小胞および細胞の周波数変調波誘電泳動：クロスオーバー周波数での周期的Uターン

背景

電気表現型の分極率は、主に、印加された電界の周波数に依存する細胞膜および細胞質の電気的特性によるものです。したがって、個々のセルは、非侵襲的な電気技術を使用した誘電スペクトルの違いによって識別できます。電気技術は現在、未知のサンプルから有用な表現型を持つ細胞を分離する能力があります[1–15]。他の分離方法と比較して、これらは抗体による細胞修飾や異物への付着が不要であるという大きな利点を提供し、それによってこれらのプローブによる細胞損傷または活性化の可能性が回避されます[1–16]。セルラー誘電特性の特性評価は、主にインピーダンス分光法[10、12、13]、または誘電泳動（DEP）、進行波DEP（twDEP）、電気回転[1、 9、15]。その中で、AC-DEP法を拡張して、ACフィールドの代わりに周波数変調（FM）波を使用する誘電特性評価の新しい方法を開発することに焦点を当てています。

一般に、DEPは電界勾配で発生し、勾配ベクトルだけでなく、クラウジウス・モッソッティの実数部によっても決定される方向に、帯電または中性の分極性物体に作用する動電学的力を生成します。 CM）係数[1–15、17–21]。たとえば、AC電界によって誘発されるDEP力を考えます E _AC （ r 、 t ）その時空依存性は E として表されます _AC （ r 、 t ）= A （ r ）cos θ _AC （ r 、 t ）振幅ベクトル A を使用 （ r ）およびフェーズθ _AC （ r 、 t ）。 AC-DEP力は、振幅の空間勾配（つまり、∇ A ）によって生成されます。 ）上記のように、CM係数の実数部を掛けますが、位相の空間勾配（つまり、∇θ _AC ）CM係数の虚数部を掛けると、twDEPまたは電気回転のいずれかの力が発生します。これにより、誘電特性の観点からAC-DEP法に補足的な情報が提供されます[9、15、20、21]。

この手紙では、FMフィールドによって誘導されるDEP力を定式化し、ACおよびFM-DEP法を比較して、ACフィールドもFMフィールドも位相の空間依存性を考慮しないようにすることを目的としています。したがって、θを設定します _AC （ t ）=2 π f _AC t 適用された周波数に比例して f _AC 。 AC-DEPの重要な特徴は、力の方向とその強さが f に依存することです。 _AC 。最も注目すべきは、力の方向がクロスオーバー周波数 f で逆になっていることです。 _AC = f _X AC-DEP [1–15]を使用した誘電特性評価に利用できることがわかっているCM係数の実数部の符号が変更されたためです。

AC-DEP力の周波数依存性により、次の操作も可能になりました[1–15、22–31]：コロイド粒子の電気的に制御可能なトラップ、集束、および並進、ならびに生体および/またはの分別および特性評価死んだ細胞。コロイド粒子の誘電泳動アセンブリおよび/または操作のための従来のシステムは、しばしば、AC電場がコロイド懸濁液に印加された微細加工電極を利用しており、集積半導体デバイスの製造における最近の急速な進歩の恩恵を受けている[24–30]。 。非接触操作を提供するこのテクノロジーは、現在、正確で再現性のある処理の利点を提供するさまざまなラボオンチップシステムと統合されています。それにもかかわらず、ACフィールドに高強度のスポットを作成するオンチップ電極は、光学操作で自由に配置できるレーザーフォーカスとは対照的に、サンプルホルダーとは無関係にそれらの位置を変更することができません。オンチップシステムの制限から、以前のDEP方式では、光ピンセットが適しているタイプの操作を実行する際に、いくつかの困難と複雑さが見られました。これらの困難を克服するための候補となる方法は、光学画像駆動型DEP [32]です。

ここでは、より簡単な代替手段として、光学装置なしでのオンデマンド誘電泳動アセンブリおよび/または操作のための電子ピンセット技術の1つ[22、23、33–38]を採用しました（図1を参照）。図1からわかるように、私たちのプラグインスタイルのシステムは、コロイド懸濁液に外部電界を印加するためにマイクロマニピュレーターによって制御される一対の微小電極針を使用しています。電極プローブは固定されていませんでしたが、プラグインスタイルのためにコロイド懸濁液で移動可能でした。ただし、誘電特性評価を実際に使用するには、重要な要件が残っています。塩分を含んだ電解質に囲まれたセルに電界をかける時間を最小限に抑える必要があります。たとえば、AC-DEP法では、マイクロ流体システムに埋め込まれたくし状の電極を交互に使用するため、さまざまな周波数のACフィールドを細胞懸濁液に同時に適用できます[24–30]。このような洗練されたオンチップシステムは誘電体の特性評価に関連することがわかっていますが、多電極ペア技術は、電子ピンセット技術でよく使用されている単一電極ペアシステムには適用できません[22、23、33–38]。 。

