タンパク質の親和性分離のための機能化ナノ吸着剤

要約

チオール官能化シリカナノスフェア（SiO ₂ -平均直径460nmのSHNS）は、熱水ルートで合成されました。続いて、準備されたSiO ₂ -SHNSはSnO ₂によって変更されました SnO ₂を提供する量子ドット / SiO ₂ 明らかな蛍光を有する複合NS。これは、標的タンパク質を追跡するために使用できます。 SnO ₂ / SiO ₂ NSは、還元型グルタチオン（GSH）によってさらに修飾され、SnO ₂が得られました。 / SiO ₂ -GSH NS、グルタチオン S を特異的に分離できます -トランスフェラーゼタグ付き（GSTタグ付き）タンパク質。さらに、SnO ₂から分離されたグルタチオンペルオキシダーゼ3（GPX3）のペルオキシダーゼ活性 / SiO ₂ -invitroでのGSHNSを評価した。結果は、準備されたSnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、ごくわずかな非特異的吸着、高濃度のタンパク質結合（7.4 mg / g）、および良好な再利用特性を示します。その間、これらのNSによって分離されたGSTタグ付きGPX3は、その酸化還元状態とペルオキシダーゼ活性を保持できます。したがって、準備されたSnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、GSTタグ付きタンパク質の迅速な分離と精製に有望なアプリケーションを見つける可能性があります。

背景

タンパク質の容易な分離と精製は、生体異物の生体内変化、薬物代謝、プロスタグランジンとステロイドホルモンの生合成、および芳香族アミノ酸の分解において非常に重要です[1,2,3,4,5,6]。分離されたタンパク質は、抗原とワクチンの生産、分子免疫学と構造、生化学的および細胞生物学的研究に使用できます。グルタチオン S -トランスフェラーゼ（GST）は、解毒アイソザイムの主要なグループであり、GST遺伝子融合システムおよび薬効標的分野で、または腫瘍マーカーとして使用できます[7、8]。沈殿、クロマトグラフィー、限外濾過、透析などのさまざまな方法が現在さまざまなタンパク質の精製に利用可能であり、特に、生体高分子と相補的リガンド間の自然な生物学的親和性に基づく親和性分離は非常に重要です[9、10、11、12 、13、14]。しかし、全長、可溶性、および天然の融合タンパク質の生産と精製の成功は、細胞破片やコロイド汚染物質を除去するための前処理の必要性、比較的長い操作時間、タンパク質の溶解性などのさまざまな障害によって依然として遅れています。幸いなことに、これらの欠点は、ナノマテリアルを適用して標的タンパク質の分離と精製を支援することで克服できます[15、16、17、18、19]。たとえば、磁性SiO ₂ -NiOナノコンポジットはHisタグ付きタンパク質を分離することができます[20]。それにもかかわらず、ナノマテリアルは、生物兵器と戦うための高感度の生体分子および医療診断ツールとして使用できる視覚化および蛍光技術に対して不活性であることが多いため、さまざまなタンパク質の分離にまだ短い足があります[21、22、23]。この意味で、グルタチオンペルオキシダーゼ3（GPX3）のような組換えタンパク質の分離と精製への応用を促進するために、蛍光応答を示すナノ材料を見つけることが不可欠です。

ナノスケールのSnO ₂に特に注意を払っています量子ドット（QD）、なぜなら、優れた化学的安定性と生体適合性を備えたn型ワイドバンドギャップ（3.6 eV）半導体として、SnO ₂ 可視スペクトル領域で吸光度を示します。ここでは、蛍光SnO ₂を導入するためのスマートな経路を確立します目的のSnO ₂を開発することを期待して、シリカナノスフェア（NS）の表面にQDを配置します。 / SiO ₂ GSTタグ付きタンパク質の分離と精製に応用できる可能性のあるナノ構造。まず、チオール官能化シリカナノスフェア（SiO ₂ -SH NS）は、熱水ルートを介して準備されました。結果として生じるSiO ₂ -SHNSはSnO ₂と複合化されました SiO ₂を提供する量子ドット / SnO ₂ 明らかな蛍光吸収を有する複合NS。 SiO ₂ / SnO ₂ NSは還元型グルタチオン（GSH）によってさらに修飾され、SiO ₂が得られました。 / SnO ₂ -GSTタグ付きタンパク質のアフィニティー分離の可能性があるGSHNS。調製したSnO ₂の能力とペルオキシダーゼ活性 / SiO ₂ -GSTタグ付きタンパク質の分離におけるGSHNSは、SDS-PAGE分析によって評価されました。

