M.p. 215°С。

HLは、元素分析とIRおよびNMR分光法によって識別されました。元素分析（C、H、N）は、ELIIIユニバーサルCHNOS元素分析装置を使用して実行されました。 IRスペクトル測定は、Perkin–Elmer Spectrum BXFT-IR分光計でKBrペレットとしてサンプルに対して2cm ^{− 1} の分解能で実行されました。そして、8つのスキャンの累積。これらを組み合わせて、4000〜400 cm ^{− 1} のスペクトル範囲でランダムな吸収アーチファクトを平均化します。。 ¹ DMSO-d6溶液のHNMRスペクトルは、AVANCE 400BrukerNMR分光計で室温で記録されました。

HL：IR（cm ^-1 ）：1639 vs、sh（νCO）; 1353 s、sh（Amide II）; 1194 s、sh（νPO）; 941 s、sh（νPN）。

¹ H NMR（DMSO-d ₆ ）：7.05（t、2H、γ-CH₂ ）; 7.205、7.255（dt、8H、α-およびβ-CH₂ 。

CCl ₃の場合 C（O）N（Na）P（O）（OC ₆ H ₅ ）₂ 元素組成が決定された、％：C 40.58、H 2.35、N 3.15;計算値、％：C 40.37、H 2.42、N3.36。

C ₆₀の合成と特性評価フラーレン

C ₆₀の安定性の高いコロイド水溶液フラーレン（200μM、純度> 99.5％、ナノ粒子の平均サイズは最大50 nm）は、[17、18]で説明されているように、イルメナウ工科大学（ドイツ）で合成されました。

СellCulture

実験は、ヒト急性T細胞白血病CCRF-CM細胞株で行われました。細胞株は、ライプニッツ研究所DSMZ-ドイツ微生物および細胞培養コレクション：CCRF-CM（ACC 240）から購入しました。細胞は、25 cm ² を使用して、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および2mMグルタミンを添加したRPMI1640培地で培養しました。 5％CO ₂を使用した37°Cのフラスコ加湿インキュベーター内。

RPMI1640培地中の細胞をC ₆₀とインキュベートしましたフラーレン（16μM）またはHL（2.5、5、および10μM）を別々に、24、48、および72時間一緒に。 HLまたはC ₆₀を追加しない場合の細胞の生存フラーレンは100％として受け取られました（対照サンプルには0.05 M DMSOが含まれていました）。

細胞生存率（MTT）アッセイ

細胞生存率は、MTT [3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド]還元アッセイによって評価されました[19]。示されたインキュベーションの時点で、100μlのアリコート（0,5×10 ⁴ 細胞）を96ウェルマイクロプレートSarstedt（Nümbrecht、ドイツ）に入れ、10μlのMTT溶液（PBS中5 mg / ml）を各ウェルに加え、プレートを37°Cでさらに2時間インキュベートしました。次に、培地を100μlのDMSOに交換しました。ジフォルマザンの形成は、マイクロプレートリーダーTecan Infinite M200 Pro（スイス、メンネドルフ）を使用して570nmでの吸光度を測定することで測定しました。

動物

この研究は、体重170±5gの「Wistar」系統の白人雄ラットで実施されました。動物は、キエフのタラスシェフチェンコ国立大学のESC「生物学と医学の研究所」の動物園で標準的な条件下で飼育されました。動物は食物と水を自由に摂取できた。すべての実験は、上記の機関の生命倫理委員会の管理下にある脊椎動物の保護に関する欧州条約の国際原則に従って実施されました。

