リガンドを含まないイリジウムナノ粒子の容易な合成とそれらのinvitro生体適合性

要約

高密度無機ナノ粒子は、X線イメージングを含む放射線を利用する医療用途や放射線治療の放射線量増強剤として有望であることが示されています。水素化ホウ素還元剤を使用して塩化イリジウム（III）を還元することにより、小さな（〜2 nm）イリジウムナノ粒子（IrNP）を生成する水性合成法を開発しました。他の溶液ベースの合成方法とは異なり、均一で単分散のIrNPは、界面活性剤や他の可溶化リガンドを使用せずに生成されます。これらのナノ粒子は、X線回折および高分解能透過型電子顕微鏡（TEM）で観察されるように、高度に結晶性です。肝細胞とマクロファージ細胞を使用したinvitro代謝毒性アッセイは、IrNPと塩化イリジウム（III）の両方が最大10μMのイリジウムの濃度で十分に許容されることを示しています。さらに、IrNPは溶血アッセイで評価され、100μMまでの濃度にさらされたときに赤血球に有意な影響を及ぼさないことがわかりました。全体として、これらの結果は、このナノマテリアルのinvivoアプリケーションの可能性を裏付けています。

背景

貴金属ナノ粒子は、その興味深い光学的、電子的、および表面触媒特性のために、新しいナノテクノロジーの主力です。ナノメディシンでは、これらのユニークな生体材料は、幅広い用途向けの表面修飾を通じて生物学的相互作用を調整できるため、大きな注目を集めています[1]。金ナノ粒子（AuNP）は、センシングおよび治療用途のために広く研究されてきました[2、3]が、銀を含む他の貴金属は、抗菌剤などのニッチな用途を発見しました[4]。しかし、表面触媒特性のために一般的に使用されているプラチノイド元素で構成されるナノ粒子[5]は、生物医学的応用のためにまだ徹底的に検討されていません。これらの元素の並外れた表面安定性と既知の生物学的適合性、およびナノスケールでのそれらの潜在的な新規物理的特性により、これらの元素はAuNPのユニークな代替品になります。

高エネルギー放射線は、画像診断や放射線治療などの医学で広く利用されています。したがって、高原子番号や高密度ナノ粒子など、放射線と相互作用する機能性材料は、これらのモダリティのパフォーマンスを向上させる可能性があります。これまでの化学および工学研究の大部分は、放射線相互作用を強化するためのAuNPに焦点を当ててきましたが、ビスマスとハフニウムはそれぞれ診断と治療の用途で検討されてきました[6、7]。

ここでは、高密度のために強い放射線減衰があると予測されるイリジウムナノ粒子（IrNPs）を生成するための合成方法を提示します。イリジウムは最も反応性の低い金属の1つであり、一般的に生物学的に適合性があると考えられており、元素密度は22.56 g / cm ³ です。（非常に有毒であることが知られているオスミウムに次ぐ）。イリジウムの同位体、¹⁹² Irは、一般的に使用される近接照射療法のガンマエミッターであり、この材料の成功の一部は、高密度、つまり、少量の材料に多数の原子が含まれていることによるものです。現在の研究では、IrNPの合成とそのin vitro生体適合性、および選択した細胞株でこれまで評価されていなかったイリジウムイオンの合成を紹介します。これらの新規IrNPは、材料の化学的不活性と優れた密度にもかかわらず、医療目的で容易に探索されていません。イリジウムは他の貴金属と同様に比較的高価な材料ですが、商品としての現在の価値は金の約4分の3、ロジウムの半分であり、興味深い経済的代替品となっています。

メソッド

IrNPの合成

すべての合成反応は、精製された18MΩの水中で好気性条件下で室温で実行されました。 20 mMの塩化イリジウム（III）（Acros Organics）ストックをバス超音波処理で調製し、少なくとも20分間撹拌して、光学的に透明な溶液を生成しました。 1.0 Mボランモルホリン（Alfa Aesar）の溶液も、バス超音波処理によって調製しました。総量500mLの大規模な合成では、25 mLの塩化イリジウム（III）溶液を使用し（1.0 mMに希釈）、5.0 mLのボランモルホリンを急速に攪拌しながら添加しました（最終10 mM濃度）。溶液は30分かけて徐々に暗褐色から黒色に変わりました。ナノ粒子を少なくとも60分間安定させました。このコロイド溶液を遠心スピンフィルター（Amicon Ultra-4、10k MWCO再生セルロース）に直接添加し、ナノ粒子を4000× g で収集しました。精製水で洗浄しました。次に、ナノ粒子を水に懸濁し、シリンジフィルター（Millex-MP0.22μmEO）を通過させ、定量化のために保存しました。

