ベラパミルの細胞取り込みを増強するための凍結乾燥ハイブリッドナノ構造脂質担体：統計的最適化とinvitro評価

背景

ベラパミルは、フェニルアルキルアミンクラスのL型カルシウムチャネル遮断薬であり、α-アドレナリン受容体の拮抗薬です。高血圧、上室性頻脈性不整脈、狭心症、群発性頭痛の治療に広く使用されています。バイオ医薬品分類システムによると、ベラパミルはクラスIの薬剤として分類されます。このクラスの薬剤は、経口投与後に腸膜を介して良好に吸収されることが知られています（≤90％）。しかし、門脈循環を介した初回通過代謝が速いため、ベラパミル経口投与量の20〜35％のみが血液循環に渡されます[1]。したがって、ベラパミルの細胞取り込みを強化し、おそらくその生物学的利用能を改善できる適切な担体を開発することが重要です。

ナノ構造脂質担体（NLC）などの第2世代の脂質ベースのナノ製剤は、治療薬の送達に使用できる大きな可能性を示しました[2、3]。 NLCは、固体脂質ナノ粒子（SLN）と比較して、化学的および物理的安定性が高く、放出制御特性も備えています。さらに、NLCは、脂質マトリックスの秩序化された結晶格子を形成することにより、薬物分子に対して高い負荷容量を示します。これにより、保管中の薬物の排出を最小限に抑えることができます。 NLCは脂質から調製され、腸内のカイロミクロン形成を促進し、薬物の生物学的利用能を高める可能性のあるNLCの吸収を促進します[4]。したがって、本研究では、薬物のバイオアベイラビリティの向上につながる可能性のある薬物の細胞取り込みを改善するために、ハイブリッドベラパミル-デキストランナノ構造脂質担体（HVD-NLC）を開発しました。

ほとんどの親油性薬物はNLCに簡単に組み込むことができますが、ベラパミルのような親水性薬物を脂質ベースのナノ製剤に閉じ込めることは非常に困難です。したがって、本研究では、ベラパミルのカプセル化を強化し、NLCからの放出を延長するために、対イオンデキストラン硫酸ナトリウムを使用するハイブリッドNLCを準備しました（図1）。 HVD-NLC製剤は、高温および高せん断均質化法によって調製され、2 ⁴ を使用して統計的に最適化されました。 完全な階乗設計。この研究では、固体脂質であるCompritol888ATO®と液体脂質オレイン酸の2種類の脂質を使用しました。調製されたHVD-NLCは、粒子サイズ（PS）、ゼータ電位（ZP）、多分散度指数（PDI）、および薬物捕捉効率のパーセント（％EE）について特徴づけられました。最適化されたHVD-NLCは、凍結防止剤としてトレハロースを使用して凍結乾燥されました。インビトロ放出プロファイルは、アルカリ性および酸性環境で実施された。選択したHVD-NLCからのベラパミルのinvitro細胞取り込み研究は、Caco-2細胞株を使用して実施されました。最適化された製剤の安定性試験は、3つの異なる条件（5°C±3°C、25°C±2°C / 60％RH±5％RH、および40°C±2°C /）で6か月間実施されました。 75％RH±5％RH）。

水溶性カチオン性薬物ベラパミル塩酸塩と対イオンポリマーデキストラン硫酸ナトリウムの静電複合体の形成

メソッド

資料

ベラパミルHClは温州製薬工場（温州、中国）から購入しました。 Compritol888ATO®（Glycerol dibehenate EP–Glyceryl behenate NF）は、Gattefosse（Saint-Priest、France）から入手しました。オレイン酸はR＆Mケミカルズ（エセックス、英国）から調達しました。 Tween80®（ポリソルベート80）は、Euro chemo-pharmaSdnから購入しました。 Bhd。（マレーシア、ペナン）。ポロキサマー188（Pluronic®F-68）は、Molekula（ドーセット、英国）から調達しました。トレハロース、Sephadex®G-25、およびウシ胎児血清（FBS）は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手しました。 Caco-2細胞株はATCC（バージニア、米国）から入手した。ペニシリン-ストレプトマイシン溶液100Xは、Biowest（Nuaillé、フランス）から入手しました。トリプシン0.25％およびダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）は、GEヘルスケアライフサイエンスのハイクローン研究所（米国ユタ州）から調達しました。 Passive Lysis Buffer、5XはPromega（Wisconsin、USA）から購入しました。