赤血球溶血の推定

「Wistar」系統ラットのヘパリン処理した血液から赤血球を採取し、0.85％NaCl溶液で0.700o.uに希釈しました。 Scinco分光光度計（ドイツ）で630nmで。赤血球の溶血は、0.001 NHClによって引き起こされました。溶血の動態は分光光度法で測定されました（λ =630 nm）2分間で10秒ごと。溶血した赤血球のパーセンテージは、[20]に示されているように計算されました。赤血球は、C ₆₀を含む0.85％NaCl溶液中でインキュベートされました。フラーレン（16μM）またはHL（2.5および10μM）を別々に、または1時間一緒に。 HLまたはC ₆₀を添加していない赤血球フラーレンは100％として受け取られました（対照サンプルには0.05 M DMSOが含まれていました）。

インシリコ研究

二重らせんDNA分子は、PDB（Protein Data Bank）ベースのテンプレートとして使用されました。 DNA分子とHLの相互作用を個別に、またはC ₆₀と組み合わせてフラーレンが研究されています。 DNA分子の次の構造を考慮しました：2MIW（CCATCGCTACC-DNAヘリックスの小さな溝への化合物のインターカレーション）、1XRW（CCTCGTCC-DNAヘリックスの小さな溝への化合物のインターカレーション）、および2M2C（GCGCATGCTACGCG-の結合DNAらせんの大小の溝を持つ化合物）。 QXPパッケージに組み込まれている系統的ドッキング（SDOCK +）のアルゴリズムを適用しました（この方法は、二乗平均平方根偏差（RMSD）の最小値で研究対象の構造のすべての可能なコンフォメーションを示します）[21]。 QXPパッケージに組み込まれているスコアリング関数を使用して、DNAとの潜在的に可能な複合体を300個生成し、そのうちの10個を次の段階に選択しました[22]。

DNA分子とHLとの相互作用は、個別に、およびC ₆₀と組み合わせて行われます。フラーレンは、次のパラメーターによって特徴づけられました：（1）水素結合の数、（2）DNAの接触表面と対応する構造の面積、（3）DNAとドッキング構造の間の距離、および（4）総エネルギー結合構造の。

化合物とC ₆₀の錯体の安定性を評価するフラーレンでは、OPLS-AA力場[26、27]に基づくNosé-Poincaré-Andersonアルゴリズム（NPA）[24、25]に従って、Gromacsソフトウェアツール[23]を使用して短い分子動力学（MD、100 ps）を実行しました。。

計算は、次のパラメータで実行されました。温度（ケルビン）-300;圧力（キロパスカル）-100;水素原子またはリガンドが関与する結合は、アルゴリズムによって制限されていました[25]。

統計分析

データは、4回以上の独立した実験の平均±SDとして表されました。各グループの平均（M）と標準偏差（SD）を計算しました。統計分析は、二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ後検定を使用して実行されました。 p の値 <0.05は統計的に有意であると見なされました。データ処理とプロットは、IBMPCが専用アプリケーションGraphPadPrism 7（GraphPad Software Inc.、USA）を使用して実行しました。

結果と考察

インシリコ研究

HLとDNAの相互作用

HLは、AGC-GCTAヌクレオチドを介してマイナーなDNA溝に結合すると、DNAに挿入され、安定した複合体を形成できることが示されました（図3a）。この場合、Aヌクレオチドの窒素塩基とHLフェニル基の間のスタッキング相互作用、およびCCl ₃間の静電相互作用グループとCヌクレオチドが形成されました。 MDシミュレーション後、DNA二重らせんとHLのRMSD値はそれぞれ3.3Åと1.62Åであることがわかりました。 HLのヌクレオチド環境（GCA-CTA）が部分的に変化し、スタッキング相互作用が失われ、GヌクレオチドとHLのCO基の間に水素結合が形成されました。

HLと主要なDNA溝との結合は、TCG-ATヌクレオチドを介して発生しました（図3b）。この場合、HLのCO基とAヌクレオチドの窒素塩基との間に水素結合が形成され、HLフェニルとCおよびGヌクレオチドの窒素塩基の両方の間でスタッキング相互作用が発生しました。さらに、HL CCl ₃間の静電結合の確率 ATヌクレオチドのグループおよび窒素塩基が出現しました。