実験的

材料と方法

ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）、塩化スズ（IV）（SnCl ₄ ）、トリエチルアミン（TEA）、およびイソプロパノールは、Tianjin Kermel Chemicals Reagent Company（Tianjin、China）から提供されました。 AgNO ₃ Tianjin Fuchen Technology Development Co.、Ltd。（Tianjin、China）から購入しました。 3-メルカプトプロピル-トリメトキシシラン（MPS）は、Alfa-Aesar（上海、中国）から提供されました。オルトケイ酸テトラエチル（TEOS）は、Tianjin Fuchen Chemicals（Tianjin、China）から供給されました。ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（NADPH）、チオレドキシン、およびチオレドキシンレダクターゼはSigma（北京、中国）から入手しました。グルタチオンセファロース4B（ストックホルム、米国）はGEHealthcareから入手しました。ジチオスレイトール（DTT）は、Aladdin Industrial Corporation（Inalco SPA、イタリア）から入手できました。すべての化学試薬は分析試薬であり、さらに精製することなく使用されました。

SnO ₂の準備量子ドット

典型的な合成[24]では、3.5 g SnCl ₄ ・5H ₂ Oを50mLのH ₂に追加しました O、次に5mLのアンモニアを攪拌しながら溶液に加えました。続いて、遠心分離によって得られた沈殿物を脱イオン水で数回洗浄して、過剰なCl ^- を除去した。イオン。得られた沈殿物に30ミリリットルの脱イオン水を加え、溶液のpHを2 mol / Lアンモニアで12に調整しました。混合溶液をテフロンで裏打ちされたステンレス鋼のオートクレーブに移し、密封して150°Cで24時間加熱しました。加熱が完了したら、混合溶液を冷却し、遠心分離し、エタノール-イソプロパノール（体積比1：1）で完全に洗浄して、SnO ₂を得た。 QD。

SnO ₂の準備 / SiO ₂ -SH NS

一般的な合成では、0.2 g SnO ₂ QDと0.09gのCTABをH ₂の混合溶媒に溶解しました。マグネチックスターラー（200 G、 r ）下でのO（42.5 mL）および無水アルコール（7 mL） =180 mm）。得られた溶液に、さらに20分間撹拌しながら2.7 mLTEAを加えました。混合溶液を60°Cで5時間加熱し、3.5mLのTEOSと0.35mLのMPSをゆっくりと滴下した後、遠心分離（12,800 G、 r ）しました。 =180 mm）、HCl-エタノール（30 mL）と水（30 mL）で完全に洗浄して、SnO ₂ / SiO ₂ -SH NSを3回、水に分散させました（0.12 g / mL）。

SnO ₂の表面修正 / SiO ₂ -SH NS

4ミリリットルの0.12g / mL SnO ₂ / SiO ₂ -SH NSをPBS（0.01 mol / L、pH =7.4）で3回洗浄しました。これらのSnO ₂ / SiO ₂ -SHNSを30mL 16.7 mg / mL GSH溶液に加え、恒温発振器を使用して37°Cで24時間（120回転/分）振動させました。振動の終わりに、混合溶液を遠心分離して、SnO ₂を提供した。 / SiO ₂ -GSH NS;次に、沈殿物を30 mL PBS（0.01 mol / L、pH =7.4）で3回完全に洗浄し、物理吸着によって過剰なGSHを除去し、目的のSnO ₂を得ました。 / SiO ₂ -GSHNS。結果として得られるSnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSをアルコールに添加しました（25％、 v / v ）、4°Cで保管します。

GSTタグ付きタンパク質の分離

混合タンパク質は、 Escherichia coli の細胞溶解物から収集されました。、これは水溶解によるものです（濃度0.01 mol / L、pH 7.4）。 in vitroタンパク質発現の場合、グルタチオンペルオキシダーゼ3（GPX3、アミノ酸37〜206）、開放気孔1（OST1）、およびABA非感受性2（ABI2、アミノ酸100〜423）のコード配列を含むタンパク質領域>シロイヌナズナをクローン化し、プラスミドpGEX-6p1にインフレームで挿入しました（GPX3をコントロールとして使用しました）。 pGEX-GPX3、pGEX-OST1、およびpGEX-ABI2コンストラクトが Eに導入されました。コリ BL21（DE3）セル。組換えGSTタグ付きタンパク質は、グルタチオンセファロース4BおよびSnO ₂を使用して精製しました。 / SiO ₂ -GSHNS。遺伝子のクローニングに使用したプライマーは次のとおりです。GPX3の場合、フォワードプライマー、5'- GATGGATCCTCGCCATCGACGGTGGAACAA-3 '。リバースプライマー、5'- CACCTCGAGTCAAGCAGATGCCAATAGCTT-3 '; OST1の場合、フォワードプライマー、5'- GCCGAATTCATGGATCGACCAGCAGTGA-3 ';リバースプライマー、5'- CCCGTCGACTCACATTGCGTACACAATC-3 '; ABI2の場合、フォワードプライマー、5'- GCGGAATTCGAGAGTAGAAGTCTGTTTG-3 ';リバースプライマー、5'-GCGCTCGAGTCAATTCAAGGATTTGCTC-3 '。