実験のセットアップ。パッチクランプマイクロマニピュレーターによって制御される一対の電極針を介して標的粒子に印加されるACまたはFM電場を示す誘電泳動操作システムの概略図

単一電極ペアシステム（図1）を使用して同時多周波測定を実行するには、印加電界の変化を調査する必要があります。この手紙では、次の形式のFM波（FM-DEP）による時変DEPの可用性について説明します。

ここで、フェーズθ （ t ）FM波のは瞬間周波数 f に関連しています （ t ）as 2 π f （ t ）= d θ （ t ）/ d t および

f で _m 変調周波数を示します。 Δを満たす広帯域FMを使用します f / f _m ≫1、 f の条件 _m / f （ t ）、 f _m / f _c 、 f _m / Δ f ≪1は、以下の理論的定式化では広帯域限界（WBL）と呼ばれます。

この手紙では、 f の特徴的な頻度の関係に特に注意が払われています。 _X そしてFM-DEPの軌道。次のセクションでは、FM-DEPを誘導するために使用される材料とプラグインシステムの詳細の両方について説明します。 3番目のセクションでは、4つの部分で構成される結果と説明を提供します。まず、周期性が変調周波数 f によって説明される往復軌道を定量化することにより、単一の白血病細胞の繰り返しUターンの詳細を調査します。 _m 、または f の周期的な振動 （ t ）式で与えられます。 （2）。次に、瞬間周波数 f に応じて変調する時変誘電泳動力を導出することにより、往復軌道を理論的に説明します。 （ t ）WBL条件を満たすFMフィールドの。得られた誘電泳動力の形式は、 f を決定する方程式を提供します。 _X 観測されたUターンから。第三に、AC-DEPの引力により電極針に取り付けられた多層ベシクル（MLV）の誘電泳動力の大きさを測定します。力の周波数依存性は、CM係数の実数部から決定されたスペクトル方程式を使用して適合されたため、 f _X AC-DEPによる引力が消失する特性周波数として決定されました。 FM-DEP法でも f が得られるため _X MLVの往復軌道を分析することにより、AC-DEPとFM-DEPから評価されたクロスオーバー周波数間の一致の程度を評価します。最後に、3種類の細胞の細胞質伝導率と膜容量の両方を f から評価しました。 _X 溶液の導電率の増加関数として、得られた値を文献で報告されている値と比較しました。

メソッド

資料

マルチラメラベシクル（MLV）の調製には、Avanti Polar Lipidsから購入した1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（DOPC）を脂質として使用しました。 MLVは、次の手順で取得しました。クロロホルム/メタノール（2：1 v ）に溶解したDOPC（1 mL、20 mM） / v ）N ₂ で乾燥させた ガス、および溶媒を真空下で12時間以上完全に除去した。蒸発によりガラスバイアルに付着した薄膜を脱イオン水で再水和し、25°Cで数時間インキュベートしました。

実験に使用した2つの細胞株は、ヒトT細胞白血病（TL）株のJKT-beta-delとヒトB細胞白血病（BL）株のCCRF-SBでした。 5 ％を含む加湿インキュベーターで1週間培養した後、両方の種類のTL細胞とBL細胞を使用しました。 CO ₂ 37で、細胞濃度が0.5×10 ⁶ の範囲内になるようにします。 〜1×10 ⁶ 細胞/ mL。細胞培養用のRPMI1640培地には、10％胎児ブロビン血清と100mMピルビン酸ナトリウムを添加しました。 370 g での遠心分離により細胞を沈降させた ピペッティングの前に細胞を1mlのRPMI1640培地に純粋に再懸濁できるように、3分間2回。得られた細胞懸濁液を、必要な導電率を有する溶媒を調製するために、等張性の200mMショ糖溶液を使用してさらに希釈した。

また、以下の懸濁液に分散したヒト赤血球（RB）細胞を使用しました。採取したばかりの全血サンプルは、20代前半の健康なボランティアから入手しました。 RPMI 1640培地と3.1％のヘマトクリット値の混合物に懸濁した細胞を、必要な導電率を持つ溶媒と上記の白血病細胞を調製するために、等張性200mMスクロース溶液を使用して希釈しました。ヒトRB細胞を使用した誘電泳動実験はすべて、全血サンプルを採取してから10分以内に終了しました。