MDシミュレーション後、HLのヌクレオチド環境の変化は検出されませんでした。 DNAとHLのRMSD値は、それぞれ2.77Åと1.58Åでした。そのため、Cヌクレオチドとフェニル基の間のスタッキング相互作用が消失しました。

DNAへのHLインターカレーションの場合、その環境はCG-CGヌクレオチドで構成されていました（図3c）。 CGヌクレオチドとのスタッキング相互作用が現れました。一方のフェニル基は窒素塩基の間にクランプされ、もう一方はCヌクレオチドとのスタッキング相互作用を形成しました。

MDシミュレーション後、DNA二重らせんとHLのRMSD値はそれぞれ1.71Åと1.89Åでした。 HLのヌクレオチド環境は変化しなかった。フェニル基の1つは、Gヌクレオチドの窒素塩基とイオン-π相互作用を形成しました。これは、1.12Åシフトしているように見えました。

得られたエネルギーパラメータは、DNAとHLの間、およびHL自体の中での立体衝突のエネルギーが重要ではないことを証明しました（表1）。

<図>

マイナーおよびメジャーDNAグルーブとのHL結合、またはマイナーDNAグルーブへのインターカレーションのエネルギーパラメーターの比較分析を行いました。バンプ値は、DNAへのHLインターカレーションの場合は6.2 kJ / mol、マイナーおよびメジャーDNAグルーブとの結合の場合は2.5 kJ / molであることが示されました（表1）。 Int値は、HLをDNAに挿入した場合は8.7 kJ / mol、主要なDNA溝と結合した場合は6.3 kJ / mol、マイナーなDNA溝と結合した場合は3.6 kJ / molでした。これらのデータは、DNAの小さな溝とのHL結合が最も安定していることを示しました。

HLとCの複合相互作用₆₀ DNAを含むフラーレン

以前は、コンピュータシミュレーションを使用して、C ₆₀ 分子はDNAと相互作用し、安定したC ₆₀を形成する可能性があります + DNA副溝と結合する場合のDNA複合体[15]。図4に示すように、C ₆₀ フラーレンは、CCl ₃とイオン-π結合を形成することもできます。 HL分子のグループ。

HLの分子モデリングの2つのバージョン、C ₆₀を使用しました [16]で提案され、MDシミュレーション結果の解釈に役立つことが証明されたフラーレンとDNAの相互作用。このバージョンでは、最初にHL、次にC ₆₀の場合、DNA分子の1XRWPDB構造を使用しました。分子がDNAに挿入される（HL + C ₆₀ ）およびDNA分子の2MIW PDB構造-バージョンでは、最初はC ₆₀ 分子、次にHLがDNAに挿入されます（C ₆₀ + HL）。

HL + C ₆₀の場合のマイナーDNAグルーブとの結合バージョンはGCTA-GCATヌクレオチドを介して発生しました（図4a）。フェニル基は小さな溝を埋め、スタッキング相互作用に入りました：1つのグループはC ₆₀ フラーレンとGヌクレオチドの窒素塩基を持つもう1つ。静電相互作用はCCl ₃間で発生しました HLのグループとGヌクレオチドの窒素塩基とC ₆₀ フラーレン。

MDシミュレーションの結果によると、この場合のDNA二重らせんはかなりの移動度（RMSD値は3.08Å）、HLのRMSD値は2.04Å、C ₆₀ フラーレンは事実上動かないままでした。その結果、HL + C ₆₀のヌクレオチド環境構造はTGC-GCATGによって変更されました。さらに、HLのアミノ基とDNAの間の水素結合、および窒素含有GC塩基のヌクレオチドとC ₆₀の間のスタッキング相互作用フラーレンが登場しました。

HL + C ₆₀の結合主要なDNA溝は、C-ATCCヌクレオチドを介して発生しました（図4b）。 HLCO基とAヌクレオチドの窒素塩基との間に水素結合が形成された。フェニル基は主要なDNA溝を埋め、C ₆₀とのスタッキング相互作用に入りました。フラーレン。

