ハイブリッド金ナノ粒子-酸化グラフェンベースのラベルフリーイムノアッセイの強化されたプラズモンバイオセンサー

背景

カーボンナノチューブ[1、2]、カーボンボール（バックミンスターフラーレン、C60）[3]、2次元グラフェン[4,5,6]、酸化グラフェン（GO）[7,8,9]などの炭素分子ベースの材料、10,11]はバイオセンサーで広く使用されています。その中でも、グラフェンの二次元シート構造は、高い導電性[12、13]、優れた光透過性[14]特性、および高い生体適合性[15、16]を備えた薄膜を可能にする理想的な材料です。これらの理由から、グラフェンベースの材料は、生物医学および電気化学センシング技術で広く使用されています[17、18]。さらに、光電タイプの生物学的センシング技術は主にGOに基づいています[19、20、21]。酸化物基は、光バンドギャップを吸収および放射するように調整できるため[22、23]、蛍光[24]、表面プラズモン共鳴（SPR）[8,9,10,11、19,20,21]で一般的に使用されます。 ]、および局在表面プラズモン共鳴（LSPR）[25、26]センシング技術。特に、GOには、生体分子の親和性と共有結合を改善する独自の化学官能基（エポキシブリッジ、ヒドロキシル基、ペアワイズカルボキシル基（カルボキシルとカルボニル））があります。

ナノ粒子（Pt、Au、Ag、Pd、ZnOなど）と組み合わせたグラフェン材料の合成は、新しいナノコンポジット技術の開発のために広く研究されてきました。特に、金ナノ粒子（AuNPs）の使用は、比色分析および吸収分光法のエネルギー伝達のメカニズムとして使用されてきました。さらに、過去10年間に、可視光でのAuNPに関する研究により、独特のプラズモン共鳴特性が明らかになりました。 AuNPのサイズと形状を調整すると、光吸収波長シフトが変化する可能性があるため、AuNPを使用してプラズマ吸収と信号増幅を強化できます[27、28]。したがって、AuNPは、光抽出[29、30]および光吸収反応[31、32、33]を強化するための特殊な光学的および光電子的特性により、オプトエレクトロニクスコンポーネントなどの幅広いアプリケーションで広く使用されています。さらに、AuNPは生体適合性があり、化学センシング、生物医学イメージング、癌治療[34、35]、薬物担体[32、33]、光熱治療[36,37,38]での使用が研究されています。造影剤[39]、放射線増感剤[40]、およびバイオセンシング[33、41、42、43]アプリケーション。

AuNPの機能は、酸化を回避し、植物化学物質またはベクターの担体として機能するように架橋剤を追加することによって変更されました。したがって、この組み合わせは生体適合性と生物活性を高めることができます[44、45、46]。シスタミン（Cys）や8-メルカプトオクタン酸（MOA）などの架橋剤は、修飾されたAu表面上のカルボン酸末端チオール自己組織化単分子膜（SAM）によって活性化されます。 MOAはチオールリンカー（-SH末端）を介してAu表面に結合し、単分子層を形成します。

また、プラズモン金属材料の研究も広く報告されています。たとえば、プラズモニック金属コアシェルナノ粒子[47]、ナノスター[48]、およびフッ素ドープ酸化スズナノ粒子[49]は、エネルギーバンドギャップを強化することが示されているため、太陽電池やセンシングアプリケーションで望ましいものになっています。

さらに、化学合成[50,51,52]および静電自己組織化[53]に基づくAuNP-GOハイブリッドの使用が、センサー、エネルギー、および触媒用途で報告されています。近年、バイオセンサーにおけるAuNP-GOハイブリッドの使用に焦点を当てた研究が増えています。これらのハイブリッドは、電気化学的[54,55,56,57,58,59]および表面増強ラマン散乱（SERS）[56、59]プラットフォーム技術の開発に有用であり、生物学的アッセイへの応用を改善することが示されています。ただし、現在、肉眼または比色分析の迅速なイムノアッセイバイオセンサー技術の使用に関する関連する報告はありません。たとえば、AuNP-GOハイブリッドに基づく電気化学的DNAバイオセンサーは、乳がんのバイオマーカーを検出して早期診断を可能にするために使用されてきました。このバイオセンサーを使用すると、ERBB2バイオマーカーの感度が378 nA / nMで、0.16 nMの検出限界（LOD）が得られました[54]。さらに、AuNPドット還元酸化グラフェン（rGO-AuNP）ナノコンポジットベースの電気化学的アプタセンサーを使用して、1 pg L ^{-の間の3,3'4,4'-ポリ塩化ビフェニル（PCB77）の濃度を選択的に検出しました。 1} および10μgL ^{− 1} 、LODが0.1 pg L ^{− 1} [55]。さらに、AuNP-GOハイブリッドは、過酸化水素（H ₂ ）を検出するための電気化学ベースのバイオセンサーとして使用されています。 O ₂ ）、食品の動的応答は0.1〜2.3 mMの範囲で、LODは0.01mMです[57]。もう1つの良い例は、さまざまなアプリケーションでのSERSベースのバイオセンサーおよびSERSで測定されたバイオイメージングのためのAuNP-GO [56、59]およびAuNP-グラフェン[59]ハイブリッドの利用です。

