コンドロイチン硫酸強化ゼラチン/ポリカプロラクトンナノファイバー: 血管組織工学向け抗血栓性と優れた内皮親和性を持つ足場

概要

電気紡糸ポリマーナノファイバーは、血管組織工学で大きな注目を集めています。しかし、内皮化の遅さと血栓形成という従来ナノファイバー材料の欠点により、血管組織修復と再生の促進に効果的ではありません。本研究では、異なる量のコンドロイチン硫酸（CS）を組み込んだバイオミメティックゼラチン（Gt）/ポリカプロラクトン（PCL）複合ナノファイバーを電気紡糸技術で開発し、抗血栓性と内皮細胞親和性への影響を調査しました。PGナノファイバー中のCS濃度変化は繊維形態と直径に影響を与えます。CS/Gt/PCLナノファイバーは適切な多孔性（~80%）とPBS溶液吸収率（最大650%）を持ちます。Gt/PCLナノファイバーへのCS導入は抗凝固特性を大幅に向上させ、凝固時間を延長し、細胞応答を促進します。特に、10%CS/Gt/PCLナノファイバーは好ましい細胞付着、伸長、増殖を示します。したがって、一定量のCSを含むGt/PCLナノファイバーは、血管修復と再生における有望な組織工学足場として優れた候補となり得ます。

はじめに

ナノファイバー材料の開発は、細胞外マトリックス（ECM）様の超微細繊維構造、優れた機械的特性、大きな比表面積、相互接続性を持つ高多孔性といった独自の（生理）物理化学的特徴により、組織修復と再生におけるバイオミメティック足場として大きな注目を集めています。ナノファイバー構造が、接触ガイダンスを介して細胞接着、形態（伸展、配向、伸長など）、配列、遊走、増殖、表現型、分化などの細胞応答を媒介する鍵となる役割を果たすことが実証されています。ナノスキビング、テンプレート合成、相分離などの多数のナノ製造戦略がナノファイバー材料製造の利用可能な技術を提供してきましたが、電気紡糸は金属、セラミック、ポリマー、複合材料など様々な材料から工業規模でナノファイバーを製造する最も効果的な方法の一つです。

（生理）物理的シグナルに加え、適切な生体材料の選択も細胞活性と組織修復・再生に大きく影響します。生体適合性、生体吸収性、機械的特性、生物学的機能などの主要特徴を考慮すべきです。天然/天然および合成/合成複合材と比較して、天然ポリマーと合成ポリマーで構成される複合ナノファイバー材料は、天然ポリマーの優れた生物学的特徴と合成ポリマーの機械的強度を組み合わせるため、より注目されています。それらの中で、ゼラチン（Gt）/ポリカプロラクトン（PCL）の組み合わせは、最も代表的に研究されている天然-合成ハイブリッドシステムの一つで、血管組織工学で広く使用されています。しかし、Gt/PCL複合ナノファイバーには、内皮化の遅さと血栓形成という限界があります。最近、コンドロイチン硫酸（CS）は、グリコサミノグリカンとガラクトサミンを含む硫酸化多糖類であり、内皮細胞（EC）への高い接着性、タンパク質と血小板への弱い相互作用、負に帯電した血液成分の静電気的反発性を持つことが実証されています。さらに、CSは細胞アポトーシスを抑制し、血管創傷の治癒を促進する可能性があります。したがって、CSを組み込んだGt/PCL（PG）電気紡糸ナノファイバーは、血管修復と再生のためのバイオインストラクティブな組織工学足場として優れた候補となり得ます。

本研究では、ワンステップ電気紡糸により、異なるCS比率を含むバイオミメティックPG複合ナノファイバーを開発しました。CS/PG複合ナノファイバーの形態、化学的特徴、多孔性、分解を様々な特性評価技術で検出しました。PG/CS複合ナノファイバーの抗凝固性を評価しました。さらに、これらの異なるCS比率の複合ナノファイバーにヒト大動脈内皮細胞（HAEC）を播種し、細胞応答への影響を調査しました。