メソッド

HVD-NLCの準備

HVD-NLCは、熱間高せん断均質化法によって調製されました。脂質相はCompritolATO888®で構成され、オレイン酸は85°C（固体脂質の融点より10°C高い）で加熱することにより溶融しました。必要な量のベラパミルを秤量し、Tween80®とポロキサマー188を1：1 w の比率で混合した水相に溶解しました。 / w 。水相を脂質相と同じ温度に加熱した。水相を脂質相に注ぎ、デジタルT25Ultra-Turrax®ホモジナイザー、IKA®（シュタウフェン、ドイツ）を使用して24,000 rpm、85°Cでホモジナイズしました。続いて、デキストラン硫酸水溶液（ベラパミルに対して1：1の比率）を均質化プロセス中に混合物にゆっくりと加えた。調製したHVD-NLCを室温（25±2°C）で放冷しました。

2 ^{4を使用した定式化パラメーターの統計的最適化} 完全な階乗設計と望ましさ関数のアプローチ

2つのレベルと4つの変数を使用した完全な階乗設計を実行して、特性（従属変数または応答）に対する定式化独立変数（因子）の影響を最適化および評価しました（表1）。各独立変数の真の高レベルと低レベルは、予備調査に基づいて選択されました。

従属変数から得られた実験的応答は、4つの独立変数の個々の効果と組み合わせた効果の結果でした。この2レベルの実験計画は、次の多項式に適合するのに十分なデータを提供します。

ここで X 従属変数です。 β ₀ 切片です。 β ₁ 、β ₂ 、β ₃ 、およびβ ₄ は独立変数 A の係数です 、 B 、 C 、および D それぞれ。 β ₁₂ 、β ₁₃ 、β ₁₄ 、β ₂₃ 、β ₂₄ 、およびβ ₃₄ それぞれの相互作用（つまり、AB、AC、AD、BC、BD、およびCD）です。実験結果は、Design-Expert®ソフトウェアバージョン6.0.10（Stat-Ease、Inc.、Minneapolis、MN、USA）によって分析され、続いて分散分析（ANOVA）によって、因子の重要性とそれらの相互作用が決定されました。 p の場合、統計分析は有意であると見なされました。 値は<0.05でした。

最終的な処方は、望ましさ関数アプローチに基づいて選択されました。望ましさ関数は、すべての応答を1つの変数に結合して、調査対象の因子の最適レベルを予測します。したがって、最小の粒子サイズ（PS）と多分散度指数（PDI）、および最大のゼータ電位（ZP）とパーセント捕捉効率（％EE）の値を持つ最適化された製剤を選択することが望ましいと判断されました。望ましさ関数は、すべての応答を共通のスケール（0、1）に変換し、それらを幾何平均で組み合わせて、全体的なメトリックを最適化します。望ましさの値1は応答の許容値（最も望ましい値）を示し、望ましさの値0は許容できない値を示します。

粒子サイズ、多分散度指数、およびゼータ電位の測定

調製されたナノ粒子のPSおよびPDIは、光子相関分光計（Zetasizer 1000HS / 3000HS、Malvern Instrument、Malvern、UK）を使用して測定されました。 ZPは、ゼータ電位アナライザー（Zetasizer nanoシリーズ、Nano Z-redバッジ、Malvern Instrument、Malvern、UK）を使用して決定されました。すべてのサンプルは、ろ過された蒸留水（0.45μmナイロンフィルター）を使用して希釈され、測定は3回行われました。