この研究では、層ごとの自己組織化を使用して、AuNP-GOハイブリッドの化学合成と静電自己組織化の代替方法を提案します。また、変更されたAuNPとGOシートを組み合わせた生物学的検出感度とそれらのタンパク質免疫応答を分析します。 2種類のAuNP-GOベースのタンパク質ラベルフリーイムノアッセイを設計し、抗原抗体相互作用における応答時間と感度を評価しました。グラフェン-AuNP複合材料の優れたセンシング機能には、超高感度と、高い特異性を持つ多様な生体分子の検出に影響を与える生体分子相互作用の親和性が含まれます。これらの機能は、これらの複合材料が将来のアプリケーションで有望な役割を果たし、臨床診断アプリケーションでの疾患検出の好ましいルートになる可能性があることを意味します。

メソッド/実験

資料

グラファイトは、Graphene Supermarket（Graphene Laboratories Inc.、米国マサチューセッツ州レディング）から購入しました。 GOシートは、修正されたHummerの方法[60]を使用し、続いてフレークサイズ0.1〜1μmおよび厚さ1.1 nmで5時間超音波粉砕することにより、グラファイトフレークから得られました。シスタミン二塩酸塩（Cys、96％）、テトラクロロ金酸水素（III）三水和物（HAuCl ₄ ・3H ₂ O）、ACS、99.99％（金属ベース）、およびAu 49.5％minは、Alfa Aesar Co.（USA）から購入しました。クエン酸ナトリウム（HOC（COONa）（CH ₂ COONa） ₂ ・2H ₂ O）J.T。から購入しましたBaker Chemical Co.（米国）。ウシ血清アルブミン（BSA、SI-B4287、Sigma-Aldrich、米国）、ウサギで産生された抗ウシアルブミン抗体（antiBSA、SI-B1520、Sigma-Aldrich、米国）、 N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、および1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）は、Sigma-Aldrich Inc.（USA）から購入しました。抗BSA抗体構造の免疫グロブリン（Ig）は、Bリンパ球によって産生され、血漿に分泌されました。 Ig分子の単量体型は、分子量が約150kDaの糖タンパク質でした。各Igモノマーは、2つの抗原分子に結合することができました。すべての試薬と溶媒は、さらに精製することなく使用されました。

ナノ粒子の還元を制御するために、550、400、100°Cの3つの異なる温度条件を使用し、沸騰時間はそれぞれ5、5、120分でした。これらの異なる温度により、ナノ粒子が減少し、追加ファイル1：図S1で明確に見られるのと同じ520nmの吸収スペクトルが得られました。

AuNPの合成

AuNPを取得するために使用された方法は、水中のテトラクロロ金酸タウリンイオンを還元するための還元剤としてクエン酸ナトリウムを使用することに基づいていました。 15mLのHAuCl ₄ ・3H ₂ 1 mMのAuを含むO溶液を還流し、1.8mLの38.8mMクエン酸ナトリウム（Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ ）溶液を沸騰（550°C、1100 rpm）溶液に加えました。クエン酸イオンによる金イオンの還元は5分後に完了し、溶液をさらに30分間煮沸し（400°C、900 rpm）、室温まで放冷しました[36、61、62]。この方法では、平均直径が約15 nmの球状のAuNPが生成され、0.8mLの38.8mMクエン酸ナトリウムの濃度を下げて平均直径が約60nmのAuNPを生成できます[63、64]。化学反応は次のとおりです。HAuCl _4（aq） + C ₆ H ₅ O ₇ Na _3（aq） →Au _（s） + CO ₂ + HCOOH。