材料と方法

材料

CS（ウシ気管、タイプA、純度95%）を上海マックリン生化学技術有限公司（中国）から購入。PCLをアラジン生化学ポリトロンテクノロジーズ（中国）から入手。Gt（ウシ皮膚、タイプB）をシグマアルドリッチ生化学技術有限公司（中国）から入手。活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）キットを雷根生物技術有限公司（中国）から購入。酢酸（純度99.5%）をシノファーム化学試薬有限公司（中国）から購入。ヒト大動脈内皮細胞（HAEC）を青島大学附属病院（中国）から入手。培地Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12（DMEM/F-12）、胎児牛血清（FBS）、0.25%トリプシン-EDTAをバイオロジカルインダストリーズ（イスラエル）から購入。その他の試薬は特に記載がない限りシグマアルドリッチ（中国）から購入。全実験で脱イオン水を使用しました。

ナノファイバーの電気紡糸

PCL（10% w/v）を室温で4時間機械攪拌しながら酢酸に溶解しました。Gt（10% w/v）を90%酢酸に定常攪拌で2時間溶解しました。異なる濃度のCSをGt溶液に添加し、室温で1時間穏やかに攪拌して、総ポリマー濃度に対する5、10、15 wt.%のCSを含む均質溶液を得ました。次に、上記2溶液を重量比50/50（w/w）で2時間攪拌混合し、PG溶液を調製しました。これらを5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PGと命名しました。

調製した均質溶液を、21G針付き1 mLシリンジとアルミ箔で覆ったコレクターを備えた電気紡糸プロセスにかけました。本研究では、コレクタープレートと針先の距離を約18 cmに固定し、電圧を23 kVに設定し、ポリマー溶液を1 mL/hの速度で押出しました。すべての溶液を、室温で湿度を40%未満に慎重に制御した電気紡糸装置（Technology、Tk602TH、中国）で電気紡糸しました。更なる実験の前に、サンプルを真空乾燥炉で72時間以上乾燥し、残留溶媒を除去しました。

走査型電子顕微鏡（SEM）と透過型電子顕微鏡（TEM）

CS@PGナノファイバー足場の形態を、室温で加速電圧20 kVのSEM（VEGAS、TESCAN、チェコ）で調査しました。ナノファイバー直径（n=100）をSEM画像から画像解析ソフトウェア（Image J）でさらに測定しました。

TEM観察とエネルギー分散型X線分光法（EDS）分析をJEOL JEM-2100 plus（日本）で実施しました。

フーリエ変換赤外分光法（FTIR）

FTIRをニコレットiN10 FTIR分光計（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で実施し、CS、PGナノファイバー、CS@PGナノファイバーの特徴的官能基を評価しました。サンプルスペクトルを透過モードで、波長範囲4000-500 cm⁻¹、分解能2 cm⁻¹で記録しました。

多孔性とリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液吸収

ナノファイバーの多孔性を液体置換法で実施しました。まず、ナノファイバーの乾燥重量をW₁として測定しました。次に、4群のナノファイバーを25℃で2時間エタノールに浸漬し、W₂として測定しました。サンプル表面のエタノールをろ紙で除去し、重量をW₃としました。ナノファイバーの多孔性を以下の式で計算しました：

多孔性（%）= (W₃ - W₁) / (W₃ - W₂) × 100

PBS溶液吸収試験では、得られたナノファイバーを乾燥状態で秤量しWdとして記録しました。次に、ナノファイバーを25℃で24時間PBSに浸漬し、サンプル表面の余分な液体を除去後、湿潤状態での重量をWwとして記録しました。膨潤比を以下の式で測定しました：

PBS吸収（%）= (Ww - Wd) / Wd × 100

上記実験のすべての値を平均±SD（n=3）で表現しました。

in vitro分解性

得られたナノファイバーのリゾチーム耐性を決定するため、予定時期（1、4、7、10、14日）でサンプルの分解性を測定しました。ナノファイバーの初期重量をWᵢとして記録しました。次に、サンプルをリゾチーム（500 µg/mL）含有PBS溶液（pH 7.4）に浸漬し、37℃でin vitroインキュベートしました。予定分解時点ごとに各群サンプルを取り出し、脱イオン水で洗浄、凍結乾燥して最終重量（W_f）を取得しました。リゾチーム溶液を週3回交換しました。ナノファイバー足場の残存質量（%）を以下の式で推定しました：

