C60フラーレンによるジフェニル-N-(トリクロロアセチル)アミドリン酸塩のDNA結合とヒト白血病細胞への細胞毒性への影響評価

概要

リン酸基近傍に2つのフェノキシ置換基を持つカルバシルアミドリン酸塩の新規代表化合物、ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）を合成し、元素分析、IR、NMR分光法で同定。単独およびC₆₀フラーレンとの組み合わせで細胞毒性剤として評価した。

分子シミュレーション結果によると、C₆₀フラーレンとHLはDNAと相互作用し、HLフェニル基のC₆₀フラーレンおよびDNAグアニンヌクレオチドとのスタッキング相互作用、HLのCCl₃基のC₆₀分子とのイオン-π結合およびDNAグアニンヌクレオチドとの静電結合によって安定化された剛直な複合体を形成する。

MTT試験により、ヒト白血病CCRF-CM細胞に対するHLの細胞毒性が示され、72時間処理でIC₅₀値が10 μM濃度で検出された。16 μM C₆₀フラーレンとHLの併用では、IC₅₀がより低い5 μM HL濃度、より早い48時間で検出され、さらにHL単独では無影響だった低濃度2.5 μMでも細胞毒性効果が観察された。C₆₀フラーレンとHLがDNAミナーグルーブに結合し安定複合体を形成することが、CCRF-CEM細胞増殖の相乗的阻害の一因と推定される。

C₆₀フラーレンと2.5 μM HLの併用が、血液赤血球膜の構造的安定性に有害な影響を及ぼさないことを示した。したがって、低濃度でのC₆₀フラーレンとHLの併用作用は、ヒト白血病細胞に対するHLの細胞毒性効果を増強し、溶血作用を伴わない。

背景

炭素ナノ構造の代表格であるC₆₀フラーレンは、抗酸化剤や光増感剤としてだけでなく、細胞内への浸透能と薬物キャリアとしての機能により、抗がん剤の毒性効果の修飾剤としても独自の物理化学的特性と生物活性を持つことが示されている[1-4]。C₆₀分子はドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキセルなどの化学療法薬と相互作用し、複合体を形成して治療効果を高める[5-8]。

カルバシルアミドリン酸塩（CAPh）は、その特異な構造、生物活性、生物医学応用の展望から注目されている有機分子群である[9-12]。ペプチド基とホスホルアミド基が分子内のC(O)N(H)P(O)フラグメントで結合していることが、生物分子や細胞膜との相互作用を決定づける。ホスホリル基とカルボニル基近傍の置換基を変えることで、CAPhの立体化学的・薬理学的特性を調整可能。特に、様々なCAPh代表化合物が抗腫瘍活性を持つことが示されている[13,14]。

最近、CAPh代表化合物のジメチル-N-(ベンゾイル)-アミドリン酸塩がミリモル濃度域で白血病L1210細胞の生存率を低下させ、その毒性効果がC₆₀フラーレンによって促進されることを確認した[15]。また、CAPh構造に追加の芳香族置換基と電気陰性のCCl₃基を導入すると毒性が増強されることも示した[16]。ジモルフォリド-N-トリクロロアセチルホスホルアミドが異なる由来のヒト白血病細胞に対して有意な毒性効果を示すが、その有効濃度は依然として高く、C₆₀フラーレンとの併用による毒性増強は観察されなかった。これらの研究を継続し、ホスホリル基近傍のモルフォリド基を2つのフェノキシ置換基に置き換えた新規CAPh代表化合物、ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）を合成した（図1）。

ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）の構造

本研究の目的は、HLの単独およびC₆₀フラーレンとの組み合わせにおける生物活性を、DNAとの相互作用のインシリコ解析とヒト白血病細胞株に対する細胞毒性効果のインビトロ評価により推定することである。

方法/実験

試薬

RPMI 1640液体培地、胎仔牛血清（FBS）、ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン（ドイツ・Biochrom社）、ジメチルスルホキシド（DMSO）（ドイツ・Carl Roth GmbH+Co社）、MTT［3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド］（米国・Sigma-Aldrich社）、塩酸（ウクライナ・Kharkivreachim社）。

化合物の特性評価

溶解性向上のため、ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）のナトリウム塩を以下の反応で得た（図2）。

ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）のナトリウム塩による溶解化スキーム

トリクロロホスファゾトリクロロアセチル溶液（0.035 M、200 mlクロロホルム中）を、よく攪拌したナトリウムフェノキシド懸濁液（0.106 M、12.3 g、150 mlクロロホルム中）に緩やかに添加（図2、段階1）。混合物温度を40-50°C以上に上昇させない。約1時間攪拌継続後、70°Cまで加熱しこの条件で20分攪拌。生成物トリフェノキシホスファゾトリクロロアセチルを蒸発乾固。次に1 M NaOH 40 mlを添加し90分還流（図2、段階2）。結果の混合物を蒸発乾固。ジエチルエーテルで3回洗浄後、i-プロパノールから再結晶し白色結晶性粉末を得た（収率80%）。i-PrOH:H₂O（9:1 v/v）溶液の緩やかな蒸発で、X線解析に適したNaL・3H₂Oの無色結晶を得た。本化合物は空気安定で、水とアルコールに高溶解性。融点215°C。

HLは元素分析、IR、NMR分光法で同定：元素分析（C, H, N）はEL IIIユニバーサルCHNOS元素分析装置で実施。IRスペクトル測定はKBrペレット法で、パーキンエルマーSpectrum BX FT-IR分光計（分解能2 cm⁻¹、8スキャン蓄積、4000-400 cm⁻¹範囲）で実施。¹H NMRスペクトルはDMSO-d₆溶液で、室温でAVANCE 400ブルカーNMR分光計で記録。

HL: IR (cm⁻¹): 1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (アミドII); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN)。

¹H NMR (DMSO-d₆): 7.05 (t, 2H, γ-CH₂); 7.205, 7.255 (dt, 8H, α-およびβ-CH₂)。

CCl₃C(O)N(Na)P(O)(OC₆H₅)₂の元素組成：実測値%、C 40.58, H 2.35, N 3.15；計算値%、C 40.37, H 2.42, N 3.36。

C₆₀フラーレンの合成と特性評価

高安定性水溶性コロイド溶液のC₆₀フラーレン（200 μM、純度>99.5%、ナノ粒子平均サイズ50 nmまで）を、イルメナウ工科大学（ドイツ）で[17,18]に記載の方法で合成。

細胞培養

ヒト急性T細胞白血病CCRF-CM細胞株で実験実施。ライプニッツ研究所DSMZ（ドイツ微生物・細胞培養コレクション）から購入：CCRF-CM（ACC 240）。RPMI 1640培地に10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM グルタミンを補加、25 cm²フラスコで37°C、5% CO₂、加湿インキュベーターで培養。

RPMI 1640培地中の細胞を、C₆₀フラーレン（16 μM）またはHL（2.5, 5, 10 μM）単独および併用で24, 48, 72時間インキュベート。HLまたはC₆₀フラーレン無添加での細胞生存率を100%（対照サンプルは0.05 M DMSO含有）とする。

細胞生存率（MTT）アッセイ

MTT［3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド］還元アッセイで細胞生存率を評価[19]。指定時間点で、100 μlアリコート（0.5×10⁴細胞）を96ウェルマイクロプレート（ドイツ・Sarstedt社）に分注、各ウェルにMTT溶液（5 mg/ml、PBS中）10 μlを添加、37°Cでさらに2時間インキュベート。培地をDMSO 100 μlで置換、ジホルマザン生成を570 nm吸光度でマイクロプレートリーダー（スイス・Tecan Infinite M200 Pro）で測定。

動物

体重170±5 gの雄ウィスターラットで実施。タルタス・シェフチェンコ・キエフ国立大学「生物学・医学研究所」附属動物飼育施設で標準条件下で飼育。餌と水は自由摂取。上記機関の生物倫理委員会管理下、ヨーロッパ評議会脊椎動物保護条約の国際原則に従い実施。

赤血球溶血の評価

ウィスターラットのヘパリン化血液から赤血球を採取、0.85% NaCl溶液で0.700 o.u.（630 nm、ドイツ・Scinco分光光度計）に希釈。0.001 N HClで溶血誘発。溶血キネティクスを分光光度法（λ=630 nm）で2分間、毎10秒測定。溶血赤血球率を[20]の方法で算出。赤血球を0.85% NaCl溶液中でC₆₀フラーレン（16 μM）またはHL（2.5, 10 μM）単独および併用で1時間インキュベート。無添加赤血球を100%（対照は0.05 M DMSO含有）とする。

