ヒドロキシアパタイトナノ粒子が内皮細胞相互作用を介してMSC骨形成を促進

概要

ナノヒドロキシアパタイト（ナノ-HA）は再生医療分野で大きな注目を集めています。内皮細胞（EC）-間葉系幹細胞（MSC）相互作用は骨再生に不可欠ですが、ナノ-HAがこのプロセスでどのように作用するかは不明です。本研究では、ECによって媒介される間接共培養モデルを用いて、HAナノ粒子（HANPs）のMSCに対する細胞毒性と骨誘導効果を調査し、その基盤メカニズムを明らかにしました。亜細胞毒性用量では、HANPsがMSCの生存率、骨芽細胞遺伝子発現、石灰化結節およびアルカリホスファターゼ産生を増加させることが判明しました。これらの現象は、ECから分泌されるHIF-1αに依存し、ERK1/2シグナル伝達カスケードを引き起こしました。さらに、HIF-1αがMSCの骨形成分化に与える影響を定量的に解析するため、二段階細胞系譜数理モデルを確立しました。このモデルは、HIF-1αが1500 pg/mLまで用量依存的にMSCの骨形成分化率を刺激することを示し、上記実験結果と一致しました。我々のデータは、HANPs、EC、MSC間の協調的相互作用が骨再生を刺激する可能性を示唆しています。さらに、二段階細胞系譜モデルは、骨組織工学におけるエフェクター分子の潜在的影響を評価するための有用なin vitroシステムとなります。

はじめに

外傷、先天性奇形、手術切除による骨欠損の再建は整形外科にとって大きな課題です。ヒドロキシアパタイト（HA）は代表的な生体活性セラミックスとして骨置換材に用いられてきました。しかし、望ましくない機械的特性と骨誘導特性が臨床応用を制限しています。近年、ナノ-HAはその独自の生体模倣特性により、より最適な生体活性と改善された機械的性能を示し、再生医療に関連する生物医学分野で大きな関心を集めています。ナノ-HAが骨欠損に移植されると、骨修復に関与する複数の細胞がそれに曝露されます。したがって、ナノ-HAの生物学的振る舞いを評価する必要があります。複数の証拠が、HAナノ粒子（HANPs）がヒト臍帯ワートンジェリー由来間葉系幹細胞（hWJ-MSCs）と骨芽細胞に取り込まれ、骨形成分化を促進することを直接的に示しています。Duaらは、HANPsが人工軟骨のデノボ軟骨への統合を促進する能力を報告しました；逆に、HANPsはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）の血管新生能力を阻害します。人間の健康の観点から、HANPsが骨再生に与える影響をより包括的に理解することが求められ、ナノベース人工骨の継続的応用はこのような研究の緊急性を増しています。

骨再生には必然的に新生血管の侵入が伴います。ECは血管系の内側細胞内皮であり、血液を受動的に送達するだけでなく、器官再生の誘導、特定、ガイダンス、恒常性と代謝の維持にも役割を果たします。MSCは周内皮ニッチの一部であり、居住ニッチ内の特定の生理的・生化学的微小環境の誘導下で自己複製と多分化能を持ちます。Tsaiらは、ECがエンドセリン-1を分泌してMSCを骨形成および軟骨形成系統へ誘導することを発見しました。また、Salehらはマイクロアレイデータ解析を用いてHUVEC分泌タンパク質と、MSC膜受容体と相互作用して増殖と骨形成分化を促進する関連クロストークシグナル伝達経路を特定しました。骨組織工学では、HANPsが新生血管と接触し、ECによってエンドサイトーシスされることが示されており、これらの細胞の生理機能を変化させます。これはまた、パラクリンシグナル伝達を変化させることで周囲の骨前駆細胞に影響を与え、骨修復に影響を及ぼす可能性があります。しかし、HANPsのMSCへの直接的影響は探索されてきたものの、HANPsがECを介して間接的にMSCの骨形成分化を誘導できるかどうかという明確な理解はまだ不足しており、これは骨修復におけるHANPsの効果を理解する上で不可欠です。

本研究では、HANPsがECとMSCの相互作用に与える生物学的効果について更なる洞察を得るため、HUVECsとhWJ-MSCsを用いた間接共培養モデルを確立しました。このシステムを用いて、HUVEC媒介パラクリンシグナル伝達を介したHANPsのhWJ-MSCsに対する細胞毒性と骨誘導効果を評価しました。HANPsで刺激したHUVECsからの上清中の可溶性因子を評価し、遺伝子とタンパク質レベルの両方で関連メカニズムに重点を置いて、HANP誘導内皮細胞-MSC相互作用に影響を与える主要因子を特定しました。結果は、低酸素誘導因子（HIF）-1αがこれらの相互作用において重要な役割を果たすことを示しました。