残存質量（%）= (1 - (Wᵢ - W_f) / Wᵢ) × 100%

7日後のサンプル分解挙動を評価するため、SEMでナノファイバー形態を観察しました。

血液適合性評価

凝固時間

活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）を用いて、電気紡糸ナノファイバーをカバーガラス上にインキュベートした後の血小板貧乏血漿（PPP）の凝固時間を測定し、内因性および共通凝固経路の活性を評価しました。抗凝固血液（約10 mL）を採取し、3000 rpmで20分遠心分離してPPPを取得しました。各サンプルを200 µL PPPと37℃で10分インキュベートし、APTTキットを用いて製造元の指示に従って分析しました（n=3）。

溶血試験

溶血率を、電気紡糸ナノファイバーに曝露された希釈全血中の赤血球から溶液相に放出されるヘモグロビン濃度測定で評価しました。カバーガラス上のサンプルを個別に24ウェルプレートに入れ、37℃で2 mL PBSに30分浸漬しました。ネガティブコントロール群は2 mL PBSのみ、ポジティブコントロール群は赤血球の最大溶血を誘導するため2 mL脱イオン水で構成しました（各試験群n=3）。次に、前述の抗凝固新鮮全血40 µLを各ウェルに添加し、37℃で60分インキュベートしました。その後、懸濁液を遠心チューブに移し、100×gで5分遠心分離しました。上清をマイクロプレートリーダー（SynergyH1/H1M、BioTek、中国）で570 nm吸光度測定しました。

血栓形成性

血小板豊富血漿（PRP）と電気紡糸サンプルをインキュベート後の血栓形成可能性をin vitroで評価しました。PRPを遠心分離（1500 rpm、20分）で調製し、上半分の血漿を廃棄しました。次に、カバーガラス上のナノファイバーを100 µL PRPで37℃、2時間インキュベートし、PBSで3回優しく洗浄して後続実験用としました。PRPインキュベーション後の血小板活性を評価するため、電気紡糸ナノファイバーを10% FBS添加DMEMで2時間と24時間保管し、CCK-8アッセイキットでナノファイバー上の血小板生存率を測定しました。CCK-8（20 µL）を24ウェルプレートの200 µL無血清DMEM培地に添加し、1時間インキュベートしました。最後に、マイクロプレートリーダーで450 nm波長で懸濁液を測定しました。

細胞培養と細胞生存率

ヒト大動脈内皮細胞（HAEC）を10% FBS（v/v）、1% ストレプトマイシン/ペニシリン（v/v）添加DMEMで、37℃、5% CO₂雰囲気で培養しました。培地を週3回交換しました。細胞を一般的に0.05%トリプシン/EDTAで3分処理し、1000 rpmで遠心分離、新鮮培地で再懸濁して継代または播種を行いました。

細胞播種前、24ウェルプレートのすべてのナノファイバー材料をUV照射で1時間滅菌し、75%エタノール（v/v%）で1時間浸漬しました。次に、ナノファイバーをPBS溶液で4回洗浄し、CO₂インキュベーターでDMEMに12時間浸漬しました。細胞をナノファイバー上に1×10⁴ cells/wellの密度で播種し、毎日培地を交換しました。共培養24時間後、細胞をPBS溶液で3回洗浄し、Calcein-AM/PI二重染色キット（YEASEN生化学技術有限公司、中国上海）で染色しました。PIで死細胞、Calcein-AMで生細胞を染色しました。

ナノファイバー上の細胞形態

ナノファイバー上の細胞接着を観察するため、共培養24時間後に蛍光顕微鏡（Nikon A1 MP、日本）で細胞形態を観察しました。まず、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温30分固定しました。次に、0.5%トリトンX-100溶液で5分間細胞膜を透過化しました。最後に、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインダール（DAPI）で核を染色し、ロダミン-ファロイジンでF-アクチンを染色しました。画像解析ソフトウェア（Image J）で定量解析（細胞密度、単一細胞面積、細胞伸長）をさらに実施しました。