インシリコ研究

PDB（プロテインデータバンク）ベースから二重らせんDNA分子をテンプレートとして使用。DNA分子とHLの単独およびC₆₀フラーレンとの組み合わせでの相互作用を研究。以下のDNA構造を考慮：2MIW（CCATCGCTACC - DNAらせんの小溝への挿入）、1XRW（CCTCGTCC - 小溝への挿入）、2M2C（GCGCATGCTACGCG - 大溝と小溝の両方への結合）。QXPパッケージに組み込まれた系統的ドッキングアルゴリズム（SDOCK+）を適用（この手法は、最小RMSD値を持つ研究対象構造の可能な全コンフォメーションを示す）[21]。DNAとの潜在的複合体300個を生成、スコアリング関数（QXPパッケージ組み込み）で上位10個を選択[22]。

DNA分子とHL単独およびC₆₀フラーレンとの組み合わせでの相互作用を以下のパラメータで評価：(1)水素結合数、(2)DNAと対応構造の接触表面積、(3)DNAとドッキング構造の距離、(4)結合構造の全エネルギー。

化合物とC₆₀フラーレンの複合体安定性評価のため、Gromacsソフトウェアツール[23]を用いて短い分子動力学（MD、100 ps）を実施。Nosé-Poincaré-Andersonアルゴリズム（NPA）[24,25]に基づくOPLS-AAフォースフィールド[26,27]を使用。

計算パラメータ：温度300 K、圧力100 kPa、水素原子またはリガンドを介する結合はアルゴリズム[25]で制限。

統計解析

データは4回以上の独立実験の平均±SDで表示。各群の平均（M）と標準偏差（SD）を算出。二元配置分散分析に続きボンフェローニ事後検定で統計解析。p<0.05を統計的有意とする。データ処理とプロットはIBM PCでGraphPad Prism 7（米国・GraphPad Software社）を使用。

結果と議論

インシリコ研究

HLとDNAの相互作用

HLがDNAに挿入し、AGC-GCTAヌクレオチドを介してマイナーグルーブに結合して安定複合体を形成することが示された（図3a）。この場合、Aヌクレオチドの塩基とHLフェニル基のスタッキング相互作用、およびCCl₃基とCヌクレオチドの静電相互作用が形成される。MDシミュレーション後、DNA二重らせんとHLのRMSD値はそれぞれ3.3と1.62 Å。HLのヌクレオチド環境（GCA-CTA）は部分的に変化しスタッキング相互作用は失われたが、GヌクレオチドとHLのCO基の間に水素結合が形成された。

ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）とDNA分子の相互作用： a, b マイナーおよびメジャーグルーブへの結合； c マイナーグルーブへの挿入。使用PDB構造： a, b 2M2C、 c 1XRW

HLのメジャーグルーブへの結合はTCG-ATヌクレオチドを介して起こった（図3b）。HLのCO基とAヌクレオチド塩基の水素結合、両HLフェニル基とC, Gヌクレオチド塩基のスタッキング相互作用が形成。さらに、HL CCl₃基とATヌクレオチド塩基の静電結合の可能性が出現。

MDシミュレーション後、HLのヌクレオチド環境に変化なし。DNAとHLのRMSD値はそれぞれ2.77と1.58 Å。これによりCヌクレオチドとフェニル基のスタッキング相互作用が消失。

HLのDNAへの挿入ケースでは、環境はCG-CGヌクレオチドで構成された（図3c）。CGヌクレオチドとのスタッキング相互作用が出現：1つのフェニル基が塩基間にはさまれ、もう1つがCヌクレオチドとスタッキング相互作用。

MDシミュレーション後、DNA二重らせんとHLのRMSD値はそれぞれ1.71と1.89 Å。HLのヌクレオチド環境は不変。フェニル基の1つがGヌクレオチド塩基とイオン-π相互作用を形成、1.12 Åシフトしたことが判明。

得られたエネルギーパラメータは、DNAとHL間およびHL内部の立体障害エネルギーが無視できることを示す（表1）。

HLのマイナー・メジャーグルーブ結合とマイナーグルーブ挿入のエネルギーパラメータ比較解析を実施。バンプ値はHL挿入で6.2 kJ/mol、マイナー・メジャーグルーブ結合で2.5 kJ/mol（表1）。イント値は挿入で8.7 kJ/mol、メジャーグルーブ結合で6.3 kJ/mol、マイナーグルーブ結合で3.6 kJ/mol。これらのデータは、HLのDNAマイナーグルーブへの結合が最も安定であることを示す。