HIF-1αが骨形成プロセスに与える影響を定量的に観察・予測するため、HIF-1αを組み込んだ二段階細胞系譜数理モデルを確立しました。ここでは、実験データを解析することで、定義された初期細胞播種密度とHIF-1α濃度に基づき、任意の時点におけるMSC数と分化度を予測し、これが初期培養条件と培養時間への適切な提案を提供する可能性があります。本研究の結果は、ナノベース骨置換材と生物学的システムの相互作用を明らかにし、再生医療用革新的バイオ材料の開発促進に役立つでしょう。

材料と方法

粒子の調製とキャラクタリゼーション

20 nm（np20）、20×80 nm（np80）、マイクロサイズHA粒子（m-HAP、純度≥99.0%）を南京エンペラーナノマテリアル社（中国南京）から購入。粒子のサイズと形状は透過型電子顕微鏡（TEM；FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin、FEI、米国オレゴン州ヒルズボロ）と走査型電子顕微鏡（SEM；LEO1530VP、ドイツ）で観察しました。HA粒子（HAPs）の動的サイズとゼータ電位はZetasizer Nano ZS90とMastersizer 3000（Malvern Instruments、英国マルバーン）で測定しました。

細胞の調製と培養

全実験プロトコルは南京医科大学倫理委員会の承認を受けました。HUVECsとhWJ-MSCsは、ドナーから文書によるインフォームドコンセント取得後、以前の記載通りに新鮮なヒト臍帯から採取しました。簡単に説明すると、臍帯と臍静脈を1%ペニシリン・ストレプトマイシン（PS；Hyclone、GE Healthcare Life Sciences、オーストリアパッシング）含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄しました。その後、臍静脈を0.1%コラゲナーゼI（Sigma、米国ミズーリ州セントルイス）で満たし、37 °Cで15分間インキュベートしました。採取後、HUVECsをEC培地（ECM）（Sciencell、米国カリフォルニア州サンディエゴ）で培養しました。

その後、血管を除去し、ワートンジェリーを1 mm²片に切断し、25 cm²培養フラスコ（Corning Incorporated、米国ニューヨーク州コーニング）に置きました。これらの細胞を10%胎仔牛血清（GIBCO）と1% PS添加L-DMEM（GIBCO Life Technology、米国ニューヨーク州グランドアイランド）で培養しました。

hWJ-MSCsは、CD13、CD29、CD34、CD44、CD45、CD51、CD105に対するモノクローナル抗体（BD Biosciences、米国カリフォルニア州サンホセ）を用いて表現型確認を行いました。HUVECsはフォン・ヴィレブランド因子（vWF；上海昌道バイオテック、中国上海）で評価しました。HUVECsは3-7パッセージ、hWJ-MSCsは3-5パッセージを使用しました。

PBS中1 mg/mLの粒子懸濁液をL-DMEMで希釈し、最終濃度に調整しました。図1に示す通り、HUVECsを指定濃度のHAPsで18時間インキュベートしました。培養液を4 °C、15,000 rpmで15分間遠心分離し、10% FBS添加上清を調整培地（CM）としてhWJ-MSCsの後続実験に使用しました。CMは骨形成誘導液（10 mM β-グリセロリン酸、50 μg/mL L-アスコルビン酸-2-リン酸、0.1 μM デキサメタゾン（Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）含有）を補充した骨形成培地で構成されました。また、2-メトキシエストラジオール（2-MeOE2）（Selleck Chemicals、米国テキサス州ヒューストン）を特異的HIF-1α阻害剤として使用しました。2-MeOE2(+)群では、HAP添加前に5 μM 2-MeOE2で40分間前処理したHUVECsからのCMでhWJ-MSCsを培養しました。PD98059を特異的MEK阻害剤として使用しました。PD98059群では、5 μM PD98059含有CMでhWJ-MSCsを培養しました。

細胞生存率と細胞数の測定

細胞生存率はMTSアッセイキット（MTS；Bestbio、Beyotime Biotechnology、中国上海）で評価しました。hWJ-MSCsを24時間接着させた後、CMで24時間と72時間培養しました。ホルマザンの吸光度をマイクロプレートリーダー（SpectraMax M2；Molecular Devices LLC、米国カリフォルニア州サニーベール）で490 nmで測定しました。吸光度を同条件下の標準検量線で細胞数に換算しました。