実験のセットアップ

細胞懸濁液の導電率は、導電率計（SevenMulti、Mettler-Toledo、Columbus、OH、USA）を使用して測定しました。使用したプラグインシステムの概略図を図1に示します。AC波またはFM波の外部電界を、任意波形発生器（Agilent 33220A、Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）を介して電流を流して印加しました。プラグインタイプの微小電極が接続されたアンプ（F30PV、FLC Electronics、Partille、スウェーデン）。微小電極は、先端の直径が0.5 μのタングステン針で構成されていました。 2セットのパッチクランプマイクロマニピュレーター（NMN-21、世田谷区成重、東京、日本）によって独立して制御されたm。以降のすべての実験では、チップの間隔を100 μに維持しました。 m上記のサスペンションに外部電界を印加する場合、最大マグニチュードは0.5 kV / cmに設定されました。倒立光学顕微鏡（TE2000-U、東京都港区ニコン）に取り付けたサンプルドロップに針ペアを挿入し、CCDカメラ（Retiga Exi、QImaging、サリー、ブリティッシュコロンビア）を使用して光学顕微鏡写真を取得しました。ブリティッシュコロンビア州、カナダ）25fpsのフレームレート。ちなみに、フレームレートによるFM波の周波数分解能は、常に各データのエラーバー内にあることが確認されました。 50- μ 温度をヒートコントローラーを使用して25°Cに維持した倒立光学顕微鏡のサンプルステージに、懸濁液を1滴滴下しました。

プラグイン技術により、シンプルなシステムで単一セルのさまざまな非接触操作を実行できます。たとえば、接触せずに狭いチャネルに押し込み、目的の方向に向けることができます。等張液中の細胞を塩で処理する必要がある場合が多いですが、脱イオン水に囲まれた細胞の上記のDEP操作を実装するのが最も簡単です。追加ファイル1：映画S1からS3では、プラグインシステムが脱イオン水に懸濁した珪藻細胞のAC-DEPを誘発しました。追加ファイル1：映画S1からS3から、無塩水に分散した異方性珪藻細胞が、AC電界（1 kV / cm）が印加された一対の微小電極によってポストイットタグのように操作されたことがわかります。 。非接触操作は3つのステップで構成されます：（i）ターゲットセルは最初に30 kHzの周波数での双極子アライメントと各微小電極の位置変化の組み合わせによって正に帯電したガラス壁と平行に回転しました（追加ファイル1：ムービーS1 ）、（ii）続いて周波数を100 kHzに変更して壁に向かって押し、要求セルをガラス表面に負電荷で静電的に固定し（追加ファイル1：ムービーS2）、（iii）AC周波数を調整しましたAC-DEPを反対方向に誘導するために20MHzまで。これにより、静電的に付着したセルを引き出すことができます（追加ファイル1：ムービーS3）。

結果と考察

FM-DEPを経験している白血病細胞の実験的観察

当社のプラグイン微小電極（図1を参照）により、サンプル基板のはるか上に浮かぶ粒子に電界をかけることができます。これは、適切な細胞を選択するために実用的です。たとえば、追加ファイル1：ムービーS4は、微小電極ペアが、0.5秒間隔で100〜500kHzの周波数ジャンプでAC電界を印加した浮遊三角珪藻セルに近づくように制御されたことを示しています。追加ファイル1：ムービーS4では、FM-DEPを使用した次の操作に先立つ予備的な結果として、周波数ジャンプのために微小電極上で三角形のセルが跳ね返っています。

追加ファイル1：映画S5およびS6は、FM-DEPを経験しているいくつかのTL細胞の典型的な動作を示しています。これは、単一電極AC-DEPを使用して電子ピンセットで操作される哺乳類細胞の動作と似ています[36]。図2は、（ x の3Dプロットを使用した周期的な軌跡の1つを示しています。 、 y ） t に沿って 軸。ここで、（ x の相対座標 、 y ）は、細胞-電極構成を抽出するための微小電極針の特定の点にある（0、0）の原点を持つ一時的な細胞位置に割り当てられます。 x 軸は、（0、0）、 y での電極表面への接線を表します 接線に垂直な軸は、主に以下で説明する周期的なUターンの投影を反映します。図2では、変調周波数 f のFM電界を印加したフローティングTLセルを選択しました。 _m f に設定 _m =200kHzの範囲で0.25Hz≤ f （ t ）≤3MHz。そのΔがあるからです f / f _m 、 f （ t ）/ f _m <10 ^-5 、式の後に述べたように、WBL条件は実際に成り立ちます。 （2）。