ナノ粒子の特性評価

X線光電子分光法（XPS）分析では、ナノ粒子を等量の硝酸に懸濁し、マイクロ遠心分離管（5分、17 rcf）で遠心分離して収集し、分析前に水中に懸濁しました。透過型電子顕微鏡法（TEM）は、200kVで動作するFEITecnai F-20TEMで実行されました。精製されたIrNPは、ホーリーカーボンCuでサポートされたTEMグリッド（Ted Pella）にドロップキャストされ、室温で一晩乾燥されました。線回折分析は、ImageJソフトウェア分析を使用して実行されました。 X線回折（XRD）分析では、濃縮されたIrNPをスライドガラス上にドロップキャストし、室温で乾燥させました。 XRDデータは、グラファイト単色化CuKα放射線を使用したRigaku Ultima IV X線回折システムの集束ビーム（Bragg–Brentano）ジオメトリで収集されました。スキャンは、室温で0.1°/分のスキャン速度で20〜80°2θの角度範囲で実行されました。動的光散乱（DLS）は、使い捨てポリスチレンキュベットのMalvern NanoZSPで実行されました。ナノ粒子は水に懸濁されており、データは数で分布していると報告されています。 UV-Vis吸光度スペクトルは、黒い96ウェルプレートのTecan M200 Proで収集され、総溶液量は100μLでした。イリジウムの濃度は、相対的な吸光度のピークを示すために調整されました。 XPS分析は、半球型電子分析装置とアルミニウムKɑ（1486.7 eV）X線源を備えたPHI VersaprobeIIで実行されました。スペクトル分析は、Multipakソフトウェアスイートを使用して実行されました。結合エネルギーのキャリブレーションは、284.6 eVのC1sピークを使用して実行され、ピークフィッティングは非対称ピークと反復シャーリーバックグラウンドに基づいており、カイ2乗値は1.13になりました。 IrNPと塩化イリジウム（III）溶液の誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）は、生物学的毒性アッセイの前に評価されました。 50マイクロリットルの各IrNP溶液を、50μLの王水（3：1 M濃硝酸と塩酸）で、分解チューブ内で70°Cで一晩消化しました。次に、分析のためにサンプルを5.0 mLの1％硝酸で希釈しました。 ICP-MSは、衝突ガスとしてヘリウムを使用して、Agilent7900で実行されました。検量線は、100〜0.1μg / mLのイリジウムストック溶液（1％HCl中）を使用して作成し、濃度が数十ppbの範囲で測定されるようにすべてのサンプルを希釈しました。

細胞毒性分析

HepG2およびJ774A.1細胞株を2×10 ⁵ で播種しました 96ウェルプレート（10％FBSを含むDMEM）でウェルあたりの細胞数（100μL）を24時間静置します。イリジウムナノ粒子、イリジウム塩、水、またはDMSOを10％の容量（10μLの追加容量）で追加しました。次に、細胞を24時間または48時間インキュベートしました。生存率分析のために、培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄した。 10％Alamar Blue（Thermo Scientific）を含む100マイクロリットルの培地を細胞と2時間インキュベートしました。次に、培地を黒色の96ウェルプレートに再プレートし、Tecan M200 Proで蛍光を読み取りました（ex530 / em590）。すべてのデータは4重に実行され、一般的な傾向を確認するために独立した日に実験が繰り返されました。以前に報告されたように溶血アッセイを実施しました[8]。

結果

イリジウムナノ粒子の合成と特性評価

この合成では、水中で10倍モル過剰のボランモルホリンで還元することにより、塩化イリジウム（III）塩から元素IrNPを形成します。反応は数リットルまで容易に拡張可能であり、粒子は好気性条件下で室温で形成されます。この合成法では、高分解能TEMイメージングで観察されるように、結晶化度の高い小さな（2〜3 nm）均一なIrNP（図1a）が生成されます。 TEMから得られた回折パターンは、イリジウムの回折格子を示す0.22 nmの線間隔で、ナノ結晶の同一性をさらに確認します（図1b）。 X線回折パターンは元素イリジウムのパターンとほぼ一致しています（PDFカード番号：9008470、図1c）。合成されると、IrNPは水中でコロイド状に安定し、室温で数か月間溶液中に懸濁されたままになります（図1d）。

ナノ結晶は、淡黄色のイリジウム（III）前駆体から暗黒のナノ粒子溶液への色の変化によって観察されるように、30分の間に形成されます（図2）。基本的な環境にさらされると、これらのIrNPは、青色に見える予測される酸化イリジウムを形成します。ニート硝酸でのインキュベーションなどの酸性条件は、粒子の結晶化度や材料の完全性に影響を与えるようには見えません。ただし、凝集と沈殿を引き起こします。さらに、生物学的に関連する溶液（リン酸緩衝生理食塩水および組織培養培地）でも数時間にわたって凝集が観察され、将来の生物医学的用途にはさらなる表面修飾が必要であることを示唆しています。硝酸ですすぎ、水に懸濁したIrNPのX線光電子分光分析では、主要なイリジウム（0）表面が明らかになりますが、データのピークフィッティング分析では20％の表面酸化が示されています（図3）。 XRDまたはXPSのいずれによっても、粒子の好ましい結晶子配向は観察されません。あるいは、合成プロセス中（核形成前）に反応溶液にチオール界面活性剤を導入すると、粒子形成が阻害されました。