HLとC₆₀フラーレンのDNAとの複合相互作用

以前、コンピュータシミュレーションでC₆₀分子がDNAと相互作用し、DNAマイナーグルーブへの結合で安定なC₆₀+DNA複合体を形成することを実証した[15]。図4に示す通り、C₆₀フラーレンはHL分子のCCl₃基とイオン-π結合も形成可能。

ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）とC₆₀フラーレンのDNAとの複合相互作用（HL+C₆₀またはC₆₀+HLバージョン）： a, b マイナーおよびメジャーグルーブへの結合、 c, d マイナーおよびメジャーグルーブへの挿入。使用PDB構造： a, b 2M2C、 c 1XRW、 d 2MIW

[16]で提案され、MDシミュレーション結果の解釈に有用と実証された2つの分子モデリングバージョンを使用。HLが先にDNAに挿入しその後C₆₀が挿入するバージョン（HL+C₆₀）には1XRW PDB構造を、C₆₀が先に挿入しその後HLが挿入するバージョン（C₆₀+HL）には2MIW PDB構造を使用。

HL+C₆₀バージョンのマイナーグルーブ結合はGCTA-GCATヌクレオチドで起こった（図4a）。フェニル基がマイナーグルーブを埋め、スタッキング相互作用に参加：1つはC₆₀フラーレンと、もう1つはGヌクレオチド塩基と。静電相互作用がHLのCCl₃基とGヌクレオチド塩基およびC₆₀フラーレンの両方で生じた。

MDシミュレーション結果によると、この場合DNA二重らせんは相当の可動性を示す（RMSD 3.08 Å）、HLのRMSDは2.04 Å、C₆₀フラーレンはほぼ不動。結果としてHL+C₆₀構造のヌクレオチド環境はTGC-GCATGに変化。さらに、HLアミノ基とDNAの水素結合、GC塩基のヌクレオチドとC₆₀フラーレンのスタッキング相互作用が出現。

HL+C₆₀のメジャーグルーブ結合はC-ATCCヌクレオチドで起こった（図4b）。HL CO基とAヌクレオチド塩基の水素結合形成。フェニル基がメジャーグルーブを埋め、C₆₀フラーレンとスタッキング相互作用。

MDシミュレーション結果、HL+C₆₀構造のヌクレオチド環境は不変：DNAとHLのRMSD値はそれぞれ3.14と2.24 Å、C₆₀フラーレンはほぼ不動。この場合、HLとC₆₀フラーレン間の全相互作用が消失し、HLはDNAと立体的にのみ相互作用。結果としてC₆₀フラーレンとHLの両方がメジャーグルーブから押し出されると推測。

HL+C₆₀がマイナーグルーブに挿入される場合（図4c）、CGT-GAGヌクレオチドで結合。C₆₀フラーレンがマイナーグルーブに組み込まれ立体的に相互作用。HLフェニル基がCG-CGヌクレオチド塩基とスタッキング相互作用形成。MDシミュレーションではDNAとHLのRMSD値はそれぞれ2.29と2.13 Å、C₆₀フラーレンはほぼ不動、HLのCC1₃基がGヌクレオチド塩基と静電相互作用。

C₆₀+HLバージョンでは、マイナーグルーブ結合（図4d）がCGC-GCCヌクレオチドで起こった。HLフェニル基の1つがC₆₀フラーレンと、もう1つがGヌクレオチドとスタッキング形成。HLのCC1₃基がCヌクレオチド塩基と静電結合形成。MD解析ではDNAとHLのRMSD値はそれぞれ2.35と2.75 Å、C₆₀分子は不動、C₆₀+HL構造のヌクレオチド環境はCGCT-GCに変化。さらに、C₆₀分子がDNA深く侵入し、Cヌクレオチド塩基とスタッキング相互作用形成。

計算エネルギーパラメータによると、C₆₀+HLのマイナーグルーブ挿入ケースで形成される複合体が最も剛直（バンプ値20.0 kJ/mol）（表1）。対照的にHL+C₆₀のDNA相互作用では、マイナーグルーブ挿入で6.2 kJ/mol、マイナーグルーブ結合で7.8 kJ/mol、メジャーグルーブ結合で8.8 kJ/mol。また、HL+C₆₀+DNA複合体内で強い水素結合形成が可能なのはメジャーグルーブ結合ケースのみ（Hbnd値-2.3 kJ/mol）、他では0または-1.0 kJ/mol（表1）。さらにMD結果ではこのケースでC₆₀フラーレンとHLの両方がメジャーグルーブから変位することが示された。