ターゲットTLセルの3D軌跡。 FM-DEPを受けているTLセルの周波数変調による周期的なUターンが示されています

追加ファイル1：ムービーS5とS6、および図2から、周期的な軌道は、微小電極を離れる、近づく、とどまるという3つの部分で構成されていることがわかります。（i）細胞が微小電極を離れる、（ii） Uターンを行った後、微小電極に接近し、（iii）微小電極表面に留まります。溶媒の流れのために、細胞は微小電極表面の同じ位置に戻れないことがよくあります。これは、追加ファイル1：ムービーS6で観察されるだけでなく、細胞が<で移動するUターンによっても表されます。 i> x 図2の方向。溶媒の流れとの干渉にもかかわらず、細胞が微小電極表面を離れ始め、周期的な軌道でそれぞれUターンする瞬間を区別することができます。したがって、図2から、これらのUターンは0.25Hzの変調周波数または瞬間周波数 f の4秒周期と一致して4秒間隔で繰り返されることがわかります。 （ t 。

FM-DEPに関する理論的研究

周期的なUターンを含む実験の軌跡を説明するために、球形のオブジェクトを単一セルの簡略化されたモデルと見なします。このモデルには、任意の時間変化する電場があります E （ r 、 t ）が適用されます。図3は、球形の物体に作用する時間依存のDEP力の概略図を示しています[9]。図3に示すように、球形の物体内の誘電率と導電率はεで表されます。 _in およびσ _in 、それぞれ、およびεなどの添え字「out」 _out およびσ _out 、は外側を示します。一般的に、 F _DEP （ r 、 t ）は、誘導双極子モーメント p に関連しています。 （ r 、 t ）as [17–19]

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理論モデル。 εの誘電率と導電率を持つ均質球モデルとしてモデル化されたセルに加えられるFM-DEP力の概略図 _in およびσ _in 、 それぞれ。球は、誘電率と導電率がεの電解質媒体に囲まれています。 _out およびσ _out 、 それぞれ。均質球モデルは、細胞を膜に囲まれた細胞質にまみれたものと見なす球形の単一殻モデルを単純化したものです[9]

ここで K _H およびΔ τ 次のように定義されます： K _H =（ε _in − ε _out ）/（ε _in +2 ε _out ）、および\（\ Delta \ tau ^ {-1} =\ tau _ {0} ^ {-1}-\ tau ^ {-1} \）半径 R を使用 球形オブジェクトの2つの特徴的な時間τ ₀ =（ε _in − ε _out ）/（σ _in − σ _out ）およびτ =（ε _in +2 ε _out ）/（σ _in +2 σ _out 。

AC電界の置換 E _AC （ r 、 t ）= A （ r ）cos（2 π f _AC t ）式に。 （3）から（5）まで、平均DEP力< F を取得します。 _DEP （ r 、 t ）> ACフィールドのサイクル全体で平均化されている[9、15、20]：

ここで、 A _RMS は、\（\ boldsymbol {A} _ {\ text {RMS}} ^ {2} =\ boldsymbol {A} ^ {2} / 2 \）、およびχを満たす二乗平均平方根（RMS）ベクトルを示します。 （ f _AC ）≡2π R ³ ε _out Re [ K （ f _AC ）]適用される周波数 f によって異なります _AC Re [ K による （ f _AC ）]、CM係数の実数部[9、15、20]：

ここで K _L =（σ _in − σ _out ）/（σ _in +2 σ _out ）および K _H 上で定義された、は、それぞれ低周波数と高周波数の制限の実際のCM値、およびこれらの制限値 K に対応します。 _L および K _H 、 f になるように、反対の符号を付ける必要があります _X χで定義 （ f _X ）=0が存在する可能性があります[9、15、20]。

式（6）および（7）は、AC電界がDEP力を生成し、その方向が適用される周波数 f に依存することを示しています。 _AC χを介して （ f _AC ）式で与えられます。 （7）、追加ファイル1：ムービーS4のバウンドする珪藻セルを次のように説明します（図3も参照）。適用された周波数がCM係数の実数部のプラス記号を提供する場合（つまり、χ （ f _AC ）> 0）、一対の電極針を介して加えられたAC電界の強度が最大である電極針の先端（正のDEP）に引き付けられた細胞を観察することができます。 f では、実際のCM係数の符号を負に反転させることができます。 _X 、実際のCM係数の消失頻度（つまり、χ （ f _X ）=0）、ここで、式（1）から求められる誘電泳動力はゼロです。 （6）。 CM係数の負の符号（つまり、χ （ f _AC ）<0）、個々のコロイドは電極針ペア（負のDEP）からはじかれます。追加ファイル1の三角形の珪藻セル：ムービーS2は、周波数が100kHzと500kHzのACフィールドによって誘導されたAC-DEPの方向が反対であるために跳ね返りました。式を組み合わせる（6）と観察された誘電泳動の方向から、χ （100 kHz）> 0およびχ （500 kHz）<0。