MDシミュレーション結果によると、HL + C ₆₀のヌクレオチド環境構造は変更されていません。DNAとHLのRMSDの値はそれぞれ3.14Åと2.24Åで、C ₆₀ フラーレンは事実上動かないままでした。この場合、HLとC ₆₀の間のすべての相互作用フラーレンは消失し、HLはDNAとのみ立体的に相互作用しました。結果としてC ₆₀ フラーレンとHLは主要なDNA溝から押し出されます。

HL + C ₆₀の場合マイナーなDNA溝に挿入され（図4c）、CGT-GAGヌクレオチドとの結合が起こりました。 C ₆₀ フラーレンはたまたまマイナーなDNA溝に組み込まれ、立体的に相互作用していました。 HLフェニル基はCG-CGヌクレオチドの窒素塩基とスタッキング相互作用を形成しました。 MDシミュレーションによると、DNAとHLのRMSDの値はそれぞれ2.29Åと2.13Åで、C ₆₀ フラーレンは実質的に動かないままであり、CC1 ₃ HLのグループはGヌクレオチドの窒素塩基と静電相互作用を開始しました。

C ₆₀の場合 + HLバージョン、マイナーDNAグルーブとの結合（図4d）は、CGC-GCCヌクレオチドを介して発生しました。 HLフェニル基の1つがC ₆₀とスタッキングを形成しましたフラーレンと他のGヌクレオチド。 CC1 ₃ HLのグループはCヌクレオチドの窒素塩基と静電結合を形成するように見えました。 MD分析によると、この場合のDNAとHLのRMSDの値は、それぞれ2.35Åと2.75Å、C ₆₀でした。フラーレンは動かないままであり、C ₆₀のヌクレオチド環境 + HL構造はCGCT-GCによって変更されました。さらに、C ₆₀ 分子はDNAの奥深くまで浸透し、Cヌクレオチドの窒素塩基とスタッキング相互作用を形成しました。

計算されたエネルギーパラメータによると、C ₆₀の場合に形成された複合体マイナーDNAグルーブへの+ HLインターカレーションが最も堅固でした（バンプ値20.0 kJ / mol）（表1）。対照的に、HL + C ₆₀の場合 DNAとの相互作用、HL + C ₆₀の場合、このパラメータはわずか6.2 kJ / molでしたマイナーDNAグルーブに挿入された場合、マイナーDNAグルーブと結合した場合は7.8 kJ / mol、メジャーDNAグルーブと結合した場合は8.8 kJ / molでした。その上、エネルギーパラメータはHL + C ₆₀内の強い水素結合の形成を示しました + DNA複合体は、DNAの主溝と結合する場合にのみ可能でした。Hbndの値が-2.3 kJ / molの場合、他のタイプの相互作用では、ゼロまたは-1.0 kJ / molに等しくなりました（表1）。さらに、この場合のMDの結果によると、C ₆₀ フラーレンとHLは主要なDNA溝から移動しているように見えました。

したがって、C ₆₀ マイナーなDNA溝との+ HL結合は、C ₆₀の最も可能性の高いバージョンであることが示唆されています。フラーレン、HL、およびDNAを組み合わせた相互作用。

HLの生物学的影響のinvitro研究

CCRF-CЕM細胞の生存率

in vitro実験では、2.5〜10μMの範囲のジフェニル-N（トリクロロアセチル）-アミドホスフェート（HL）がヒト白血病CCRF-CЕM細胞の生存率に及ぼす長期的な影響をMTTテストで推定しました。細胞を、16μMのC ₆₀を含むRPMI1640培地で24、48、72時間インキュベートしました。フラーレンまたはHL単独またはそれらの組み合わせ。 C ₆₀なしで培養された細胞の生存率またはHLは100％と見なされました。