定量的リアルタイムPCR（RT-PCR）

TRIzol試薬（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド）で、指定時間CMで培養したhWJ-MSCsから総RNAを単離しました。PrimeScript First Strand cDNA Synthesis kit（TaKaRa、日本東京）で1.0 µg RNAから相補的DNAを転写し、T3サーモサイクラー（Mastercycler 5333；Eppendorf、ドイツハンブルク）で実施しました。FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）kit（Roche、スイスバーゼル）を用い、定量リアルタイム増幅システム（7900HT Fast；Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスタシティ）で目的遺伝子の発現レベルを解析しました。標的遺伝子の相対的mRNA発現量をGAPDHで正規化し、2^(-ΔΔCt)法で算出しました。標的遺伝子のプライマー配列を表1に示します。

アリザリンレッドS（ARS）染色と定量解析

hWJ-MSCsを12ウェルプレートで骨形成培地で最大14日間培養し、細胞外マトリックス石灰化をARS染色（Leagene、Leagene Biotechnology、中国北京）で観察しました。簡単に説明すると、試料を無水エタノールで15分間固定し、室温で1%（w/v）ARS（pH 4.2）で5分間染色しました。染色細胞を二重蒸留水で2回洗浄し、撮影しました。石灰化プロセスの定量解析のため、各ウェルに10%（w/v）セチルピリジニウムクロリド一水和物（BOMEI、BOMEI Biotechnology、中国合肥）300 μLを添加し、30分間インキュベートしました。各試料から90 μLを96ウェルプレートに移し、405 nmで吸光度を三重測定しました。

アルカリホスファターゼ（ALP）染色と定量解析

hWJ-MSCsを12ウェルプレートで骨形成培地で最大14日間培養後、BCIP/NBTアルカリホスファターゼ色素開発キット（Beyotime）でALP染色を行いました。簡単に説明すると、hWJ-MSCsを4%パラホルムアルデヒドで固定し、ニトロブルーテトラゾリウムと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸の混合物で4時間染色し、撮影しました。ALP合成定量のため、細胞を氷冷RIPAライシスバッファー（Beyotime）で30分間溶解しました。細胞溶解液を4 °C、12,000 rpmで10分間遠心分離し、上清をALPアッセイキット（Beyotime）で定量解析しました。吸光度を405 nmで三重測定し、標準曲線でALP活性に換算しました。

酵素免疫測定法（ELISA）

HUVECsを2 × 10⁵ cells/wellで播種しました。HAPsで18時間培養したHUVECsからCMを採取し（追加ファイル1）、上清をELISA解析にかけました（図1）。ヒトHIF-1α ELISAキット（安徽ジョイーバイオテクニクス、中国安徽）を製造元指示に従って使用しました。

免疫蛍光染色

HUVECsを12ウェルプレートのスライド（7.6 × 10⁴ cells/well）に播種しました。CM曝露18時間後、4%パラホルムアルデヒド（Biosharp、中国北京）で固定し、PBS中0.1%トリトンX-100（Beyotime）で透過化した後、1%抗HIF-1α抗体[EPR16897]（ab179483、Abcam、英国）で4 °Cで一晩インキュベートしました。その後、暗所で1% CoraLite594標識ゴート抗ラビットIgG（H+L）（Proteintech、米国）で1時間インキュベートしました。核をDAPI（Beyotime、中国上海）で染色し、30秒反応させました。レーザー共焦点顕微鏡（Olympus、日本）で観察しました。蛍光強度をImageJ v.1.4解析ソフトウェア（米国ベセスダ）で定量しました。

ウェスタンブロット解析

hWJ-MSCsをCMで24時間（ERK1/2、p-ERK1/2）または骨形成培地で7日間（RUNX-2、タイプ1コラーゲン/COL I）インキュベートしました。その後、RIPAライシスバッファーで30分間溶解しました。細胞溶解液を遠心分離し、上清を-20 °Cで保存して解析しました。12% SDS-PAGE後、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写しました。一次抗体として抗p-ERK1/2、抗ERK1/2、抗RUNX-2、抗COL I、抗GAPDH（1:1,000、ラビットポリクローナル抗体；Cell Signaling Technology、米国マサチューセッツ州ボストン）を使用しました。非結合抗体除去後、二次抗体で1時間インキュベートしました。化学発光ゲルイメージングシステム（LAS4000M；GE Healthcare Biosciences AB、スウェーデンウプサラ）で膜上のシグナルを検出しました。p-ERK/ERK比とRUNX-2/COL I対GAPDH比をImageJ v.1.4解析ソフトウェア（ベセスダ）で定量しました。