細胞増殖

複合ナノファイバー上の細胞増殖活性をCCK-8アッセイキットで実施しました。HAECをナノファイバー上に8×10³ cells/wellの密度で播種しました。培地を2日ごとに交換しました。共培養1、4、7日後、細胞をPBS溶液で洗浄し、非接着細胞を除去しました。次に、20 µL CCK-8と完全培地を体積比1:10で24ウェルプレートに添加し、インキュベーターで1時間反応させました。吸光度をELISAリーダーで450 nmで測定しました。

DAPIとロダミン-ファロイジン染色を蛍光顕微鏡で実施し、異なるナノファイバーで2日と6日共培養後の細胞数変化を直接観察しました。

統計解析

すべてのサンプルを実験で三重に処理しました。すべてのデータを平均±標準偏差（SD）で表現しました。サンプルの統計解析を一元配置分散分析（ANOVA）で実施し、P<0.05で有意差を判定しました。

結果と考察

CS@PGナノファイバーの調製と特性評価

図1に、CS@PGナノファイバー足場の電気紡糸プロセス概略図と抗凝固性および細胞適合性のin vitro評価を示します。内皮細胞増殖を促進する工学的血管組織足場を開発するため、異なる比率のCS（5、10、15 wt%）をPG（10% v/v）溶液に組み込み、電気紡糸プロセスで複合ナノファイバーを作製しました。

SEMでCS@PG電気紡糸ナノファイバーの構造を観察しました。図2に示すように、PG、5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PGナノファイバーのSEM画像は、電気紡糸技術により連続的、滑らか、ナノスケールの繊維を含む緻密な繊維構造を示しました。PGナノファイバー（図2a）は電気紡糸プロセスを通じてナノファイバー上に多数の不規則なビーズを示し、平均直径406.01±146.28 nmでした。これは、10% w/v電気紡糸溶液の低粘度により、ビーズを含む不均質なナノファイバーが形成されたためと説明されます。ポリマー溶液中のCS量を5から10 wt.%に増加させると、溶液粘度増加によりビーズのない均質ナノファイバーが得られました（図2b、c）。対応して、5%CS@PGと10%CS@PGはそれぞれ382.35±152.99 nmと300.29±100.85 nmのより小さな平均直径を示しました。この結果は主に、CS含有量増加が電気紡糸溶液の伝導度を向上させたためです。しかし、ポリマー濃度が15%になると、ポリマー溶液粘度が高すぎて電場で伸長できません。前群と同じ1 mL/h流量で、印加電圧23 kVでは針先閉塞現象が現れ、テイラーコーンが観察できませんでした。したがって、電気紡糸溶液流量と印加電圧をそれぞれ0.9 mL/hと20 kVに調整しました。15%CS@PGナノファイバーは平均直径266.92±105.43 nmで成功裏に製造されました。

図3aに示すように、CSが5%CS@PGと10%CS@PGナノファイバーで均一に分布していることがわかりました。しかし、15%CS@PGファイバーでCS凝集が検出されました。図3bに示すように、調製ファイバーの硫黄含有量を検出するためEDX元素分析を実施しました。予想通り、得られたファイバーのCS濃度増加に伴い硫黄含有量が増加しました。

FTIRスペクトル解析

調製ナノファイバー足場の化学基の特徴吸収ピークを決定するためFTIRスペクトル解析を実施しました。PGとCSのFTIRスペクトルを対照群としてCS@PGナノファイバー群と比較しました。PGスペクトルでは、3300 cm⁻¹と2935 cm⁻¹に現れる強い吸収バンドは、それぞれ-NH₂と-OH伸縮振動、CH₂非対称伸縮に帰属できます。いくつかの特徴吸収ピークが、1652 cm⁻¹（アミドI）のC=O伸縮振動、1542 cm⁻¹（アミドII）のN-H曲げ振動、1441 cm⁻¹のCH₂伸縮、1267 cm⁻¹（アミドIII）のC-N伸縮振動で現れました。CSスペクトルは、負に帯電したSO₄²⁻中のS=O伸縮振動を表す1245 cm⁻¹で特徴吸収バンドを示しました。