PBS溶液（0.01 mol / L、pH =7.4）で洗浄した後、調製したSnO ₂ / SiO ₂ -GSHNSは1000μLの Eに直接導入されました。コリ 溶解し、4°Cで2時間振とうし（回転速度：90回転/分）、SnO ₂ / SiO ₂ -GSTタグ付きタンパク質を捕捉するためのGSHNS。振とうが完了したら、これらのNSを遠心分離によって溶液から分離し、PBS溶液で完全に洗浄して、捕捉されていない残留タンパク質をすべて除去しました。 GSTタグ付きタンパク質結合SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSを300μLおよび0.5mol / LのGSH溶液で3回洗浄し、GSTタグ付きタンパク質を表面から分離しました。別々に収集されたタンパク質溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって検出されました。分離されたタンパク質の濃度は、BCAタンパク質アッセイキットによって決定されました。 SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、同じ方法でターゲットタンパク質を数回分離するために再利用できます。

グルタチオンペルオキシダーゼ活性の測定

分離されたGPX3活性は、Delaunay et al。によって説明されているように、340nmでのNADPH消費量の分光測定によって測定されました。 [25]。 GSTタグはGSTタグ付きGPX3からPreScissionプロテアーゼによって切断され、GPX3を活性分析に使用しました。まず、98μLの反応緩衝液（100 mmol / L Tris-Cl、0.3 mmol / L NADPH、1.34μmol/ Lチオレドキシン、および E. coli からの0.18μmol/ Lチオレドキシンレダクターゼを含む溶解物）をチューブに加えた。完全に混合した後、1.35μmolの精製GPX3を得られた反応緩衝液に加えました。次に、混合溶液を2μLのH ₂に加えました。 O ₂ （5 mmol / L）反応を開始し、340nmでのNADPH消費量を分光測定によって収集しました。

精製されたGPX3の酸化還元状態の分析

GSTタグはPreScissionプロテアーゼによってGSTタグ付きGPX3から切り離されました。分離されたGPX3は5mmol / L H ₂で処理されました O ₂ 精製されたGPX3の酸化還元状態を変更するために1mmol / LDTTを10分間。得られたGPX3は、酸化還元状態のinvitro分析に使用されました。抽出物は非還元15％SDS-PAGEゲルで評価しました。

特性評価

調製したSnO ₂の形態と組成 / SiO ₂ -GSH NSは、透過型電子顕微鏡（TEM、JEM-2010、日本）、走査型電子顕微鏡（SEM、JSM 5600LV、日本）、X線回折（XRD、X'Pert Philips、オランダ）、および蛍光分光計（オランダ）によって分析されました。 FL、FluoroSENS、英国、励起波長260 nm）。分離されたGSTタグ付きタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE、Power PAC 300、中国）で、予備濃縮電圧70 V、分離電圧120Vで検出されました。定温発振器はShanghaiChemStarInstruments製です。、株式会社（ATS-03M2R、中国）。分離されたタンパク質の濃度は、BCAタンパク質アッセイキット（北京CoWin Biotech、中国）によって決定されました。

結果と考察

SnOのTEM、SEM、XRD、および蛍光分析₂ QDとSnO ₂ / SiO ₂ -GSH NS

図1は、合成されたSnO ₂の高分解能TEM（HRTEM）画像とXRDパターンを示しています。 QD。合成されたSnO ₂ QDは球形で、平均直径が5 nmで、粒度分布が狭く（図1a）、（110）面の格子間隔は0.29 nmです（図1b）。よく解像された格子画像は、準備されたSnO ₂ QDは高度に秩序化された結晶構造を持っています。 SnO ₂の対応する選択領域電子回折パターン QD（図1c）は、単一の錫石相にインデックスを付けることができます。これは、関連するXRDパターン（図1d）と一致しています。つまり、2シータ=26.6°（110）、33.9°（101）、38.0°（200）、51.8°（211）、65.9°（301）、および78.7°（321）の特徴的なピークは標準と一致しています。錫石SnO ₂のXRDデータ（JCPDSカード番号41-1445）。その上、強いXRDピークは、準備されたSnO ₂ QDは十分に結晶化されており、他の特徴的なピークがないことは、QDにヘマタイトまたは水酸化物の不純物が含まれていないことを示しています。