細胞アポトーシス評価

hWJ-MSCsを6ウェルプレートで10⁵ cells/wellの密度で播種しました。付着細胞を指定濃度のHIF-1αで指定時間処理しました。細胞を回収し、暗所でFITC-Annexin VとPI（Fcmacs、中国南京）で15分間標識しました。全試料をFACScanフローサイトメーター（BD Bioscience、米国カリフォルニア州サンホセ）で測定しました。データをFlowJo v10（BD Biosciences）で解析しました。

二段階細胞系譜モデル

HAPsの莫大な可能性と共培養システム解析の難しさを考慮し、HIF-1αがhWJ-MSCsの骨形成分化に果たす役割を理解するため、定量的解析と信頼できる予測を提供する数理モデルが必要でした。

hWJ-MSCsを0、300、500、1000、1500、2000、3000、4000 pg/mLのHIF-1αおよび骨形成誘導液で培養しました。これらの濃度でのデータフィッティング後、コントロール、m-HAP、np80、np20群でのHUVECs産生HIF-1α濃度（それぞれ240、300、325、375 pg/mL）を用いてMATLAB（MathWorks、米国マサチューセッツ州ナティック）でフィッティング式を検証しました。モデル簡略化のため、異なるHIF-1α濃度での類似増殖パターンを同一とみなしました。平均分化度を用いて分化度-時間方程式をフィッティングしました。hWJ-MSCsの増殖率、アポトーシス率、骨形成分化度を規定時間で測定しました。

実験データに基づき、多段階細胞系譜モデルに類似した簡略化二段階細胞系譜モデルを確立しました。C₀とC₁はそれぞれhWJ-MSCsと終末細胞の細胞数を表し、以下で制御されます：

dC₀/dt = [(K - C₀ - C₁)/K × p - (p - 1)] × v₀ × C₀
dC₁/dt = (2 - (K - C₀ - C₁)/K × p - p) × v₀ × C₀ - A × C₁

ここで、HIF-1αと時間の影響を受けるpはhWJ-MSCsの複製確率を表し、対応してd = 1 - pは推定データと実験データのフィッティングで得られる分化率です。パラメータv₀は各系統段階での細胞分裂速度を定量化します（特にv = ln2/c、cは細胞周期期間）。終末細胞のアポトーシス率をAで表します。簡略化のため、アポトーシス率は時間とともにわずかに変化すると仮定し、A = 4.5%を一定としました。Kは環境収容力を表します（細胞は無限に増殖できないため）。HIF-1αはhWJ-MSCsの分化率を増加させ、分化率を以下でモデル化しました：

d = d₀ / (1 + (r×H)ᵐ)
p = 1 - d

ここで、HはHIF-1α濃度、d₀は0 pg/mL HIF-1αでの分化率、rは調節強度（ここではHIF-1αのMSCに対する調節強度を表す）、mはヒル係数（MSC分化率とHIF-1α濃度の関係）に対応します。

統計解析

正規性と等分散性の要件を満たす全データは、3回以上の独立実験からの平均±標準偏差（SD）で表現しました。SPSS 24.0ソフトウェア（SPSS Inc.、米国シカゴ）を用いて、一元配置分散分析（ANOVA）または二元配置分散分析（ANONA）で統計解析を行いました。P値 < 0.05を統計的に有意としました。統計解析はGraphPad Prism 5（GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホヤ）で提示しました。

結果

HAPsのキャラクタリゼーション

図2に示す通り、HAPsは特定のサイズと形状で調製されました。np20の直径は近球形で平均20 nm、np80は棒状で平均長80 nm、幅20 nmでした。m-HAPsも近球形で直径約12 μmでした。全粒子はL-DMEMで負の表面電荷を持ちました。ゼータ電位の負値が骨細胞の付着・増殖、直接的骨結合、新骨形成に有意な好影響を与えることが示唆されています。L-DMEM中で観察された粒子は水系で凝集傾向があります。動的サイズも測定しましたが、これも生物学的振る舞いに影響する重要な因子となり得ます。