24時間のインキュベーションでは、CCRF-CЕM細胞の生存率に対するHLの影響は観察されませんでした（図5）。さらに長時間のインキュベーションでは、5および10μM濃度でのHLの細胞毒性活性が明らかになり、48時間での細胞生存率はそれぞれ25および33％抑制され、72時間で低下し続けました。

CCRF-CЕM細胞の生存率が50％低下することに注意してください（IC ₅₀ ）は、10μM濃度のHLの作用下で72時間後に検出されました（図5）。最近、別のCAPhの代表的なジモルフォリド-N-トリクロルアセチルホスホリラミドが、濃度1 mMで72時間でCCRF-CЕM細胞の生存率を50％低下させることを示しました[16]。これらのデータの比較分析は、モルフォリド基の代わりにフェノキシをCAPh誘導体の構造に導入することにより、白血病細胞に対するその有効毒性濃度を2桁減少させることができることを示しています。 –P（O）（OC ₆ H ₅ ）コアは、この化合物とDNAのより効果的な相互作用を保証しました。

C ₆₀の影響なしインキュベーション期間中の細胞生存率に単独で使用されたフラーレンが検出されました（データは提示されていません）。同時に、図6に示す結果は、C ₆₀ フラーレンはCCRF-CЕM細胞に対するHL細胞毒性活性を増強しました。 C ₆₀の複合アクションの下でフラーレンとHLでは、HL単独の作用下よりも低いHL濃度（5μM）および初期のインキュベーション期間（48時間）で細胞生存率の50％の低下が観察されました。さらに、72時間のC ₆₀の複合アクションフラーレンとHL、HLの細胞毒性効果は、HL自体が細胞生存率に影響を及ぼさない2.5μMの低濃度で検出されました（図6）。

したがって、C ₆₀ フラーレンは、HLの細胞毒性効果を増強し、低濃度でのその作用に対する白血病細胞の感受性を大幅に高めることが示されました。そのC ₆₀を考慮に入れるフラーレンは24時間にわたって白血病細胞内に蓄積し[28]、細胞内コンパートメント[29,30,31]、特に核[32、33]に局在することができますが、活発に増殖している癌細胞の核DNAとの相互作用はすべきではありません。除外されます。

したがって、in vitroで得られたデータは、in silico研究の結果と一致しており、C ₆₀の初期結合を示しています。分子、次に安定した複合体の形成を伴うマイナーなDNA溝を持つHLの分子は、CCRF-CЕM細胞増殖の相乗的阻害の考えられる理由の1つである可能性があります。

溶血に対する赤血球の耐性

HLおよびC ₆₀の抗がん能の推定についてフラーレンの組み合わせでは、非悪性細胞、特に血球への影響の可能性を考慮することが重要です。

酸性溶血に対する赤血球の耐性を研究することで、膜レベルでの薬剤の影響を解明することができます。溶血のダイナミクスは、赤血球の原形質膜破壊のダイナミクスを反映し、したがってその構造組織の安定性を反映しています。図7では、溶血赤血球の割合の依存性を、添加せずに（コントロール）、HLまたはC ₆₀を使用してNaCl溶液中で1時間インキュベートしました。フラーレン単独または組み合わせ。 16μMC₆₀の影響なし赤血球溶血のフラーレンが検出されました（図示せず）。 2.5μM濃度のHL単独またはC ₆₀との組み合わせ溶血に対する赤血球の耐性に影響を及ぼしました（図7）。一方、10μMの濃度でHLの作用下で、20秒で最大の溶血の加速が検出されました。 10μMHLとC ₆₀の複合作用フラーレンに続いて、20秒で溶血した赤血球の60％でさらに溶血が強化されました。

得られたデータは、C ₆₀の適用を示しましたフラーレンと2.5μMのHLの組み合わせは、血中赤血球膜の構造安定性に悪影響を及ぼさず、同時に、白血病細胞に対するこの低濃度のHLの細胞毒性活性を大幅に高めることができます。 C ₆₀の相乗的な細胞毒性効果にもかかわらずフラーレンとHLは白血病細胞に対して10μMの濃度であり、これらの組み合わせの適用は溶血効果の強化によって制限されているように見えました。