イリジウム細胞毒性

キャップのないIrNPのinvitro生物学的適合性を評価し、これを2種類の哺乳類細胞における塩化イリジウム（III）塩と比較しました。肝細胞癌細胞株であるHepG2を使用して、肝臓に対する潜在的な毒性を評価しました。 J774A.1マクロファージ細胞を使用して、単核食細胞系に対する毒性を評価しました。細胞をIrNPまたは塩化イリジウム（III）（イリジウムの総濃度で正規化）とともに24時間または48時間インキュベートし、洗浄して細胞外イリジウムを除去し、Alamar Blueアッセイを使用して代謝活性を評価しました（図4）。 HepG2細胞は、24時間でイリジウム（III）の存在下で代謝活性の増加を示します（最大115％の生存率）が、応答は48時間で軽減され、500μMのイリジウム（III）は生存率を90％に低下させます。 HepG2細胞は、24時間および48時間で50μMのIrNPの存在下で94％から78％に細胞生存率が低下しました。興味深いことに、J774A.1細胞は、50μMの濃度でIrNPに応答して代謝活性の増加を示し、24時間で122％の生存率を示します。ただし、48時間後、正常な細胞機能が再開され（98％の生存率）、ナノマテリアルに応答した一過性の代謝刺激が示唆されました。 500μMIrNPと24時間インキュベートしたJ774A.1細胞は、明らかに中性の代謝反応を示しますが、48時間後のこの濃度での生存率の低下は、これが中性の生存率反応として現れる毒性と代謝刺激の結果であることを示唆しています。さらに、溶血アッセイによりIrNPと血液の生体適合性を評価したところ、PBS中の赤血球と37°Cで1時間インキュベートした場合、IrNPは有意な溶血を誘発しなかったことがわかりました（追加ファイル1：図S1）。

ディスカッション

水素化物および水素ガスによるイリジウム塩の還元[9,10,11,12,13]、UVおよびガンマ線[14,15,16,17]を含む、触媒用途向けのナノスケールイリジウムを製造するためのさまざまな合成プロセスが検討されてきました。およびポリオールまたはアルコールの還元[18、19、20]。ただし、これらの合成方法の多くは、基板へのイリジウムの組み込みまたは化学反応のサポート用に設計されており、生物学的アプリケーションと互換性がありません[21]。最近、エアロゾル化された¹⁹² Irは、肺毒性のモデルナノスケール材料として採用され、その並外れた不活性のために選択されました[22、23]。これらの研究の主な目的は、肺から吸入された微粒子のクリアランスと転座を調べることでした。ただし、この要素の生体適合性も強調しています。

キャップのないIrNPのinvitro生物学的適合性を評価し、これを、注入されたナノ粒子の最高濃度を蓄積すると予想される2種類の哺乳類細胞における塩化イリジウム（III）塩と比較しました。 J774A.1細胞におけるイリジウム（III）の毒性は、通常の毒性用量反応曲線に従います。 100μMのイリジウム（III）は、細胞の生存率を93％と66％に低下させ、500μMは24時間と48時間でそれぞれ40％と10％の細胞生存率をもたらします。このデータは、イリジウム（0）およびイリジウム（III）に対する興味深い細胞特異的応答を反映しており、これらの効果をinvivoでさらに調査することを期待しています。より小さなIrNPおよびその他の難溶性無機ナノ材料は、腎臓および肝臓への移動が予想され、腎臓での一時的な滞留は短く、肝臓での滞留は長く、細胞特異的な毒性プロファイルにさらに影響を与える可能性があります。より大きなイリジウム粒子の糞便からの排泄が予想されますが、生体内でのコロイド安定性を維持できれば、これらのIrNPの非常に小さいサイズが腎系で容易にろ過される可能性があります[23]。

インビボでの適用に備えて、IrNPの血液適合性を溶血アッセイによって評価した。マウスの全血を利用して、赤血球の破裂とヘモグロビンの放出の可能性に対するこれらのIrNPの効果を評価しました。最終的な表面修飾IrNPの詳細な研究を評価する必要がありますが、現在のIrNPビルディングブロックは、非常に高濃度（500μM）になるまで検出可能な溶血反応を誘発しません。

結論

これらの研究から、イリジウム（0）ナノ結晶は、塩化イリジウム（III）の単純な水性水素化ホウ素還元によって容易に合成でき、その結果、約5nmの流体力学で水中でコロイド的に安定な2〜3nmの高結晶性ナノ粒子が得られると結論付けています。サイズ。急性暴露中、これらの粒子は肝細胞で最大50μMのイリジウム（塩化イリジウムの場合は10μM）の濃度で無毒であり、マクロファージ細胞の代謝活性を刺激し、実用的な濃度で溶血反応を誘発しません。これらのリガンドを含まないナノ粒子は、生物学的および医学的用途で使用するための後続の表面修飾IrNPのビルディングブロックまたはコアとして機能する可能性があります。 X線または他の放射線の存在下でのこれらの高密度ナノ材料の機能特性のさらなる調査は、新しい治療薬および診断薬の機会を提示します。