図2は、SnO ₂のSEMおよびTEM画像を示しています。 / SiO ₂ -GSHNS。準備されたSnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは球形で、平均直径は約430 nmで、表面はやや粗いようです（図2a、b）。その間、SnO ₂ QD（約5〜15 nm）は、SiO ₂の表面で修飾されていますミクロスフェア（図2c、d）。これは対応するSEM画像と一致しています。 SnO ₂ シリカNSが凝集しています。

図3aは、合成されたSnO ₂のXRDパターンを示しています。 / SiO ₂ -GSHNS。 2シータ=110°、101°、200°、211°、301°、および321°の主なピークは、SnO ₂のピークと一致しています。（図1d）。その上、SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、23°付近にアモルファスシリカの強い特徴的なピークを示します（JCPDSカード番号76-0933）。これは、SnO ₂ 可視光応答性を備えたものが、SiO ₂の表面にうまく導入されました。 NS。図3bは、SnO ₂の蛍光スペクトルを示しています。 / SiO ₂ -368nmのGSHNS。 SnO ₂ / SiO ₂ -GSHは、SnO ₂の酸素空孔に起因する強い蛍光発光を示します。。図3cは、SnO ₂の蛍光イメージングを示しています。 / SiO ₂ - EでGSTタグ付きGPX3を分離するためにこれらのNSが使用される場合のGSHNS。コイル 溶解物。調製したSnO ₂には、明らかな緑色の蛍光が見られます。 / SiO ₂ -GSHNSが使用されます。 SnO ₂ SiO ₂の表面で変更されましたおよびSnO ₂ / SiO ₂ -GSHNSは優れた蛍光特性を持っています。

SDS-PAGE分析

準備されたSnO ₂の能力を推定するには / SiO ₂ -GSTタグ付きタンパク質の分離におけるGSHNSについて、SDS-PAGE分析を実施しました。図4は、SnO ₂で区切られたGSTタグ付きGPX3のSDS-PAGE分析結果を示しています。 / SiO ₂ -GSHNS。 SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、 Eからの標的タンパク質を効率的に濃縮できます。コリ ライセート、特に解離したタンパク質の量は、GSHの濃度が10〜100 mmol / Lの範囲で増加するにつれて増加する傾向があります（図4aのレーン3〜6）。調製したSnO ₂によって標的タンパク質を特異的に分離できることは明らかです。 / SiO ₂ - EからのGSHNS。コリ 溶解物であり、非特異的なものはほとんどありませんでした。

準備されたSnO ₂の再利用された特性を調査するため / SiO ₂ -GSH NSは、GSTタグ付きGPX3を分離するために繰り返し使用しました。図4bに示すように（レーン1はマーカーを指し、レーン2はGST-GPX3を含む E.coli を指します。溶解物、レーン3は1回目の分離、レーン4は2回目の分離、レーン5は3回目の分離、レーン6はグルタチオンセファロース4B）から洗い流された画分、合成されたSnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、 Eから抽出されたGSTタグ付きGPX3に対して特別な選択性を示します。コリ ライセート、およびそれらの特異性と親和性は、3サイクルの繰り返し分離後も影響を受けません。