捕捉効率のパーセントの決定

遊離ベラパミル-デキストラン複合体とHVD-NLCを含む調製サンプルを、Sephadex®G25を使用したミニカラム遠心分離法で分離しました。 1 mLのサンプルをカラムの上部に置き、2000rpmで2分間遠心分離しました。 HVD-NLCを含む溶離液を収集し、凍結乾燥機（Labconco、Free Zone Freeze Dry Systems、米国カンザスシティ）を使用して凍結乾燥しました。

凍結乾燥したHVD-NLC（10 mg）をクロロホルムに溶解し、40°Cの窒素ガス下で蒸発させました。次に、乾燥したサンプルを1 mLの蒸留水に溶解し、2分間ボルテックスし、12,000 rpmで5分間遠心分離しました（Eppendorf、ドイツ）。上澄みを収集し、検証済みの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法を使用してベラパミルの量を測定しました。 ％EEは、次の式を使用して計算されました。

ベラパミルの定量のためのHPLC分析は、LC 20ADデリバリーポンプ（京都、日本）とPhenomenex C18カラム（250×4.6 mm）を備えた島津クロマトグラフィーシステムを使用して実行されました。移動相は、20 mMの酢酸アンモニウムとアセトニトリルで構成され、比率は40:60（ v ）でした。 / v ）。移動相のpHは氷酢酸でpH6.5に調整しました。注入量は20µL、ベラパミルの検出波長は278 nm、流量は1.5 mL / minに固定しました。

凍結乾燥研究

凍結乾燥は、Labconco、FreeZone Freeze Dry Systems（米国カンザスシティ）を使用して、-40°Cで24時間行いました。 HVD-NLCの凍結乾燥に適した凍結防止剤を選択するために、脂質：凍結防止剤の比率が1：1のマンニトール、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロースを含む5種類の一般的に使用される糖をスクリーニングしました。蒸留水中で再構成した後、凍結乾燥製剤の平均PSおよびPDIが最も低くなる凍結防止剤を、さらなる研究のために選択しました。

次の研究では、HVD-NLC製剤を、2つの方法を使用して選択した凍結防止剤と混合しました。最初の方法では、HVD-NLC製剤の調製後に凍結防止剤を添加し、「均質化プロセス後」と名付けました。 2番目の方法では、HVD-NLC製剤の調製中に凍結防止剤が添加され、「均質化プロセス中」と名付けられました。最初の方法では、1：1、1：2、1：4、1：6、および1：8のいくつかの脂質と凍結防止剤の比率を調製し、凍結乾燥しました。凍結乾燥したHVD-NLC製剤を、ろ過した蒸留水（0.45μmナイロンフィルター）に再分散させ、サンプルの平均PS、PDI、および％EEを評価しました。 PSとPDIが最も低く、％EEが最も高い脂質：凍結防止剤の比率が、2番目の混合方法でのさらなる研究のために選択されました。

インビトロリリース研究

NLCからのベラパミルのinvitro放出研究は、模擬腸液（pH 6.8）または模擬胃液（pH 1.2）培地に配置された透析バッグを使用して実施されました。この研究では、2 mLのHVD-NLC分散液を透析バッグに充填しました（12,000 Da MWカットオフ）。バッグを密封してから、150mLの予熱した放出媒体に浸しました。放出研究は、100rpmの攪拌速度と37°Cに設定されたホットプレートマグネチックスターラーで実施されました。 0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、および72時間のスケジュールされた時間間隔で、1 mLのサンプルを取り出し、同量の新鮮な培地と交換しました。放出されたベラパミル濃度は、HPLCによって決定されました。

示差走査熱量測定

示差走査熱量測定（DSC）分析は、Perkin-Elmer Pyris 6 DSC（Perkin-Elmer、Beaconsfield、UK）を使用して実行されました。サンプルをアルミニウムパンに量り取り（5〜7 mg）、標準のサンプルパンクリンパープレス（Perkin-Elmer、ビーコンズフィールド、英国）を使用して密封しました。 DSC曲線は、0〜260°Cで10°C /分の速度で記録されました。