抗原ターゲットに基づくGOの準備

図1に示すように、GOシートを作成するためのイムノアッセイ法を設計しました。0.1g/ lの濃度の200μLのGOシート溶液を使用し、共有結合のためにGOシートの表面のカルボキシル末端基を活性化しました。炭化水素鎖を固定化するための形成は、1：1の体積比で400μM（EDC）/100μM（NHS）の混合物を使用して実行されました。 BSAタンパク質はEDC / NHSを使用してGOシートの端に固定化され、GOと–HN ₂ のカルボキシル基間の共有結合反応を活性化および促進しました。 BSAの。次に、活性化された–COOH表面に、アミン（NH ₂ ）を介した強力な共有結合による固定化を行いました。 ）-100μg/ mlの濃度で20μlのBSAタンパク質とのカップリング反応。最後に、遠心分離機を使用して、GO表面の固定化されていないBSAタンパク質を繰り返し除去しました。 GO-BSA抗原ターゲットの手順を図1に示します。

GO-BSAの相互作用。 GOシートのカルボキシル基は、EDC / NHS反応と、GO-BSAの抗原標的に基づくGOの調製を使用して活性化できます

抗体プローブに基づくAuNPおよびAuNP-GOの調製

200μLのボリュームで15nmのAuNPを使用してCysを使用して表面機能化を実行しました。 AuNPは、Cysの誘導体化チオール自己組織化単分子膜を使用して化学的に修飾されました。 AuNPをCys（10 mM）の溶液に、室温で2時間浸漬しました。強いAuNP–S結合（チオール結合）により、CysはAuNPおよび–NH ₂ に簡単に接続できます。 AuNPs–Cys–NH ₂ の表面に露出したグループ 。次に、100μg/ mlタンパク質の抗体（antiBSA）20μlを添加してAuNPの表面を固定化し、遠心分離を繰り返してAuNPの表面に固定化されていないCysを除去しました。次に、脱イオン水を使用して、固定化されていないAuNPを除去しました（Cysは、EDC / NHSによって活性化される必要のないアミノチオール構造です）。 AuNPに結合したCysにはアミン（–NH ₂ ）antiBSAの表面でカルボキシル（–COOH）基と共有結合した基。最後に、遠心分離を繰り返して、固定化されていない抗BSAタンパク質をAuNPの表面から除去しました。一連のantiBSAタンパク質濃度は、100μg/ mlから1pg / mlへの段階希釈によって調製されました。さまざまな濃度の抗体でのAuNP-antiBSAプローブの調製を図2aに示します。

AuNP-antiBSAとAuNP-GO-antiBSAの相互作用。 a の準備 AuNPと b 抗体プローブに基づくAuNP-GO

GOシート法を使用して調製したAuNPを使用して、AuNP-GOナノコンポジットを修飾しました。 AuNPはクエン酸ナトリウム還元法を使用して調製し、60 nm AuNPのサイズはCys（5 mM）を使用して変更しました。次に、EDC / NHSを使用して、GOシートの表面の–COOHグループをアクティブにしました。含まれるAuNPに接続されたCys–NH ₂ GOシートの表面で–COOH基と共有結合した基。 GOシートの表面のAuNPは、Cysリンカーを使用して固定化され、AuNPとGOの間の共有結合反応を促進していました。共有結合は、GOシートの表面機能化を結合するための安定した簡単な方法を提供します。 GOシートを脱イオン水で完全にすすぎ、AuNPリンカー表面の結合していないGOを除去しました。図に示すように、AuNP-CysはAuNP-GOの新しい複合体を形成し、続いて100μg/ mlから1pg / mlの抗体（antiBSA）プローブタンパク質までのさまざまな希釈濃度で固定化してAuNP-GO-antiBSAを形成しました。 2b。