HAPsの間接的細胞毒性（hWJ-MSCsに対する）

HAPsの間接的細胞毒性をhWJ-MSCsで評価するため、MTSアッセイで細胞生存率を測定しました。50 µg/mL HANPs含有CMは、24時間と72時間後、特に24時間でhWJ-MSC生存率を有意に刺激しました。しかし、100 µg/mL HANPs含有CMは、コントロールと比較して72時間後に細胞生存率を15-20%低下させました。さらに、25 µg/mL np20含有CMは24時間後に生存率を刺激しましたが、np80では見られませんでした。これらの現象は、50 µg/mL HANPsが亜細胞毒性濃度であり、以降の全実験でこの濃度を使用したことを確認しました（図3）。

HAPsの間接的骨誘導効果（hWJ-MSCsに対する）

HANPsの間接的骨誘導効果をhWJ-MSCsで特定するため、定量的RT-PCR解析で骨形成遺伝子発現を評価しました。ルント関連転写因子2（RUNX-2）のトランスクリプトレベルは、HANP群、特にnp20群で7日目から21日目にかけて顕著に増加しました（図4a）。I型コラーゲン（Col I）遺伝子発現は、np20群で7日目から21日目にかけて増強され、np80群では7日目から14日目にかけて持続的増加を示しました（図4b）。オステオカルシン（OCN）mRNAは、HANP群で14日目に明確にアップレギュレートされ、骨形成速度の加速を示しました（図4c）。アルカリホスファターゼ（ALP）mRNAレベルはHANP群で明確に増加し、hWJ-MSCsの骨形成分化を示しました（図4d）。一方、m-HAP群はコントロール群と比較してこれら3つの骨形成遺伝子レベルで限定的な変化しか示しませんでした（図4）。さらに、多能性マーカーであるNANOG、OCT3/4、SOX2の発現はHANPs群でコントロールと比較して低下し、HANPs群、特にnp20群でhWJ-MSCsが分化したことを示唆しました（図4e-g）。ウェスタンブロット解析でも類似結果が得られ、np20群がhWJ-MSCsのRUNX-2とCOL I発現を間接的に増強できることを示しました（図5c、d）。

HANPsの間接的骨誘導効果をhWJ-MSCsで視覚的に観察するため、指定骨形成培地で14日間培養後、ARSとALP染色を行いました。図5a、bに示す通り、HANP群ではm-HAP群とコントロール群と比較して、石灰化結節数の増加とhWJ-MSCsのALP活性上昇が観察されました。また、m-HAPはコントロールと同様に、hWJ-MSCsの骨形成分化に限定的な影響しか与えませんでした。

HUVECsと間接共培養したhWJ-MSCsでのHAPsによるERK1/2シグナル伝達活性化

HAPsによるHUVECsのパラクリン機能への影響を調査するため、免疫蛍光染色とELISAアッセイでhWJ-MSCsの骨形成分化を促進する可能性のあるタンパク質を特定しました。図6a-cに示す通り、細胞内および細胞外HIF-1α産生がHANPs（特にnp20）で有意に促進された一方、m-HAPの影響は限定的でした。

HIF-1αによって活性化されるhWJ-MSCsの分化シグナル伝達経路をより正確に理解するため、ウェスタンブロット解析でERK1/2経路の主要制御因子を調べました。図6d、eに示す通り、総ERK1/2タンパク質レベルは変化しませんでしたが、p-ERK1/2レベルはHANPsで培養したhWJ-MSCsで明確に増加し、特にnp20群で顕著でした。しかし、m-HAPはHUVECsでのHIF-1α産生への影響と同様に、hWJ-MSCsのp-ERK1/2レベルにほとんど影響を与えませんでした。重要なことに、HIF-1αによって活性化されたhWJ-MSCsのp-ERK1/2レベル上昇は、特異的HIF-1α阻害剤2-MeOE2でブロック可能であり、HIF-1αがhWJ-MSCsのERK1/2シグナル伝達経路の上流で機能することを示しています。

HIF-1αがERK1/2経路を介してhWJ-MSCsの骨形成分化を促進

観察されたhWJ-MSC骨形成分化刺激にHIF-1αが必要かどうか判断するため、特異的HIF-1α阻害剤（2-MeOE2）をこれらの細胞培養に適用しました。図7に示す通り、骨形成培地で培養した2-MeOE2(+)処理群hWJ-MSCsの石灰化マトリックス沈着とALP活性が弱まり、HIF-1αがhWJ-MSCsの骨形成分化に不可欠であることを示しました。これらの結果に基づき、HIF-1αによって活性化されるhWJ-MSCsの骨形成分化におけるERK1/2経路の役割をさらに探索しました。特異的MEK阻害剤PD98059投与後、骨形成培地で培養したhWJ-MSCsの石灰化マトリックス沈着とALP活性が抑制されました。