次に、式（1）で与えられる位相を差し込むことによってFM-DEPを検討します。 （1）と（2）を式に代入します。 （3）から（5）。追加ファイル2で証明されているように、FM波のWBL条件は、式（1）の積分の近似形式を検証します。 （5）、それによって

これは、時間依存周波数 f の場合、AC-DEPと同じ形式になります。 （ t ）は f の一定頻度に置き換えられます _AC 。したがって、平均DEP力< F の極限形式が得られます。 _DEP （ r 、 t ）> θのサイクルで平均化されています （ t ）FMフィールド（追加ファイル2の式（A1）、（A13）、および（A14）を参照）：

式と同様の形式である。 （6）AC-DEPの場合。違いは、χの係数かどうかです。 { f （ t ）}は t に依存します f を介して （ t ）、これは T の周期で周波数変調に従って周期的に変化します _m =1 / f _m 。

FM-DEPの簡単な式（9）に基づいて、FM波による上記のUターンのメカニズムを図4に示します。図4は、 f の範囲でWBLのFM波によって誘導されるDEPの概略図を示しています。 （ t ）クロスオーバー周波数 f をカバーします _X f のように _c − Δ f ≤ f _X ≤ f _c + Δ f 。図4では、CM係数の実数部の周波数依存性、つまりχが想定されています。 { f （ t ）}、次のように代替符号の変更を提供します：マイナス記号（χ { f （ t ）} <0）for f （ t ）< f _X およびプラス記号（χ { f （ t ）}> 0） f の場合 （ t ）> f _X 、これは私たちの実験の場合です。 f を満たす前の期間 （ t ）< f _X 持続時間はありますが、後者の f （ t ）> f _X 残りの期間中は保持されています。1つのサイクルは、図4でそれぞれ赤と青でマークされた2つの期間に分類されます。

周波数変調に関連する力の方向。時間依存周波数が f のFM波による周期的なUターンの図 （ t ）クロスオーバー周波数をカバーする f _X

AC-DEPと同様に、式。 （9）は、マイナス記号（χ { f （ t ）} <0）は、 f を満たしながら、セルと微小電極の間に反発するDEP力を生成します。 （ t ）< f _X 。その結果、細胞は、電界の大きさが最大となる微小電極の針先の周りの領域を離れます。細胞は、Δの赤い期間中に負のDEPを経験します。 t _n 図4の瞬間 t _X f の解決策として （ t _X ）= f _X 、χ （ f ）が消え、その後にχへの符号の変更が続きます （ f ）> 0 while f （ t ）> f _X 、それに対応して、DEP力は t で引力に切り替えられます _X 。 t でUターンした後 _X DEP力の方向が逆転するため、標的細胞は微小電極に近づき始め、反対方向に移動し、最終的に電極針の先端の間に閉じ込められるか、電極の1つに付着します。 Δの青い期間 t _p 図4は、微小電極を離れる、近づく、とどまるというサイクルを、 T の変調周期で繰り返す必要があることを示しています。 _m 、図2と一致：Δ t _n + Δ t _p = T _m 。したがって、図4に示されている誘電泳動メカニズムは、追加ファイル1：映画S5とS6、および図2で観察された周期的なUターンを説明できます。

方程式の周期解 f を考えてみましょう。 （ t _X ）= f _X 。図4からわかるように、 t _X t として表されます _X = n T _m +0.5 Δ t _p = n T _m +0.5（ T _m − Δ t _n ） n の整数を使用 =0、±1、±2、⋯、さらに

式を代入します。 （10）式に（2）、 n があります =0その

持続時間がΔの場合、FM-DEP法がクロスオーバー周波数を決定することを明確にする t _n 微小電極を離れてからUターンするまでを正確に測定できます。

FM-DEPとAC-DEPから決定された単一のMLVのクロスオーバー周波数の比較

式（1）の実験精度を調べた。 （11）。実験的には、生体細胞を電解質に分散させる必要があることがよくあります。ただし、MLVの場合、再水和および希釈の準備プロセス中に脱イオン水の使用が許可されます。したがって、AC-DEPとFM-DEPの両方から決定されたクロスオーバー周波数を比較するために無塩MLVサスペンションを使用しました。