AuNPとGOシートの特性評価

AuNP-GOシートの分散と形態は、300 kVの電界放出型透過型電子顕微鏡（FEG-TEM; Tecnai G2F30S-Twin、Philips-FEI、アムステルダム、オランダ）と高分解能透過型電子顕微鏡（オランダ）を使用して特性評価されました。 FEI Tecnai G20システム（Hillsboro、OR、USA）のHR-TEM）。 AuNP-GOおよびGOシートの分散と形態は、JEOL JSM-7800F Prime Extreme-resolution分析電界放出走査型電子顕微鏡（JEOL Inc.、USA）を使用して特性評価されました。ダブルビーム分光光度計の紫外可視（UV-vis）透過率スペクトルは、UV-vis分光光度計（U-2900、日立ハイテクノロジーズ株式会社、東京、日本）を使用して、室温で200〜1100nmの波長で観察されました。 。ラマン測定は、顕微鏡ラマンシステム（MRI、Protrustech Co.、Ltd。、台湾）を使用して実行されました。検出器には、1800本/ mmの回折格子と50μmのスリットを備えた空冷分光計（AvaSpec-ULS2048L）を使用しました。フーリエ変換赤外分光計（FTIR）の測定は、減衰全反射（ATR）モードのBruker Vertex 80v分光計と、解像度2 cm ^{− 1} のDTGS検出器（64スキャン）を使用して行われました。 約6Paの圧力で真空中のKBrペレット上で。国立清華大学の計装センターがこの作業をサポートしました。 X線光電子分光法（XPS）は、台湾の新州にある国立シンクロトロン放射研究センターの施設を使用して実行されました。光電子分光実験は、XPS用の09A2U5分光ビームラインを使用して実行されました。コアレベルの光電子分光実験では、エネルギーが380および900 eVに固定された光子をC（1s）およびCo（2p）に使用しました。実験は、6mの高エネルギー球面回折格子モノクロメーターで全電子収量モードで実施されました。光子は法線面に入射し、光電子は法線面から58°の角度で集められた。すべてのスペクトルの結合エネルギーは、Au 4f ^7/2 を参照しています。 84.0eVのコアレベル。線形バックグラウンドを差し引いた後、スペクトルは非線形最小二乗アルゴリズムに基づく混合ガウス-ローレンツ関数でフィッティングされました[65]。

結果と考察

構造と形態の分析

AuNPのサイズは、還元剤の性質と形成および貯蔵の条件に依存していました。 SEM分析では、GOシートとAuNPがGO表面に均一に付着しており、平均AuNPサイズは60 nmであることが示されました（図3）。図3aは、Auフィルム上のGOシートのSEM画像を示しており、GOシートは1μm未満でした。 GOとAuNP-GOを比較すると、AuNP-GO複合材に金元素が見られます。これは、AuNPがしわの寄ったGO表面にうまく吸着されたことを示しています。合成されたAuNP-GOハイブリッドは、図3bに示すようにTEMを使用して特性評価されました。図3b、cは合成条件を示しています。 10mlのGOシート溶液の濃度は0.1g / lで、200μlのAuNP溶液の濃度は2.2nMでした。図3aの100nmスケールバーと図3bの0.5μmスケールバーのTEM画像は、サイズのさまざまな増幅を示しており、AuNPがGOシートの表面に固定化されていることを明確に示しています。 AuNPは球形であり、図2bに示すように、GOシートの表面のカルボン酸官能基がAuNPとの化学共有結合の形成に重要な役割を果たしている可能性があることを示唆しています。