合成されたSnO ₂の普遍性をテストするには / SiO ₂ -GSTタグ付きタンパク質を精製するためのGSHNSとして、3種類のGSTタグ付きタンパク質（GSTタグ付きGPX3、GSTタグ付きOST1、GSTタグ付きABI2）を選択して実験を行いました。図5に示すように、GSTタグ付きGPX3、OST1、およびABI2タンパク質は、SnO ₂によって特異的に分離できます。 / SiO ₂ - EからのGSHNS。コリ 溶解物（レーン3、6、9）;次に、両方のGPX3を取得できます（SnO ₂からGSTタグを切り取ります） / SiO ₂ -GSTタグ付きGPX3）に結合するGSH NSと、SnO ₂から溶出されたGSTタグ / SiO ₂ -GSH NS（レーン13、GPX3;レーン14、GSTタグ）。これは、グルタチオンセファロース4B（レーン2、5、8、11、12）と同様の効果があります。 SnO ₂による精製タンパク質の濃度 / SiO ₂ -GSHNSは7.4mg / g（GSTタグ付きGPX3）、7.1 mg / g（GSTタグ付きOST1）、および6.8 mg / g（GSTタグ付きABI2）であり、SnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、 EからGSTタグ付きタンパク質を精製するのに適しています。コリ 溶解物。調製したSnO ₂間の結合能力を比較するため / SiO ₂ -GSH NSおよびその他の材料であるグルタチオンセファロース4B（米国ストックホルムで購入）を比較実験材料として使用しました。グルタチオンセファロース4Bによって精製された総タンパク質は、それぞれ7.1 mg / mL（GSTタグ付きGPX3）、6.9 mg / mL（GSTタグ付きOST1）、および5.6 mg / mL（GSTタグ付きABI2）でした。調製したSnO ₂の結合能がわかる / SiO ₂ -GSH NSは、コモディティ4Bよりも高くなっています。

GSTタグ付きGPX3の酸化還元状態とペルオキシダーゼ活性の分析

準備されたSnO ₂によって分離されたGSTタグ付きGPX3の酸化還元状態と活性を分析するため / SiO ₂ -GSH NS、GSTタグを切り取って、分離されたGPX3を取得します。図6aは、GPX3レドックス状態のin vitroアッセイを示しています（3つの独立した実験からの代表的なゲルに対応）。レーン1および2は、GSTタグがグルタチオンセファロース4Bに結合したGSTタグ付きGPX3から切断された後に得られたGPX3を示します（レーン1は酸化GPX3、レーン2は還元GPX3です）。レーン3と4は、GSTタグがSnO ₂から切り離された後に取得されたGPX3を示しています。 / SiO ₂ -GSH結合GSTタグ付きGPX3（レーン3は酸化型GPX3、レーン4は還元型GPX3）。レーン5はマーカーを示しています。図6aに示すように、精製されたGPX3は、グルタチオンセファロース4B（レーン1および2）およびSnO ₂から分離されました。 / SiO ₂ -GSH NS（レーン3および4）は酸化状態と還元状態を持ち、還元GPX3は酸化された対応物よりもゆっくりと移動します。これは、GPX3がin vitroで酸化状態と還元状態で存在し、還元型Cys残基の修飾の結果としてその還元型と酸化型を分離できるという以前の発見とよく一致しています[26、27、28]。

図6bは、GPX3のペルオキシダーゼ活性のアッセイを示しています。ラインGPX3 *、グルタチオンセファロース4B、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、NADPH、およびH ₂の存在下での精製GPX3の完全なアッセイ O ₂;ラインGPX3、SnO ₂間の完全な反応 / SiO ₂ -GSH NSは、GPX3、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、NADPH、およびH ₂を分離しました O ₂;ラインGPX3なし、GPX3がない場合の完全な反応。とラインNoTrx、チオレドキシンの非存在下で完全な反応。図6bは、グルタチオンセファロース4BおよびSnO ₂から分離された精製GPX3のグルタチオンペルオキシダーゼ活性を示しています。 / SiO ₂ -invitroでのGSHNS。チオレドキシンを基質として、精製されたGPX3は有意なペルオキシダーゼ活性を示すことがわかります。これは、GPX3がSnO ₂から分離したことを示しています。 / SiO ₂ -GSHNSは自然の状態で存在します。

結論

シリカで保護されたSnO ₂を製造するための簡単な方法が確立されています QDナノスフェア（SnO ₂ / SiO ₂ NS）。 SnO ₂ / SiO ₂ NSはグルタチオンによってさらに修飾され、SnO ₂を生成します。 / SiO ₂ -グルタチオン S のアフィニティー分離用のGSHNS -トランスフェラーゼタグ付き（GSTタグ付き）組換えタンパク質。調査結果は、GSTタグ付きGPX3、GSTタグ付きLOV、およびGSTタグ付きABI2を分離する能力に関して、準備されたSiO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、特異的な分離、高濃度のタンパク質結合、および良好な再利用特性を示します。さらに、GSTタグ付きGPX3から分離されたGPX3は、in vitroでの酸化還元状態とGPX活性も保持します。つまり、調製されたSnO ₂ / SiO ₂ -GSH NSは、GSTタグ付きタンパク質の迅速な分離と精製に有望な可能性を秘めている可能性があります。