図4に示すように、5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PGナノファイバーのFTIRスペクトルはPCL、Gt、CSの特徴ピークを一緒に示しました。PG群スペクトルと比較して、CS@PG群は1245 cm⁻¹でのCS特徴バンドを示し、ナノファイバー中のCS存在によりCSバンド強度が増加しました。この発見は、CS@PG電気紡糸ナノファイバーに様々な含有量のCSが存在することを確認しました。

ナノファイバーの多孔性、膨潤比、分解性

ファイバーの高多孔性は、材料が優れた相互接続性を持つことを示し、酸素と栄養素の細孔への拡散と細胞浸潤を促進します。図5aにナノファイバー膜の多孔性を示しました。異なるCS比率を含む得られたナノファイバーの多孔性は約80%まででした。電気紡糸ナノファイバーで得られた高多孔性構造は天然ECMを模倣し、細胞に有利な3D微小環境を提供します。多孔性80%までの足場が組織工学で栄養素と代謝産物の輸送に有益であると報告されています。

CS@PGナノファイバー足場のPBS吸収比を比較し、CSのフィルムPBS吸収への影響を評価しました。図5bに示すように、PG足場のPBS吸収比は586.34±49.44%、5%CS@PGと10%CS@PGナノファイバーはそれぞれ492.86±21.99%と510.04±69.55%でした。15%CS@PG群のPBS吸収比（665.07±59.81%）は5%CS@PGと10%CS@PGより有意に高かったです。この結果は、複合ナノファイバー中のCS含有量増加がフィルムのPBS吸収特性を改善できることを示し、これはCS分子に含まれる親水性基（カルボキシルとヒドロキシル）による高親水性が原因と考えられます。

in vitro分解性実験データを図5cに示し、CS比率増加に伴いCS@PGナノファイバー足場の分解速度も増加することがわかりました。これはSO₄²⁻基の存在に起因する可能性があります。図5cに示すように、ほとんどの足場の分解速度は7日後に増加し始め、14日目の分解結果はPG、5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PGナノファイバー足場でそれぞれ8.45%、11.39%、13.97%、15.10%でした。ナノファイバー足場のSEM画像（図5d）は、PBS溶液に7日間浸漬後わずかな膨潤を示しました。SEM画像は、開発されたナノファイバーが7日間まで深刻な分解と膨潤を避けるのに十分安定であり、in vivoまたはin vitroでの細胞応答に影響を与えることを示しています。

血液適合性評価

APTTは内因性凝固機構を介して血液または血漿を検出するシンプルで信頼性の高い方法です。APTTを測定し、電気紡糸ナノファイバーが血液凝固の遅延に及ぼす影響を測定しました。APTTで検出された凝固時間は、対照PGと5%CS@PGおよび10%CS@PGナノファイバー間で統計的に有意な減少を示しました。対照的に、15%CS@PGナノファイバーをPPPとインキュベート後、延長されたAPTTが見られ、抗凝固特性の改善を示しました。図6aに示すように、血液凝固への影響はナノファイバーサンプルの直径に依存しました。5%CS@PGナノファイバーとの相互作用後で最低APTT凝固時間が見られ、10%CS@PG電気紡糸で最高APTTが見られ、溶血度と同様でした。凝固時間はCS比率増加とともに延長されました。

ASTM F756-00（2000）によれば、生体材料の溶血率は<5%が要求されます。本研究での溶血度は、赤血球から放出されるヘモグロビンの比色アッセイで実施し、溶血率（%）= (OD_sam - OD_neg) / (OD_pos - OD_neg) × 100%で計算できます。図6bに示すように、すべてのサンプルは非溶血性で、顕著な溶血を引き起こしませんでした（溶血率<5%）。

血小板生存率実験データを図6cに示します。2時間後、付着血小板の代謝活性は最高値に達し、特にPGナノファイバーとのPRP相互作用後で最大となりました。興味深いことに、24時間後、すべてのサンプルで血小板活性が低下しました。この結果は、ナノファイバー構造による迅速な血小板活性化が、成長因子の速やかな消費と放出をもたらし、滑らかな表面との接触による安定した長期的血小板活性化と比較して生じる可能性があります。血小板の正常寿命は約8-10日ですが、血小板が活性化し始めると短縮されます。