ターゲットMLVの誘電泳動Uターンは、10kHz≤ f の範囲のFM波によって誘導されました。 （ t ）≤50kHz（つまり、 f _c =30kHzおよびΔ f =20 kHz） f の設定で _m =0.1 Hzであり、それに対応してFM-DEPの周期は10秒です。実験では、標的MLVが微小電極を離れてから接近するまでの数Uターンを観察するのに30秒未満かかります。軌跡から、\（\ overline {\ Delta t_ {n}} =5.8 \ pm 0.2 \）sという平均離脱時間を取得しました。 WBL条件は、その f を満たす現在の実験に適用されるためです。 _m / Δ f / f _m 、 f _、 m / f （ t ）<10 ^-5 、クロスオーバー頻度は f であると評価されました _X =35±1kHz（\（\ overline {\ Delta t_ {n}} =5.8 \ pm 0.2 \）sを式に代入してから） （11）。

比較のために、AC-DEP法でプログラム可能なマニピュレーターを使用して、30〜100kHzの範囲の周波数の正弦波電界が電極を介して印加された同じターゲットMLVのクロスオーバー周波数を評価しようとしました。 AC-DEPを誘導するためのニードルペア。プログラム可能なマニピュレーターは、電極針のペアを一方向に一定の速度で運ぶため、レーザートラップ実験と同様に誘電泳動力を測定できます[39]。均一な線形運動をする電極先端にMLVを取り付けると、AC-DEP力だけでなく、一次元運動による流体力もMLVに作用します。電極速度が徐々に増加するにつれて、 F _DEP 最終的には流体力よりも小さくなります。その結果、DEPの引力により、可動電極に最初に取り付けられたMLVは、流体力によって脱着されます。臨界値の定義 v _c 、脱着前の微小電極ペアの最大速度値により、DEPと流体力の間の力のバランス方程式は[39]

ここで F _DEP （ f _AC ） e ≡< F _DEP >単位ベクトル e \（\ boldsymbol {e} =\ nabla {\ boldsymbol {A}} ^ {2} _ {\ text {RMS}} / | \ nabla {\ boldsymbol {A}} ^ {2} _ {\ textで定義{RMS}} | \）、η 25°Cおよび2 R での水の粘度 MLVの直径。

追加ファイル1：ムービーS7およびS8は、 f の適用周波数で上記のAC-DEP法を使用した力の測定を示しています。 _AC =60kHz。追加ファイル1：ムービーS7では、プログラムされたマニピュレータによって制御される電極ペアの速度は110 μです。 m / s、これは v よりも低い _c ;したがって、MLVは、誘電泳動引力により、電極ペアの一部に付着したままになります。追加ファイル1：一方、Movie S8は、120 μのより高い電極速度を示しています。 m / s。この場合、誘電泳動力はMLVに加えられる流体力よりも小さくなり、それによって電極からMLVが脱離します。したがって、 v _c 110 μと評価されます m /s≤ v _c ≤120μ m / s、 F を計算できます _DEP （60 kHz）式を使用します。 （12）。

f を決定できます _X F の実験結果から _DEP さまざまな外部周波数で。図5は、 F の周波数依存性を示しています。 _DEP 、MLVが受けるDEP力が、適用される周波数を下げることによって減少したことを示します。これは、式から求められます。 （6）と（7） F のフィッティング関数 _DEP （ f _AC ）は

F の周波数依存性 _DEP 。 FM-DEP力（ F _DEP ）外部周波数の関数として（ f _AC ）適用されたACフィールドの F _DEP 式から評価されています。 （12）、FM-DEPと単一のMLVに作用する流体力の間のバランス方程式。 F であることがわかります _DEP f として増加し、飽和します _AC 実際のCM因子の緩和スペクトルの典型的な振る舞いを反映して、より高くなっています。実線は、式（1）の最適な結果を表しています。 （13）

それを意味する

式（13）は、次の3つのパラメーターの最適な結果を使用して実験データに適合された図5の実線で示されています。 L =−21.02 pN、 H =19.03 pN、およびτ =4.9 μ s。これらの結果を式に代入します。 （14）、 f を評価します _X =34.15 kHz、これは f の結果と一致します _X =35±1kHzはFM-DEP法で評価。したがって、FM-DEP法は、AC-DEP法を使用した直接力測定との整合性の観点から検証されます。