最後に、上記のin vitro研究の文脈では、水/固体界面が水を閉じ込めており、これがナノ構造の輸送、熱力学的特性[34、35]、および細胞膜との相互作用の両方に影響を与える可能性があることを強調することが重要です。 [36]。

カルバシルアミドホスフェート誘導体の細胞内局在、特にホスホルアミデートの細胞への浸透に関する文献データがあります。したがって、ホスホルアミデート誘導体は、MDA-231乳がんおよび肺がん（H460、H383、およびH2009）細胞株の膜に浸透する可能性があります[37]。ニトロベンジルホスホルアミドマスタードは、細胞膜を透過し、NTR ⁺ のミトコンドリアに局在することが示されました。哺乳類細胞[10]。 C ₆₀であることを排除するものではありません受動拡散またはエンドサイトーシス[28、30、32]により癌細胞の膜に浸透し、核およびミトコンドリアに蓄積することができるフラーレン[30、32、33]は、小さな抗腫瘍分子の輸送体である可能性があります[30、32、33]。 38,39,40]。

結論

ホスホリル基ジフェニル-N-（トリクロロアセチル）-アミドホスフェート（HL）の近くに2つのフェノキシ置換基を有するカルバシルアミドホスフェート誘導体の新しい代表物を合成し、細胞毒性剤自体として、およびC ₆₀と組み合わせて試験した。フラーレン。分子シミュレーションの結果によると、C ₆₀ フラーレン、次にHLはマイナーなDNA溝と結合し、HLフェニル基とC ₆₀との相互作用を積み重ねることにより、安定した剛体複合体が形成されました。フラーレンとDNAGヌクレオチド、およびHL CCl ₃の相互作用による C ₆₀とのイオン-π結合によるグループ化分子およびDNAGヌクレオチドとの静電結合による。

MTTテストを使用して、IC ₅₀を使用したヒト白血病CCRF-CM細胞に対するHLの細胞毒性活性を示しました。細胞処理の72時間で10μMの濃度で検出された値。 HLの細胞毒性効果はC ₆₀によって促進されましたフラーレン。 16μMC₆₀の複合作用下フラーレンとHL、IC ₅₀の値より低い5μMのHL濃度と、より早い48時間のインキュベーションで検出され、さらにHLの細胞毒性効果は、HL自体が細胞生存率に影響を及ぼさない低い2.5μMの濃度で観察されました。

以前、異なる起源のヒト白血病細胞に対するジモルフォリド-N-トリクロロアセチルホスホルアミドの有意な毒性効果を示しましたが、その有効濃度は高く、C ₆₀との併用作用後の毒性の増強はありませんでした。フラーレンが観察された[16]。 –P（O）（OC ₆ H ₅ ）モルフォリド基の代わりにCAPh誘導体への基は、ヒト白血病細胞に対する毒性濃度の低下に寄与し、C ₆₀との効果的な相互作用を保証します。分子とDNA。 C ₆₀の結合安定した複合体の形成を伴うマイナーなDNA溝を伴うフラーレンおよびHLは、CCRF-CЕM細胞増殖の相乗的阻害の考えられる理由の1つであると考えられています。

C ₆₀の適用を明らかにしましたフラーレンと2.5μMのHLの組み合わせは、血中赤血球膜の構造安定性に悪影響を及ぼしませんでしたが、C ₆₀ 10μMのHLを含むフラーレンは、溶血効果の強化によって制限されているように見えました。

したがって、C ₆₀ フラーレンは、HLの細胞毒性効果を増強し、低濃度でのその作用に対するヒト白血病細胞の感受性を大幅に高めることが示されました。 C ₆₀の組み合わせ低濃度2.5μMのHLを含むフラーレンは、さらなる生物医学研究に有望である可能性があります。