広角X線散乱

広角X線散乱（WAXS）θ/2θ分析は、CUKα放射線を適用するPANalytical X’Pert PRO MRD PW3040（Almelo、オランダ）を使用して室温で実行されました。サンプルは、2〜60°Cの温度範囲で5°C /分のスキャン速度で実行されました。

透過型電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡

ＨＶＤ－ＮＬＣの形態（すなわち、形状およびサイズ）は、（フィリップスＣＭ１２、アイントホーフェン、オランダ）を使用する透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察された。希釈したHVD-NLC分散液を400メッシュの銅グリッドに滴下した後、2％リンタングステン酸でネガティブ染色しました。準備したサンプルは、TEM検査の前に風乾しました。

凍結乾燥したHVD-NLCの形態を、走査型電子顕微鏡（SEM）（Leo Supra 50 VP電界放出SEM、ドイツ、オーバーコッヘン）を使用して観察しました。凍結乾燥したHVD-NLCサンプルをアルミニウムのスタブに固定し、15 mAで15分間、スパッタリングデバイスで金（厚さ10 nm）でコーティングしました。サンプルは、加速電圧10kVのOxfordINCAエネルギー分散型X線微量分析システムを使用して視覚化されました。

HVD-NLCのセルラー取り込み

HVD-NLC製剤からのベラパミルのinvitro細胞取り込み研究は、Caco-2細胞株を使用して調査されました。細胞は、T-25組織培養フラスコ内で1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液と10％FBSを添加したDMEM増殖培地で培養しました。次に、Caco-2細胞を収集し、48ウェルプレートに播種しました。細胞がコンフルエントになり、ウェルプレートの底に単層が形成されるまで、DMEM完全培地を使用してウェルあたり60,000細胞密度で播種しました。同じ濃度のベラパミルを含むいくつかの溶液は、HVD-NLC、ベラパミル溶液、およびベラパミル-デキストラン複合体をDMEM培地のみで希釈することによって調製されました。ベラパミル溶液およびベラパミル-デキストラン複合体を対照として使用した。続いて、48ウェルプレートのCaco-2細胞単層のDMEM完全培地を、HVD-NLC、ベラパミル溶液、およびベラパミル-デキストラン複合体のさまざまな希釈液と交換し、37°C​​で6時間インキュベートしました。インキュベーション期間の完了後、HVD-NLC、ベラパミル溶液、およびベラパミル-デキストラン複合体サンプルをウェルから取り出しました。試験サンプルの残留物および死細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄することにより単層から除去された。各サンプルウェルにパッシブ溶解バッファー（200μL）を加えることにより、単層の細胞を溶解しました。サンプルをピペットで取り出し、12,000 rpmで10分間遠心分離して、細胞からベラパミルを抽出しました。上清を収集し、HPLCを使用してベラパミル濃度を定量しました。

短期安定性調査

最適化されたHVD-NLC製剤の短期安定性研究は、医薬品規制調和国際会議（ICH）ガイドラインQ1A（R2）に従って実施されました。新たに調製した凍結乾燥HVD-NLC製剤（VER-9）を、3つの異なる条件（5±3°C、25±2°C / 60±5％相対湿度（RH）、および40±2°C / 75）に配置しました。 ±5％RH）、6か月間。最適化されたHVD-NLC製剤の安定性は、PS、PDI、ZP、および0、1、3、6か月の総薬物含有量を測定することによって調べられました。

統計分析

結果は、一元配置分散分析（ANOVA）を使用して分析され、その後、事後のテューキー-HSDが続きました。統計分析は、IBM®SPSS®Statisticalソフトウェア（バージョン22、ニューヨーク、米国）を使用して実行されました。すべての値は、平均および標準偏差（平均±SD）として表されました。 p の場合、差は統計的に有意でした <0.05。