生体細胞のクロスオーバー周波数の導電率依存性

FM-DEP法を細胞懸濁液に適用した場合のクロスオーバー周波数の実際的な信頼性を評価するために、図2で述べた生体細胞の誘電泳動Uターンに戻りましょう。最近、精巧な理論[40]により、均質球モデル（図3を参照）と、細胞の内部構造が細胞質の不鮮明化によって表されるシングルシェルモデルとの関係が以前よりも詳細に調査されました。膜に囲まれています。結果として、 f 間の関係 _X サスペンションの導電率σ _out 半径 R を使用して定式化されています 細胞の膜容量 C _m 、および細胞質伝導率σ _cyt [40]：

$$ f_ {X} =\ frac {1} {\ sqrt {2} \ pi {RC} _ {m}} \ left（\ sigma _ {\ text {out}}-\ frac {1} {2 \ sigma_ {\ text {cyt}}} \ sigma _ {\ text {out}} ^ {2} \ right）+ f_ {X0}、$$（15）

ここで f _{X 0} は、σでのクロスオーバー周波数に外挿された値です。 =0 mS / mであり、ここではフィッティングパラメータとして扱われます。手の込んだ処理により、式の右辺の2番目の項である2乗項が追加されます。 （15）、主に C の評価に使用されてきた従来の線形関係 _m f から _X [40–45]。理論的には、式（40）はまだ主張されています[40]。 （15）はσのより低い範囲内で有効です _out σのように _out <10 mS / m;ただし、 C の評価には2乗項を含める方がよいでしょう。 _m 、σの範囲を考慮すると _out 10mS /m≤σの範囲で以前の結果と比較して比較的高い _out ≤100mS/ m [40–45]。したがって、σを決定しました _cyt C _m 式のフィッティングから（15） f の実験結果 _X σの増加関数として _out 。

使用される生体細胞には、ヒト白血病のTL細胞とBL細胞、および3人のボランティアのRB細胞の3種類があります。あらゆる種類のセルを使用したすべての実験で、導電率は60〜160 mS / mの範囲内であり、変調周波数は0.25Hzに設定されました。瞬時周波数に関しては、ほとんどの実験で100〜1.5 MHzの範囲が採用されました（つまり、 f _c =800kHzおよびΔ f =700 kHz）;白血病細胞の場合を除いて、周波数範囲は50kHz≤ f に拡張されました。 （ t ）≤1550kHz（つまり、 f _c =800kHzおよびΔ f X =750 kHz）60mS /m≤σの導電率範囲 f であるため、≤80mS/ cm _X このσで -範囲が100kHz未満であることが判明し、100kHz≤ f の範囲でDEPUターンを観測できませんでした。 （ t ）≤1500kHz。これらの周波数セットは両方とも、ΔのWBL条件を満たす。 f / f _m 、 f （ t ）/ f _m <10 ^-5 以前と同じように。

懸濁液に分散した細胞の放置時間を測定するたびに、同じサイズのいくつかの細胞が同時に基板上のFM-DEPを経験できる適切なスポットを探し、微小電極の先端を測定可能な位置に配置しました。マイクロマニピュレーターを使用します。いくつかの適切な位置で合計10個の細胞のFM-DEP軌跡が収集されるまで、細胞懸濁液内でこのようなスキャンを続けました。細胞の種類ごとに、同じ細胞懸濁液の異なる液滴を使用して、10個の細胞の測定を2回繰り返しました。前述のように、電気的に誘発される溶媒の流れを可能な限り抑制するために、各スポットでFM-DEP測定を実施することが不可欠です。したがって、電界を印加する持続時間が10秒未満になるように調整できるように、Uターンパスの2サイクルのみをトレースしました。これに対応して、各セルの離脱時間は、それぞれの平均として示されます。 2つのUターンを含む軌道。したがって、各細胞懸濁液の平均離脱時間\（\ overline {\ Delta t_ {n}} \）は、20個の細胞の離脱時間を平均することから得られます。特にヒトRB細胞については、同じ種の細胞が C で類似していると仮定して、3人のヒトの3つのRB細胞懸濁液で得られた平均クロスオーバー頻度の3セットをさらに平均しました。 _m およびσ _cyt R と同様に 。 Δの2段階平均 t _n \（\ left <\ overline {\ Delta t_ {n}} \ right> \）で示されます。式に代入します。 （10）\（\ overline {\ Delta t_ {n}} \）または\（\ left <\ overline {\ Delta t_ {n}} \ right> \）のいずれかの実験データ、平均クロスオーバー頻度< f _X >が取得されました。