したがって、C₆₀+HLのマイナーグルーブ結合が、C₆₀フラーレン、HL、DNAの複合相互作用の最も確からしいバージョンと示唆される。

HLの生物学的効果のインビトロ研究

CCRF-CEM細胞生存率

インビトロ実験で、ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）の長期影響（2.5-10 μM範囲）をMTT試験でヒト白血病CCRF-CEM細胞の生存率に対して評価。RPMI 1640培地で、16 μM C₆₀フラーレンまたはHL単独または併用で24, 48, 72時間インキュベート。C₆₀またはHL無添加での細胞生存率を100%とする。

24時間インキュベーションではHLのCCRF-CEM細胞生存率への影響は観察されなかった（図5）。より長時間では、5と10 μM濃度でのHL細胞毒性が明確に：48時間で生存率がそれぞれ25%と33%阻害され、72時間でさらに低下。

様々な濃度のジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）でインキュベートしたCCRF-CEM細胞の生存率。（M±m, n=8）； *p<0.05 対照細胞比

CCRF-CEM細胞生存率の50%減少（IC₅₀）が、HL 10 μM濃度作用下で72時間に検出された（図5）。最近、別のCAPh代表化合物ジモルフォリド-N-トリクロロアセチルホスホリルアミドが、72時間で1 mM濃度でCCRF-CEM細胞生存率50%減少を引き起こすことを示した[16]。これらのデータ比較から、CAPh誘導体構造のモルフォリド基をフェノキシ基に置換することで、白血病細胞に対する有効毒性濃度を2桁低下させられることが示唆される。–P(O)(OC₆H₅)コアのコンフォメーション柔軟性が、この化合物のDNAとのより効果的な相互作用を確保したと推測。

単独使用のC₆₀フラーレンがインキュベーション期間中の細胞生存率に影響を与えないことを確認（データ未提示）。一方、図6の結果はC₆₀フラーレンがHLのCCRF-CEM細胞に対する細胞毒性活性を増強することを示す。C₆₀フラーレンとHLの併用では、HL単独作用時よりも低いHL濃度（5 μM）と早期（48時間）で50%生存率減少が観察された。さらに、72時間併用ではHL単独では無影響だった低濃度2.5 μMでHLの細胞毒性効果が検出された（図6）。

ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）単独または16 μM C₆₀フラーレンとの併用でインキュベートしたCCRF-CEM細胞の生存率。（M±m, n=8）； *p<0.05 対照細胞比； #p<0.05 HL比

したがって、C₆₀フラーレンがHLの細胞毒性効果を増強し、低濃度で白血病細胞の感受性を有意に高めることが示された。C₆₀フラーレンが24時間以上で白血病細胞内に蓄積[28]し、細胞内小器官[29-31]、特に核[32,33]に局在することを考慮すると、活発に増殖するがん細胞の核DNAとの相互作用は除外できない。

以上のインビトロデータはインシリコ研究結果と整合し、C₆₀分子の初期結合とその後のHLのマイナーグルーブ結合による安定複合体形成が、CCRF-CEM細胞増殖の相乗的阻害の一因となり得ることを示唆。

赤血球の溶血抵抗性

HLとC₆₀フラーレン併用の抗がんポテンシャル評価において、非悪性細胞、特に血液細胞への影響を考慮することは重要。

酸性溶血に対する赤血球抵抗性の研究により、薬理学的作用物質の膜レベルでの影響を解明可能。溶血ダイナミクスは赤血球形質膜破壊のダイナミクスを反映し、その構造的組織の安定性を示す。図7に、対照（添加物なしNaCl溶液）およびHLまたはC₆₀フラーレン単独または併用で1時間インキュベートした赤血球の溶血率依存性を示す。16 μM C₆₀フラーレン単独の赤血球溶血への影響は検出されず（未表示）。HL 2.5 μM濃度単独またはC₆₀フラーレンとの併用は赤血球の溶血抵抗性に影響せず（図7）。一方、HL 10 μM濃度では20秒で最大となる溶血加速が検出。10 μM HLとC₆₀フラーレンの併用では、さらに溶血が増強され、20秒で60%の溶血赤血球を示した。

ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）単独および16 μM C₆₀フラーレンとの併用における赤血球の溶血抵抗性。（M±m, n=8）

得られたデータは、C₆₀フラーレンと2.5 μM HLの併用が血液赤血球膜の構造的安定性に有害な影響を及ぼさず、同時にこの低濃度でHLの白血病細胞に対する細胞毒性活性を有意に増強できることを示す。C₆₀フラーレンとHL 10 μM濃度の併用が白血病細胞に対して相乗的細胞毒性効果を示すにもかかわらず、その適用は溶血効果の増強によって制限される。

最後に、上記インビトロ研究の文脈において、水/固体界面には閉じ込められた水が存在し、これもナノ構造の輸送・熱力学的特性[34,35]や細胞膜との相互作用[36]に影響を与え得ることを強調しておく。

カルバシルアミドリン酸塩誘導体の細胞内局在に関する文献データ、特にホスホルアミド酸塩の細胞内浸透がある。ホスホルアミド酸塩誘導体が乳がんMDA-231細胞株と肺がん（H460, H383, H2009）細胞株の膜を透過することが示されている[37]。ニトロベンジルホスホルアミドマスタードが細胞膜を透過し、NTR⁺哺乳類細胞のミトコンドリアに局在することが示されている[10]。C₆₀フラーレンが受動拡散やエンドサイトーシスでがん細胞膜を透過[28,30,32]し、核とミトコンドリアに蓄積[30,32,33]できることを考慮すると、小分子抗腫瘍薬のトランスポーターとなり得る[38-40]。

結論

ホスホリル基近傍に2つのフェノキシ置換基を持つカルバシルアミドリン酸塩誘導体の新規代表化合物、ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩（HL）を合成し、単独およびC₆₀フラーレンとの組み合わせで細胞毒性剤として評価した。分子シミュレーション結果によると、C₆₀フラーレンが先に結合しその後HLがマイナーグルーブに結合すると、HLフェニル基のC₆₀フラーレンおよびDNA Gヌクレオチドとのスタッキング相互作用、HL CCl₃基のC₆₀分子とのイオン-π結合およびDNA Gヌクレオチドとの静電結合によって安定化された剛直な複合体が形成される。

MTT試験により、ヒト白血病CCRF-CM細胞に対するHLの細胞毒性活性を示し、IC₅₀値が72時間処理で10 μM濃度で出された。HLの細胞毒性効果はC₆₀フラーレンによって促進される。16 μM C₆₀フラーレンとHLの併用では、IC₅₀がより低い5 μM HL濃度とより早い48時間で検出され、さらにHL単独では無影響だった2.5 μM濃度でもHLの細胞毒性効果が観察された。

以前、ジモルフォリド-N-トリクロロアセチルホスホリルアミドが異なる由来のヒト白血病細胞に対して有意な毒性効果を示すが、有効濃度が高くC₆₀フラーレンとの併用による毒性増強は観察されなかった[16]。–P(O)(OC₆H₅)基の導入がモルフォリド基に代わってCAPh誘導体に柔軟性を与え、ヒト白血病細胞に対する毒性濃度を低下させ、C₆₀分子とDNAとの効果的な相互作用を確保したと推測。C₆₀フラーレンとHLのマイナーグルーブ結合による安定複合体形成が、CCRF-CEM細胞増殖の相乗的阻害の一因であると推定。

C₆₀フラーレンと2.5 μM HLの併用が血液赤血球膜の構造的安定性に有害な影響を及ぼさないことを明らかにした。一方、C₆₀フラーレンと10 μM HLの併用は溶血効果の増強によって適用が制限される。

したがって、C₆₀フラーレンがHLの細胞毒性効果を増強し、低濃度でヒト白血病細胞の感受性を有意に高めることを示した。低濃度2.5 μMでのC₆₀フラーレンとHLの組み合わせは、更なる生物医学研究に有望である。

略語

DMSO:

ジメチルスルホキシド

DNA:

デオキシリボ核酸

FBS:

胎仔牛血清

HL:

ジフェニル-N-(トリクロロアセチル)-アミドリン酸塩

IR:

赤外分光法

MD:

分子動力学

MTT:

3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド

NMR:

核磁気共鳴

RPMI-1640培地:

ロズウェルパーク記念研究所培地