結果と考察

2 ⁴ を使用した分析 完全な階乗設計

選択された独立変数の値、すなわち、均質化時間（A）、固体脂質濃度（B）、液体脂質濃度（C）、および界面活性剤濃度（D）、および選択された応答の得られた結果、すなわち、PS、PDI 、ZP、および％EEを表2に示します。各独立変数とそれらの相互作用は、ANOVAを使用して統計的に評価されました。各従属変数の多項式係数は、式に示すように、各独立変数の効果を定量化するためにDesign-Expert®ソフトウェアによって生成されました。 3、4、5、および6。方程式は、重要な要因とそれらの相互作用のみを表しています。

ここで A は均質化時間（分）、 B は固形脂質濃度（mg）、 C は液体脂質濃度（mg）であり、 D は界面活性剤濃度（mg）です。方程式の各因子または相互作用因子の前の正と負の符号は、それぞれ相乗効果または拮抗効果のいずれかを表しています。応答曲面プロットは、応答パラメーターに対する各因子または因子の交互作用の同時効果を観察するために生成されました。

平均粒子サイズに対する変数の影響

式に示すように。 3、要因 A 、 C 、および D 粒子サイズ（PS）に拮抗作用があります。均質化時間を長くすると結論付けることができます（係数 A ）は、同時にNLCのPSの大幅な低下と関連しています（ p <0.05）。これはおそらく、脂質小球をより小さな粒子に効率的に分解する均質化の高い剪断力によるものです。同様に、液体脂質濃度を上げる（ C ）は、NLCのPSを同時に低下させることがわかりました。これは、オレイン酸がシステムの粘度を低下させる能力と、Compritol888ATO®と組み合わせた場合の表面張力に起因する可能性があります。これにより、NLCの粒子サイズが小さくなります。固体脂質と組み合わせたときにシステムの粘度を低下させる液体脂質の能力は、Jenningらによっても報告されました。彼らがSLN分散液を準備したとき[5]。著者らは、脂質マトリックス組成物の液体脂質濃度を0から38％に増やすと、粒子サイズが小さくなることを観察しました。さらに、界面活性剤濃度を上げる（ D ）システムに存在する界面活性剤の量が多いと、製剤中の総脂質含有量が容易に乳化され、より小さなナノ粒子が形成されるため、PSが低下します。

図2は、重要な（ p <0.05）NLCのPSに対する因子（AC、BD、およびCD）の相互作用の影響。因子（BD）の正の影響、および因子（ACとCDの相互作用）の負の影響は、NLCの粒子サイズに有意な影響を示しました。因子（AC）の悪影響は、均質化時間が長くなり、液体脂質濃度が高くなると、PSが低下することを示しています。 NLC製剤中の高濃度の固体脂質と界面活性剤の間の相互作用（BD相互作用）は、粒子サイズに有意な正の影響を示し、その結果、粒子サイズが大きくなりました。対照的に、高濃度の液体脂質と界面活性剤の間の相互作用（CD相互作用）は、より小さなサイズが生成された粒子サイズに重大な悪影響を示しました。

重要性を表す応答曲面プロット（ p <0.05）均質化時間、液体脂質濃度、界面活性剤濃度、および a 間の相互作用の影響 AC、 b BD、および c HVD-NLCのPSのCD。 A 均質化時間、 B 固体脂質、 C 液体脂質、 D 界面活性剤

PDIに対する変数の影響

式に示されているように。 4、オレイン酸はPDIに悪影響を与えることが示されています。これは、オレイン酸濃度を上げるとPDI値が下がり、NLC粒子の分布が良くなることを意味します。 NLCに対するオレイン酸の同様の効果は、いくつかの研究でも観察されました[6]。図3は、均質化時間と液体脂質濃度の相互作用（AC相互作用）を示しています。この相互作用は、PDIに重大な悪影響を及ぼしました。これは、均質化時間が長くなり、液体脂質濃度が高くなると、PDI値が低下することを意味します。さらに、液体脂質と界面活性剤濃度の間の相互作用（CD相互作用）は、PDI値に対して相乗効果を示しました。したがって、液体脂質と界面活性剤の濃度を同時に増加させると、PDI値が増加し、均質性の低いHVD-NLC粒子が生成されます。これは、最適化された値を超えて界面活性剤濃度がさらに増加すると、ナノ粒子の外面に界面活性剤が蓄積し、PDI値が増加する可能性があるためである可能性があります。同じパターンがShammaet al。によっても観察され、界面活性剤濃度を上げるとNLCのPDI値が増加しました[7]。