ナノコンポジットの表面形態分析。 a GOシートと b のSEM画像 AuNP-GOコンポジットのTEM画像。 c ERGOAuNP-GOフィルムのTEM画像

XPS、ラマン、およびFTIR分光法によるGOの特性評価

図4aは、GOシートの高解像度C 1sXPSスペクトル分析を示しています。 284.6 eVの結合エネルギーで最高強度のC1は、C–C（sp2）のカルボニル官能基に対応し、285.6、286.6、288.2、および289.4 eVのピークは、芳香環のC–C（sp3）に対応しました。 、ヒドロキシル基とエポキシ基のC–O、カルボニル基のC =O、およびカルボキシル基のO–C =O。金膜基板上のGOシートのC1s XPSスペクトルは、C–C（sp2）、C–C（sp3）、C–O、C =O、およびO–C =Oの相対的な原子百分率がそれぞれ77.44、2.16、18.14、1.77、および0.49％[66]。図4bは、1614 cm ^{− 1} にスペクトル特徴のピークがあるNaCl溶液中のGOシートのラマンスペクトル分析を示しています。 （Gバンド）、1355 cm ^{− 1} （Dバンド）、2714 cm ^{− 1} （2Dバンド）、2947 cm ^{− 1} （G + Dバンド）、および〜3240 cm ^{− 1} （2Dバンド）[38、67]。図4cに示すように、ATR-FTIRスペクトルを使用して、さまざまな酸素化種の特性を解明するために、GOシートの形成をさらに分析しました。このATR-FTIRスペクトルは、GOのいくつかの特徴的なピークも明らかにしました。 850 cmでのC–O ^{− 1} （C–O–C）エポキシド振動により、1080 cm ^{− 1} でのC–O （C–O）アルコキシ伸縮振動により、1500〜1600 cm ^{− 1} でC =C 芳香族C =C結合、および1260 cm ^{− 1} でのC–Oによる （C–O–C）エポキシドの非対称振動によるものです。 GOシートの端にあるカルボキシル基は–COOH伸縮振動を示し、1652および1731 cm ^{− 1} にピークがありました。 カルボニル基からのC =O伸縮振動に対応します。スペクトルには、2900 cm ^{− 1} に3つのピークも示されました。 –CH ₂ の非対称および対称伸縮振動に関連 変形のピークは1462cm ^{− 1} GOの平面にあるアルケン基（C–H）によるものです。 GOのFTIRスペクトルは、C–OHおよびH ₂ の広範囲の吸収広帯域ピークを示しました。 O振動3370cm ^{− 1} 伸縮振動による[67]。

GOシートのスペクトル分析。 a C1s領域でのXPS高解像度スキャン b ラマン、および c FTIR

タンパク質相互作用特性を使用したGOおよびAuNPの分析

タンパク質相互作用分散液を含む水性GOおよびAuNPのUV-visスペクトルを図5に示します。AuNPは、表面プラズモン（SP）吸収バンドに応じて高い吸光係数と固有のサイズを持っていました。 2つの異なる次元の修正されたAuNPは、520および540 nmのSP吸収スペクトルに対して15および60nmでした[68、69]。図5aは、AuNP-Cys消光バンドを備えた5 mMの濃度のCysで修飾されたAuNP（520 nm）溶液を示しています[69]。水性GO分散液のUV-visスペクトルは、2つの吸収ピークを生成しました。異なるサイズの芳香族sp2クラスターの芳香族C–C結合のπ–π *プラズモンピークに対応する230 nmの最大値と、エポキシドおよびカルボニル（C =O）結合の存在によるn–π *プラズモンピーク（図5b）[9、20]。 GO–EDC / NHSおよびGO–EDC / NHS–BSA溶液のUV-visスペクトル（図5b）は、GO–EDC / NHSおよびGO–EDC / NHS–BSAが約270nmにピークを示したことを示しています。おそらくGOとアミン基の間の強い相互作用によるものです[70、71]。図5cは、AuNP（60 nm）を含むさまざまな濃度のantiBSAの結合の吸収スペクトルを示しています。図1bは、AuNP-antiBSAプローブ（サンプルB1）の合成溶液を示しています。波長には540および755nmに明らかな吸収ピークがあり、540 nmの波長は主にAuNP（60 nm）によって引き起こされ、755nmのピークはAuNP + Cys + antiBSAの組み合わせ吸収ピークに対応します。この結果は、antiBSA濃度の増加により、540 nmでの吸光度が徐々に増加し、755nmでの近赤外吸収が継続的に増加することを示しています。 AuNPの表面での異なるantiBSA結合相互作用により、表面の屈折率が変化し、それがLSPRの吸光度に変換されました。 LSPRバンドは粒子サイズの影響を受けました。 AuNPsは可視領域で強いSPRバンドを示しました。中型粒子の屈折率の増加に伴い、SPRピーク位置のシフトを可視から近赤外に調整することができます。タンパク質相互作用の実験結果では、図5dに示すようにAuNP-antiBSAを混合しました。感度は、測定された屈折率の関数として500〜760nmバンドのLSPR波長をプロットすることによって決定されました。次に、1.45nMから145fMまでのさまざまな濃度のantiBSAタンパク質を希釈して使用し、200μlの容量で混合しました。 540nmと760nmの吸収の変化は、antiBSAとAuNPの濃度の違いによって引き起こされました。次に、5分後にスペクトル測定が行われ、異なる濃度の光強度吸収が示され、AuNPの60nmの吸収ピークが540nmと755nmで観察されました。これらの結果は、AuNP-antiBSA吸収検量線と一致していました。検量線は y によって適合されました =2.43 + 0.25×（相関係数、 R ² =0.91）540 nmの吸収ピーク、および y =2.56 + 0.31×（相関係数、 R ² =0.96）760 nmの吸収ピークの場合、 x はantiBSAと y の濃度です は吸光度です。