図6は、σを示しています。 _out -< f の依存関係 _X > FM-DEP法を使用して上記の3種類の生体細胞について測定。図6の実線は、式（1）の最適な結果を示しています。 （15）。 C を評価しました _m およびσ _cyt 式の最良のフィッティングから。 （15）観測された半径（ R _obs ）が挿入されました。表1に、 C のフィッティング結果を示します。 _m およびσ _cyt 、ここでは、観測された半径10 μを使用しました。 m ≤2 R _obs ≤15μ TLおよびBLセルの場合はm、7.5 μ m ≤2 R _obs ≤10μ C の評価におけるRBセルのm _m 。表1から、種が異なれば膜容量も異なり、文献[40–47]で報告されているものとよく一致していることに注意してください。 C _m 正常な（健康な）ドナーからの静止全血サンプルを含むRB細胞の値は、私たちの値[46、47]と非常によく一致していますが、[47]に記載されているように等張緩衝生理食塩水で洗浄したRB細胞の値よりも大幅に高くなっています。最適な結果は同時に細胞質の導電率を提供しました。これは表1からわかるように一貫して類似していますが、0.2 S /m≤σという以前の報告の範囲よりもわずかに低かったです。 _cyt ≤1S/ m [40、45、48–51]。これらの結果は、FM-DEP法が生細胞の治療に必要な実用的な信頼性を維持していることを裏付けています。

クロスオーバー周波数の導電率依存性。平均クロスオーバー頻度、< f _X >、TLセル（青い三角形）、BLセル（緑のひし形）、およびRBセル（赤い円）のうち、溶液の導電率の増加に伴って変化しますσ _out 。式の最適な結果。 （15）は実線で示されています

<図>

結論

FM-DEPの理論的取り扱いは、主にWBL状態に焦点を合わせています。この限界では、FM波の瞬間周波数がクロスオーバー周波数を横切るたびにFM-DEP力の方向が切り替わることを理論的に証明しました。これは、FM-DEPを受けるマイクロ/ナノ粒子の周期的なUターンを意味します。 。 2種類の実験により、 f の精度と信頼性が実証されました。 _X FM-DEPの定式化を使用してMLVと細胞の観測された軌道から得られます（式（9）および（11））： f _X 単一のMLVのFM-DEPから評価されたものは、AC-DEPを経験している同じMLVの力測定から得られたものと一致し、 f の導電率依存性 _X 文献値と密接に一致するさまざまなセルの膜容量を提供します。言い換えると、WBL限界のFM-DEPは、の周期関数に従って周波数が連続的に変化するAC波によって誘導される時変AC-DEPによって模倣できることが理論的および実験的に検証されています。 f （ t ）。単純なビューは、twDEPや、位相と大きさの空間依存性を持つFM波を適用することによる電気回転を含む、他の動電学に適用されます。 AC-およびFM-DEPは、誘電スペクトル（またはCMファクター）の実数部に関連付けられていますが、相の空間勾配による動電学は、前述のようにCMファクターの虚数部を反映しています。したがって、動電学を使用して誘電特性評価（一般に誘電分光法）を完了するには、twDEPまたは動電回転のいずれかにFM波を適用する必要があります。

粒子の軌跡を正確に追跡するために、MLVや細胞などの微粒子を処理しました。これらの実験では、浮遊粒子だけでなく沈降粒子も観察されています。凝集しやすい沈降粒子のDEPを誘導するために電界の大きさを大きくする必要があります。そのため、基板上に浮かぶターゲット粒子にFM波を印加するためのプラグインシステムを使用しました。

分散カーボンナノチューブのように、サブミクロンからナノスケールのサイズの小さな粒子のためのFM-DEP法をさらに開発することは、以下に説明するようにFM-DEPを使用したリアルタイム分光法の可能性を開くことで有望です。電極構成が印加電界の一定の勾配を作成するように設計されているオンチップシステムを使用して、より小さなコロイドにFM波を印加すると、時変速度ベクトル v （ t ）FM-DEP力の時間依存性によって引き起こされるFM-DEPのは、χの変動に起因します。 （ f ）（またはCM係数の実数部）：式から求められます。 （9）と（12）その

したがって、速度ベクトルを測定する v （ t ）サブミクロンからナノ粒子への変換は、CM因子の実数部の周波数依存性を直接提供する可能性があります。これは、動電学的FM分光法に他なりません。

略語

AC：

交流

BL：

B細胞白血病

CM：

クラウジウス・モッソッティ

DEP：

誘電泳動

DOPC：

1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン

FM：

周波数変調

MLV：

マルチラメラベシクル

RB：

赤い血

RMS：

二乗平均平方根

TL：

T細胞白血病

twDEP：

進行波誘電泳動

WBL：

広帯域制限