重要な（ p ）を表す応答曲面プロット <0.05）液体脂質濃度の影響と a 間の相互作用 ACおよび b HVD-NLCのPDIのCD。 A 均質化時間、 C 液体脂質、 D 界面活性剤

ZPに対する変数の影響

HVD-NLC製剤は、ベヘン酸グリセリル（Compritol888ATO®の脂肪酸）、オレイン酸、および硫酸デキストラン残留物のイオン化により負電荷を帯びていました。式に基づく。 5、オレイン酸の量を増やすとナノ粒子に悪影響があり、ナノ粒子の負電荷が増加するため、HVD-NLCのZPが増加します。これは、オレイン酸（液体脂質）中の豊富なカルボン酸基の過剰なイオン化が原因である可能性があります[8]。さらに、ベヘン酸グリセリル（固体脂質）もZP値に悪影響を及ぼし、その濃度を上げるとナノ粒子のZPが増加します。これは、ベヘン酸グリセリル中のカルボン酸のイオン化が高く、ナノ粒子の外面で負電荷が高くなるためです。

BDの相互作用はNLCのZPに有意な正の効果をもたらしましたが、CDの相互作用は負の効果を示しました（図4）。固体脂質の濃度を上げ、界面活性剤の濃度を下げると、ナノ粒子の負電荷が減少し、ZP値が減少します。おそらく、この段階では、界面活性剤の濃度が低いと、固体脂質の総量をイオン化できず、ナノ粒子表面の負電荷が減少し、HVD-NLCのZPが減少します。さらに、液体脂質と界面活性剤の濃度（CD相互作用）を同時に増加させると、HVD-NLCのZP値が大幅に増加します。これは、製剤中の界面活性剤濃度が高いと、より多くのカルボン酸がイオン化されるためです。

重要な（ p ）を表す応答曲面プロット <0.05）液体脂質濃度、界面活性剤濃度、および a 間の相互作用の影響 BDと b HVD-NLCのZPのCD。 B 固体脂質、 C 液体脂質、 D 界面活性剤

％EEに対する変数の影響

式6は、均質化時間を大幅に長くすると（ p <0.05）薬剤の％EEを減らします。均質化時間が長くなると、ナノ粒子の外面に付着した薬物分子が剥がれたり剥がれたりする可能性があり、その結果、HVD-NLCでの薬物の％EEが低下します。対照的に、界面活性剤濃度を上げると、HVD-NLC中の薬物の％EEが高くなりました。これは、界面活性剤の濃度が高くなると、薬物の一部がその中に閉じ込められるNLCの外表面コーティングが増加するためである可能性があります。 Zhuang etal。およびDasetal。脂質格子内およびナノ粒子の外面での薬物分子の可溶化には、適切な濃度の界面活性剤が不可欠であることが示唆されました[9、10]。

図5に示すように、ADの相互作用には有意な（ p <0.05）負の影響。これにより、均質化時間を長くし、界面活性剤の量を減らすと、HVD-NLCの薬物の％EEが低下します。対照的に、固体脂質と界面活性剤濃度の間の相互作用（BD相互作用）は、薬物の％EEに対して正の効果を示しました。したがって、固体脂質と界面活性剤の濃度を上げると、HVD-NLC中の薬物の％EEが増加します。これはおそらく、過剰な薬物分子を可溶化する界面活性剤濃度が高いためであり、同時に、システム内の固体脂質の存在量が多いため、過剰な薬物分子に対応しているため、HVD内の薬物の％EEが増加します- NLC。

重要な（ p ）を表す応答曲面プロット <0.05）均質化時間、液体脂質濃度、界面活性剤濃度、および a 間の相互作用の影響 ADと b HVD-NLCにおけるベラパミルのEEのBD。 A 均質化時間、 B 固体脂質、 D 界面活性剤