生死細胞染色

CSがナノファイバーの細胞適合性に及ぼす影響を、HAECの細胞生存率、接着形態、増殖をナノファイバー上で6日間評価することで調査しました。付着細胞をCalcein-AM/PI二重染色キット、DAPI染色、CCK-8アッセイキットで評価しました。

図7a-eに、異なるナノファイバーに付着した生死HAECの蛍光画像を示します。Calcein-AM（緑）とPI（赤）でそれぞれ生細胞と死細胞を染色しました。CS@PG複合ナノファイバーに生細胞が接着していることが観察され、異なるCS比率を含むナノファイバーがHAECに毒性を持たないことが示されました。ナノファイバー上の生死細胞数の割合をImage Jでさらに定量解析しました（図7f）。PGナノファイバー上の生死細胞割合と比較して、異なるCS比率を含む他の3群のPG、特に10%CS@PGと15%CS@PG群で生細胞割合が大きく、CS濃度増加とともに割合が増加しました。この結果は、ナノファイバー中のCS存在が細胞生存率維持に有利であることを示しました。

ナノファイバー上の細胞接着挙動

良好な生体適合性を持つナノファイバー足場は、血管生成の第一要件と見なされます。優れた生分解性を持つPCLと優れた生体適合性を持つ天然Gtは、ハイドロゲル、電気紡糸ナノファイバー、三次元足場など様々な構造で組織工学に広く使用されてきました。複合ナノファイバー上のHAEC形態と24時間での細胞-材料相互作用を蛍光顕微鏡で観察しました。10%CS@PGと15%CS@PGの細胞密度はPGと5%CS@PGより統計的に有意に高く、より高レベルでのCS添加が細胞接着を促進することを示しました。図8cに示すように、5%CS@PGと15%CS@PGの単一細胞面積は他のナノファイバー群より大きかったです。しかし、10%CS@PGの細胞伸長はPG、5%CS@PG、15%CS@PGより有意に高かったです（図8d）。この結果は、10%濃度でのCS添加がHAEC伸展を促進することを説明している可能性があります。HAECが複合ナノファイバー、特に10%CS@PGと15%CS@PGで良好に接着、伸展、増殖できることがわかりました。したがって、これら2つのナノファイバー材料は臨床応用における安全で有望な血管材料候補と見なせます。

細胞増殖

CS@PGナノファイバー上の細胞増殖と生存率を、蛍光顕微鏡とCCK-8試験でin vitro調査しました（図9a-c）。電気紡糸PG足場を陽性対照として選択しました。異なるナノファイバーフィルムのCCK-8アッセイ結果を図9cに示します。細胞培養2、4、6日で、すべての群で細胞数が培養時間とともに増加しました。6日目に、10%CS@PGナノファイバーのOD値がPG足場より有意に高かったです。5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PGの細胞増殖比較では、複合ナノファイバー中のCS存在がある範囲で細胞増殖率を増加させることを示しました。しかし、細胞増殖能力はナノファイバー材料の表面形態にも影響されました。15%CS@PGナノファイバーは電気紡糸ポリマー溶液中の高CS比率による強い粘性を示したため、細胞増殖に影響を与えた可能性があります。

結論

まとめると、バイオミメティックCS@PG複合ナノファイバーが電気紡糸技術で成功裏に製造されました。PGナノファイバー中のCS濃度変化により繊維形態と直径が変化しました。CS@PGナノファイバーは適切な多孔性（~80%）とPBS溶液吸収（最大650%）を持ちました。PGナノファイバーへのCS組み込みは抗凝固特性を大幅に改善し、凝固時間を延長し、細胞応答を向上させました。特に、10%CS@PGナノファイバーは好ましい細胞接着、伸長、増殖を示しました。したがって、一定量のCSを組み込んだPG複合ナノファイバーは抗血栓性を発揮し内皮細胞応答を強化し、血管修復と再生における有望な組織工学足場として開発可能です。

データと材料の入手可能性

本研究で生成または分析されたすべてのデータは本論文に含まれています。