二段階細胞系譜モデル

HIF濃度とhWJ-MSCs骨形成分化の内在的関係を定量的に明らかにするため、0-4000 pg/mLのHIF-1αで8群のhWJ-MSCsを処理しました。二段階細胞系譜数理モデルを用いて、異なるHIF-1α濃度で処理したhWJ-MSCsの増殖、アポトーシス、骨形成分化率を解析しました。図8aに示す通り、フィッティングデータを用いてシミュレーション式（d/d₀ = 1/(0.14H² - 0.43H + 1)）と曲線（青曲線）を得ました。分化率はHIF濃度増加とともに最初に増加し、その後減少しました。より具体的には、分化率は1500 pg/mL HIF-1αでピークに達しました。

本研究によると、コントロール、m-HAP、np80、np20群でのHUVECs産生HIF-1α濃度はそれぞれ240、300、325、375 pg/mLでした。黒四角は240、300、325、375 pg/mL HIF-1αによる分化率促進を表し、シミュレーション曲線とよく一致します。さらに、異なるHIF-1α濃度で処理したhWJ-MSCsの分化度（相対ALP活性）は時間とともに同様に増加しました。したがって、モデル簡略化のため、それらの増殖パターンを類似または同一とみなしました。ALP活性の0日目から7日目までの増加が骨芽細胞数に比例し、骨芽細胞数がプラトー期にピークに達することを見出しました。したがって、ALP活性を相対的骨芽細胞数曲線（骨芽細胞数/最大骨芽細胞数）でフィッティングした後、ALP活性の最大値を予測し、相対的ALP活性（ALP活性/ALP活性最大値）として分化度を取得しました（図8b）。これら2つの研究を組み合わせ、時間とHIF-1αで進化する分化度の三次元曲面を取得しました（図8c）。

最適培養時間を推定するため、細胞数をシミュレートする必要がありました。異なるHIF-1α濃度下での分化率を解明後、各集団サイズをシミュレートしました。シミュレーションは、96ウェルプレートでウェルあたり初期播種密度1500細胞、異なるHIF-1α濃度を用いました。図8d-fに示す通り、実験データ（黒四角）はシミュレート総細胞数（青曲線、hWJ-MSCs数と骨芽細胞数の合計）とよく一致し、このモデルが任意時点でのhWJ-MSCs数と骨芽細胞数を予測する能力を支持します。さらに、骨芽細胞数は0、375、1500 pg/mL HIF-1αでそれぞれ21、18、15日目にプラトー期に達しました。このモデルは組織工学をガイドする最適培養時間を提供し、HIF-1αがhWJ-MSCsの骨形成分化を加速する直接的証拠も提供します。

考察

ナノバイオ材料の最近の進歩により、ナノベース人工骨置換材が活発に研究されています。蓄積する証拠は、ナノバイオ材料が細胞膜を透過し内部保持時間を増加させる能力により、細胞とナノバイオ材料の間に複雑な相互作用があることを示唆しています。以前の研究では、コラーゲン/アルギン酸ナノフィルムがMSC膜に吸着し、細胞内シグナル伝達カスケードを活性化して骨形成分化を促進することが明らかになりました。Wuらの洗練された実験は、TiO₂ナノチューブがパラクリン効果とEC-MSC相互作用による細胞接合を促進することで血管新生と骨形成分化を改善することを明確に実証しました。骨組織工学の優れた候補を開発するためには、骨修復に関与する細胞とナノベース骨置換材の直接的クロストークだけでなく、間接的相互作用も明確にする必要があります。しかし、現在の理解は依然として限られています。本研究では、間接共培養モデルを用いて、ECによって媒介されるHANPsのMSCに対する生物学的効果をさらに解明しました。