望ましさ関数を使用した最適化されたHVD-NLCの選択

コード番号VER-9、VER-11、VER-13、およびVER-15のHVD-NLC配合では、それぞれ0.863、0.852、0.811、および0.840という高い望ましさの値がありました。これらの製剤は、望ましさの値が1に近いため、さらなる研究のために選択されました。選択した製剤のすべての応答の個別および組み合わせた望ましさの関数を図6に示します。これらの平均PS、PDI、ZP、および％EE製剤は、173.46±0.757〜190.3±8.22、0.451±0.033〜0.501±0.019、− 46.73±1.13〜− 49.16±1.55、および93.95±の範囲でした。

選択したHVD-NLC製剤でのいくつかの応答の個々のおよび組み合わせた望ましさを示す棒グラフ。 a VER-9、 b VER-11、 c VER-13、および d VER-15

凍結乾燥研究

凍結乾燥は、貯蔵中のナノ粒子の物理的および化学的安定性を延長するために、水性製剤を乾燥形態に変えるために製薬分野で一般的に使用される方法の1つです[11、12]。ただし、凍結乾燥ステップでは、プロセス中にサンプルにさまざまな応力が発生します。したがって、ストレス状態を回避し、サンプルを保護するには、凍結防止剤の必要性が不可欠です。スクリーニングされた凍結防止剤の中で、トレハロースは、凍結乾燥プロセス後の凝集からHVD-NLC製剤を保護するために最も適切なものであることが見出された。トレハロースで保護されたHVD-NLC製剤は、最小の粒子サイズと最小のPDIを示しました（表3）。トレハロースは、化学的相互作用が少なく、ガラス転移温度が高いなど、他の凍結防止剤に比べて多くの利点があり、ナノ粒子の安定性を延長するのに役立ちます。さらに、トレハロースは、脂質ベースのナノ粒子中のCompritol888ATO®（ベヘン酸グリセリル）の凍結乾燥のための効率的な凍結防止剤として実証されています[13、14]。したがって、本研究では、トレハロースがHVD-NLC製剤の凍結防止剤として選択されました。

次の研究では、均質化プロセス後または均質化プロセス中に、さまざまな比率のトレハロースがHVD-NLC製剤で使用されました。表4は、均質化後に製剤に添加されたトレハロースのさまざまな比率がPS、PDI、および％EEに及ぼす影響を示しています。

平均PSはナノサイズの範囲で見つかりましたが、PDIは、研究で使用された脂質とトレハロースのすべての比率で<1でした。ただし、ベラパミルの％EEは、脂質に対するトレハロースの比率が増加するにつれて大幅に減少しました。 1：1の比率での脂質：トレハロースの％EEは、> 1：1の脂質：トレハロース比よりも有意に高かった。脂質トレハロース比1：1を超えてトレハロースの量を増やすと、ベラパミル-デキストラン硫酸複合体からのベラパミルの除去が強化されました。これはおそらく、ナノ粒子の外表面でのトレハロースとデキストランの間の相互作用によるものであり、ベラパミル-デキストラン硫酸複合体からのベラパミルの置換を促進し、したがって、HVD-NLCの薬物の％EEを低下させます。トレハロースとデキストランの相互作用は、糖塩複合体（トレハロース-デキストラン複合体）の形成により起こり、トレハロース（糖）はカチオン性ベラパミルと競合し、ポリアニオン性デキストランと複合体を形成します[15]。ミラー等。ホウ酸を用いたトレハロースの粘度とガラス転移温度を測定し、トレハロースとホウ酸イオン（B（OH） ₄ ）間の化学複合体の形成を提案しました。 ⁻ ）[15]。したがって、得られた結果に基づいて、1：1および1：2の脂質対トレハロース比を、均質化中のトレハロース添加の次の研究のために選択した。表5は、均質化中にトレハロースを添加した場合、PS、PDI、および％EEの結果が大幅に向上したことを示しています。これは、均質化プロセスによるHVD-NLC製剤でのトレハロースのより良い混合が原因である可能性があります。データから、脂質：トレハロースの比率が1：1と1：2の％EEに有意差がなかったことが明らかです。したがって、脂質：トレハロース比が1：1の製剤VER-9およびVER-11が、さらなる研究のために選択されました。