抗BSA相互作用応答を伴うAuNPのUV-vis吸収スペクトルの分析。 a AuNPのSP吸収スペクトル、 b GOバウンドBSA、 c AuNP-anti-BSAプローブ、および d 1.45 nM〜145fMのさまざまな濃度のantiBSAタンパク質の希釈でのantiBSA相互作用応答を伴うAuNPの検量線

イムノアッセイの相互作用に基づくAuNP-antiBSAおよびAuNP-GO-antiBSAの分析

GOおよびAuNP-GOナノコンポジットの免疫学的検出メカニズムを理解するために、結合反応のスペクトル分析を図6に示すように実行しました。図6aは、AuNP-GOおよびGO-BSAナノコンポジットのUV-vis吸収スペクトルを示しています。 GOシート（0.1 g / l）溶液の場合、約230 nm [70]にピークがあり、約300 nmにショルダーがあり、GO-BSAコンジュゲートは約270nmに吸収ピークと約270nmにピークを示しました。 230 nm [9、20、70] 。 AuNP-GOナノコンポジットの組み合わせでは、230、300、540nmにそれぞれ3つの吸収ピークが見られました。 AuNPとGOシート表面の間のπ–πスタッキングまたは共有結合相互作用が、AuNPを高度に生体適合性のあるGO材料に固定する主な推進力でした。 GOシートはAuNPに集まるように作られているため、200〜300nmの強い吸収帯が得られます。したがって、GOシートの吸収は、可視光帯域でのAuNPの吸収よりもはるかに大きかった。図6bは、AuNP吸収ピークのUV-visスペクトルが540 nmにあったことを示しています[50、68、69]。吸収ピークは、AuNP + Cysコンジュゲートの540nmと660nmにありました。 AuNP + Cys + GOコンジュゲートの場合は230、300、540、および660nm。 AuNP + Cys + GO + antiBSAコンジュゲートの場合は230、270、540、660nm。 GOシートには、230 nm（π–π *プラズモンピーク）と300 nm（n–π *プラズモンピーク）に2つの吸収ピークがありました。吸収波長のシフトが認められ、この吸光度シフトは、AuNP + Cys + GO表面へのantiBSA（0 fM〜1.45 nM）吸収の確認を示していると考えられました。図6cは、図2bのように、AuNP + Cys + GO + antiBSAプローブ（サンプルB2）の溶液の合成を示しています。 antiBSA濃度の増加は、540nmで比較的高かった。図6cは、さまざまな濃度の光強度吸収を示しており、AuNPの60nmの吸収ピークが540nmで観察されました。 antiBSA濃度の増加は、540nmで比較的高かった。この結果は、antiBSA濃度を上げると、AuNP-GOが540nmでのプラズモン吸収特性を高めることができることを示しています。さらに、イムノアッセイ実験では、図6dに示すように、GO-BSA（1.52μM）ターゲット（サンプルA）とAuNP + Cys + GO + antiBSAプローブを混合しました。 GOシートの疎水性およびπ–π相互作用特性に加えて、GOシート上のタンパク質とカルボキシル基の間の共有結合も表面接着をサポートしました。この結果は、AuNP + GO-antiBSAハイブリッド構造が、GO-BSA上の他のタンパク質と安定した免疫応答を形成するためである可能性があります。波長には、260nmに明らかな吸収ピークがありました。 GOシートの疎水性およびπ–π（π–π *プラズモンピーク）相互作用特性に加えて、GOシート上のタンパク質とカルボキシル基の間の共有結合も表面接着をサポートしました。 BSAとantiBSAの結合の前後で、GOのπ–π *プラズモンピーク値（230および270 nm）が大幅にシフトし、BSAとantiBSAが正に結合していることが証明されました。

免疫応答のためのUV-vis吸収スペクトルの分析。 a AuNPバウンドGOおよびGOバウンドBSA、 b AuNPとGOにバインドされた抗BSA、 c AuNP-GO-antiBSAプローブ、および d AuNP-GO-antiBSAプローブと免疫応答のGO-BSAターゲット