細胞毒性は、あらゆるナノバイオ材料の生体適合性評価における主要課題です。以前の研究ではHANPsがhWJ-MSCsの生存率やアポトーシスに直接影響しないことが判明しましたが、他の細胞の媒介により異なる影響を及ぼす可能性があります。したがって、HUVECsによって媒介されるHANPsのhWJ-MSCsに対する細胞毒性効果を評価する必要がありました。興味深いことに、CMで24時間と72時間インキュベート後、hWJ-MSC生存率は0-50 µg/mL HANP群で維持・向上し、特にnp20群で顕著でした。これはCMにエフェクター分子が存在することを示唆します。HANPs濃度が100 µg/mLに達すると、hWJ-MSCsに細胞毒性を示しました。一方、0-100 µg/mL m-HAPはhWJ-MSC生存率に影響しませんでした（図3）。Jiangらは、特定サイズのエンジニアリングナノ粒子が明確なエンドサイトーシス経路と動力学を持ち、標的細胞機能調節に関与する下流シグナル伝達を変化させることを示しています。以前の研究で、np20とnp80がHUVECsによってエンドサイトーシスされ、形態変化と大型空胞出現が続き、HUVECsの活性化状態を示すことを示しました。また、np20はより速い取り込み速度と増加した蓄積により、HUVECsのより強い活性化をもたらし、パラクリンシグナル伝達によりhWJ-MSC生存率増加につながる可能性があります。逆に、m-HAPはHUVECsによってほとんどエンドサイトーシスされず、これがhWJ-MSCs代謝への限定的影響を説明するかもしれません。

活性化HUVECsの潜在的骨誘導効果をさらに探索するため、亜細胞毒性用量50 µg/mL HAPsを後続研究で使用しました。活性化HUVECsから採取したCMは、hWJ-MSCsの細胞外カルシウム沈着、ALP活性、骨形成タンパク質発現、骨形成遺伝子mRNA発現を促進しました（図4、5）。Runx2は骨芽細胞系統特定に関与する必須転写因子であり、np20群で大幅に増強され、hWJ-MSCsへの強い骨誘導効果を示しました（図4a、図5c、d）。np20群は7日目でCOLI発現1.5倍改善（図4b、図5c、d）、14日目で2倍増加を示し、HANP処理群に追加の分化骨芽細胞が存在することを示唆しました（図4b）。OCNは成熟期骨マーカーであり、この遺伝子がHANP群で14日目に有意に増加し、np20とnp80がm-HAPと比較して骨成熟を加速できることを示しました（図4c）。ALPは骨芽細胞分化の早期マーカーであり、各群で培養時間とともに明確に増加し、特にnp20群で顕著で、MSCから骨芽細胞への追加的転換が起こったことを明らかにしました（図4d）。多能性マーカーNANOG、OCT3/4、SOX2は分化能を示唆します。図4e-gに示す通り、HANP群でのこれらの遺伝子発現低下は、HAP群の大部分のhWJ-MSCsが骨芽細胞に転換したことを示唆します。

我々のデータは、HUVECsによるHANPsエンドサイトーシスがhWJ-MSCsの骨形成分化改善と関連することを示しました。しかし、この結果の原因は現在不明です。HUVECsのパラクリン機能の観点から、活性化HUVECs上清中の可溶性分化誘導タンパク質に焦点を当てました。HIF-1αシグナル伝達は骨形成と血管新生のカップリングに不可欠です。Heikalらは、損傷したECが正常酸素条件下でもより多くのHIF-1αを分泌することを報告しています。また、HANPs曝露がHUVECsの血管新生能力を阻害することも示されています。したがって、CM中のHIF-1α濃度を測定したところ、HANP処理群でm-HAP群とコントロール群と比較してHIF-1α含量が増加しました（図6a）。HIF-1αがhWJ-MSCs骨形成分化に果たす役割を特定するため、特異的HIF-1α阻害剤2-MeOE2を用いました。HIF-1α濃度低下がこれらのhWJ-MSCsの石灰化マトリックス沈着とALP活性障害と並行し、HANPsがHUVECsのHIF-1α産生を促進してhWJ-MSCsの骨形成を促進することを示しました（図7）。

HANPsを骨組織工学に適切に適用するためには、HUVECsによって媒介されるHANPsのhWJ-MSCs骨形成分化促進メカニズムについて更なる洞察が必要です。ERK1/2経路はHIF-1αの下流にあり、MSC分化の基盤です。本研究では、CM中のHIF-1α濃度がhWJ-MSCsのp-ERK1/2レベルとよく一致しました（図6b、c）。2-MeOE2適用時、hWJ-MSCsのp-ERK1/2発現が活性化されず、HIF-1αがERK1/2シグナル伝達の上流で機能することを示しました。ERK1/2シグナル伝達がhWJ-MSCs骨形成分化に果たす役割を直接的に扱うため、特異的MEK阻害剤PD98059を用いました。ERK1/2シグナル伝達抑制により、hWJ-MSCsの骨形成分化が最低レベルになりました。この現象の一因は、ERK1/2経路がHIF-1αシグナル伝達とアポトーシス・増殖シグナル伝達経路の両方で鍵役割を果たし、これらが観察された骨形成分化変化の原因となっている可能性です。また、血管内皮増殖因子（VEGF）の存在とも関連している可能性があります。VEGFはHIF-1αシグナル伝達の下流エフェクターの一つであり、ERK1/2経路活性化を介してMSC骨形成分化を促進することもできます。以前の研究でnp20がHUVECsでのVEGF産生を誘導することを発見しました；したがって、ERK1/2経路抑制がVEGF阻害をもたらし、hWJ-MSCs骨形成分化低下につながる可能性があります。利用可能な実験結果から、以下のようにまとめられます。HANPsはm-HAPsより最適に直接的および間接的骨誘導効果を発揮できます。自己骨移植と同種骨移植と比較して、HANPsは広範な供給源があり、二次的損傷と潜在的免疫原性がありません。しかし、m-HAPsと比較して、HANPsはHUVECsの血管新生能力を抑制し、時間および用量依存的にわずかな細胞毒性を示します。

最近、骨再生におけるHIF-1αの重要性を示す証拠が増えています。しかし、HIF-1α濃度などの特定初期条件下でのMSC分化率を定量的に予測できた研究はほとんどありません。細胞増殖、アポトーシス、骨形成分化を考慮し、我々はHIF-1αと組み合わせた二段階細胞系譜数理モデルを提示し、これは実験データと高い相関を示します。0-4000 pg/mL HIF-1αでのhWJ-MSCs分化率フィッティングにより、分化率、HIF-1α濃度、時間を記述する方程式を取得しました。図8dに示す通り、このモデルは異なるHIF-1α濃度下での細胞数マップを描写でき、二段階システムの内在的動力学を探索可能にします。また、このモデルはHIF-1αがhWJ-MSCs骨形成分化に与える効果を数学的に検証します。さらに、多段階細胞系譜モデルとロジスティックモデルに基づき、我々のモデルは長期予測を可能にする十分な安定性を持ち、人口無限爆発の罠にはまりません。

既存実験データを用いることで、定義された初期細胞播種密度とHIF-1α濃度で細胞数と分化率の両方を予測可能です。その結果、最適培養時間も取得できます。したがって、最適HIF-1α濃度を予測し、骨形成に最も最適な時間を決定でき、効率的な組織工学に重要です。二段階細胞系譜モデルは、2つの細胞系統を持つ幹細胞の増殖と分化予測に適用可能です。この基盤上、初期条件と既存実験データに基づくモデルを確立し、in vitroでの最適培養条件を特定でき、これがin vivoでの骨修復最適化を支援します。

結論

本研究では、HUVECsによって媒介されるHANPsのhWJ-MSCsに対する特定の生物学的効果を探索しました。m-HAPsと比較して、np20とnp80の両方が時間および用量依存的にわずかな細胞毒性を示しました。重要なことに、HANPsのサイズはこの細胞毒性に有意な影響を与えないことがわかりました。我々のデータはまた、HANPs、特にnp20がHUVECsによるHIF-1α分泌増加を促進し、これがERK1/2経路活性化を介してhWJ-MSCsの骨形成分化促進と直接相関することを示しました（図9）。さらに注目すべきは、二段階細胞系譜モデルの結果が、HIF-1αがhWJ-MSCsの骨形成分化率に用量依存的な刺激効果を及ぼすことを示唆していることです。また、初期条件に基づくin vitroモデルで最適HIF-1α濃度と培養時間が推定され、将来的に組織工学応用で貴重となる可能性があります。総じて、これらの観察はHANPsが細胞間相互作用を調節することで骨再生を改善し得る証拠を提供します。

データと材料の入手可能性

本研究で使用・分析されたデータセットは、対応著者から合理的な要請に基づき入手可能です。

略語

HA:

ヒドロキシアパタイト

HANPs:

HAナノ粒子

hWJ-MSCs:

ヒト臍帯ワートンジェリー由来間葉系幹細胞

HUVECs:

ヒト臍帯静脈内皮細胞

m-HAP:

マイクロサイズHAP粒子

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水

ECM:

EC培地

2-MeOE2:

2-メトキシエストラジオール

ELISA:

酵素免疫測定法

RUNX-2:

ルント関連転写因子2

Col I:

I型コラーゲン

OCN:

オステオカルシン

ALP:

アルカリホスファターゼ

SOX 2:

SRY関連HMGボックス2

ERK:

細胞外シグナル関連キナーゼ

VEGF:

血管内皮増殖因子