図7は、これらの結果が検量線とよく一致していることを示しています。上記の実験結果の詳細な分析（図6c、d）は、対応する平均吸光度の不正確さに対する検知応答が1.3487、1.1776、1.0698、0.8755、および0.8588（図7a）および0.9226、0.8535、0.7649、0.7243であることを示しました。 、および0.695（図7b）。それぞれ1.45 nM、145 pM、14.5 pM、1.45 pM、および145fMのタンパク質濃度に対応します。図7aは、検量線の線形回帰が f（x）であることを示しています。 =0.918 + 0.124 × （相関係数、 R ² =0.94）antiBSA相互作用のあるAuNP-GOプローブの場合、 x はタンパク質濃度であり、 y は吸光度です。さらに、図7bは、近似曲線の線形回帰方程式が f（x）であることを示しています。 =0.791 + 0.057 × （相関係数、 R ² =0.954）イムノアッセイに基づくGOおよびAuNP-GOの場合。

異なるタンパク質濃度で得られたセンシング応答の検量線の比較。 a antiBSA相互作用のあるAuNP-GOプローブの検量線。 b イムノアッセイに基づくGOおよびGO-AuNPの検量線

定量実験中に、干渉物質として機能するように、固定濃度の10 ng / mlのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）タンパク質を添加しました。結果は、イムノアッセイの検量線上の固定干渉hCGタンパク質が f（x）によって適合されたことを示しました。 =0.843 + 0.113×（相関係数、 R ² =0.89）antiBSA相互作用を伴うAuNP-GOプローブ（図7a）、および f（x） =0.722 + 0.051 × （相関係数、 R ² =0.73）イムノアッセイに基づくGOおよびAuNP-GOの場合（図7b）。

さらに、実験結果は、検出戦略が特異性を失うことなく表面再生を可能にし（4回の再生）、1.45 nM、145 pM、14.5 pM、1.45pMの範囲の動的応答を持つantiBSAタンパク質の検出にも使用できることを示しました。 、145 fM、および0fM。 The results demonstrated that with a decreased concentration of antiBSA (from 1.45 nM to 145 fM) and even without the presence of antiBSA (0 fM), the spectral absorption intensity did not change the minimum level of quantitation. The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.

結論

We successfully demonstrated a GO-bound AuNP biocompatible nanocomposite in a biosensing mechanism in a rapid and label-free immunoassay for biomolecule interactions. The results showed that the AuNP-GO nanocomposite was biocompatible and exhibited LSPR extinction to biomolecules, which could promote the absorption spectra characteristic peaks, accelerate the reaction of molecules, and enhance the stability of chemical covalent bonds during immobilization. For the detection of antiBSA protein, the limit of detection of the GO and AuNP-GO based on the immunoassay was as low as 145 fM. Among the AuNP-GO biosensors, GO immobilized in the AuNP-GO nanocomposite showed the highest bioaffinity, with good sensitivity, low detection limit, and fast response toward the protein immunoassay. The results of our experiments showed that a fixed concentration 10 ng/ml of hCG protein as an interferer did not affect the test response. Given the growing trend of applying biosensors in POCT, LSPR for AuNP-GO nanocomposite technology is a highly promising and versatile tool for use in immunoassays. Combining the properties of AuNPs and GO sheets to develop new nanocomposites for the synthesis of smart materials shows promise for the development of user-friendly diagnosis applications. In the future, AuNP-GO nanocomposites may be used in innovative immunoassays, rapid detection reagents, and miniaturization, which may in turn make LSPR technology an irreplaceable tool for routine clinical analysis and POCT diagnostics.

略語

Ag:

Silver

AntiBSA:

Bovine serum albumin antibody

Au:

Gold

AuNP:

Gold nanoparticle

BSA:

Bovine serum albumin

Cys:

Cystamine

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

FEG-TEM:

Field-emission gun transmission electron microscope

FTIR：

Fourier-transform infrared spectrometer

GO:

Graphene oxide sheet

HR-TEM:

High-resolution transmission electron microscope

LOD:

Limit of detection

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MOA:

8-Mercaptooctanoic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

Pd:

Palladium

POCT:

Point-of-care testing

Pt:

Platinum

RGO:

Reduction graphene oxide

SAMs:

Self-assembled monolayers

SERS:

Surface-enhanced Raman scattering

UV-vis：

Ultraviolet-visible

XPS：

X線光電子分光法

ZnO:

Zinc oxide