HVD-NLCのinvitroリリース

SGFおよびSIFで選択したHVD-NLC製剤（VER-9およびVER-11）からのベラパミル溶液の放出プロファイルを図7に示します。VER-9およびVER-11製剤からのベラパミルの放出プロファイルは有意でした。 SGFおよびSIFメディアの両方でベラパミル溶液よりも長い。ベラパミルは、HVD-NLC製剤に硫酸デキストランとのイオン複合体としてロードされました。これが、HVD-NLCSからのベラパミルの持続放出の理由である可能性があります。製剤は48時間後にベラパミルの約85％を放出し、薬物は72時間までの持続放出プロファイルを示しました。一方、ベラパミル溶液は4時間以内にベラパミルの約99％を放出しました。選択した製剤VER-9およびVER-11の放出プロファイルは、SGFおよびSIF放出媒体でほぼ類似していることがわかりました。ただし、VER-9からのベラパミルの放出はSGF放出媒体のVER-11と比較してわずかに良好であることがわかりました。 VER-9からの72時間でのベラパミルの累積放出率（95.91±1.40）は、SGF培地のVER-11（90.67±1.16）と比較して有意に高いことがわかりました。そのため、最終的な処方としてVER-9が選択され、さらなる調査が行われました。

a で放出されたベラパミルの累積パーセンテージ SIF（pH 6.8）および b SGF（pH 1.2）放出媒体を72時間

DSC調査

ベラパミル、デキストラン硫酸、コンプリトール888ATO®、ポロキサマー188、トレハロース、物理的混合物（コンプリトール888ATO®、ポロキサマー188、トレハロース、ベラパミル、およびデキストラン硫酸を含む）、凍結乾燥ブランク製剤（プラセボ）、および凍結乾燥HVDのDSC分析-NLC製剤（VER-9）を図8に示します。ベラパミル、デキストラン硫酸、Compritol888ATO®、ポロキサマー188、およびトレハロースの融解ピークは、144.96°C、220.41°C、72.46°C、50.80°Cでした。 、および100.13°C、それぞれ。サーモグラムは、Compritol888ATO®、ポロキサマー188、トレハロース、ベラパミルなどの個々のピーク成分と比較した場合、物理的混合物、凍結乾燥ブランク製剤、およびHVD-NLC製剤（VER-9）のピークに有意なシフトがないことを示しました。 、およびデキストラン硫酸。これは、コンポーネント間の物理的な互換性を示しています。 144.96°Cでのベラパミルの吸熱ピークは、HVD-NLC製剤（VER-9）のサーモグラムでは見られなくなりました（図8f）。これは、HVD-に組み込まれたときにアモルファス形態に変化したベラパミルが原因である可能性があります。 NLCマトリックス[16]。

a のDSCサーモグラム Compritol 888 ATO、 b Polomxamer 188、 c ベラパミル塩酸塩、 d デキストラン硫酸、 e トレハロース、 f ベラパミルHClとデキストラン硫酸塩の物理的混合物、 g 物理的混合物（コンプリトール888 ATO、ポロキサマー188、トレハロース、ベラパミル、およびデキストラン硫酸を含む）、 h プラセボ、および i HVD-NLCの定式化（VER-9）

WAXS調査

純粋なベラパミル、デキストラン硫酸、バルクCompritol888ATO®、トレハロース、凍結乾燥ブランク製剤（Compritol888ATO®、オレイン酸、ポロキサマー188、Tween80®、トレハロース、およびデキストラン硫酸を含む）、および凍結乾燥HVDのWAXS /2θスキャン-NLC製剤（VER-9）を図9に示します。純粋なベラパミルの回折ピークは、2θ散乱角14.42°、16.67°、17.07°、18.07°、18.82°、20.22°、 23.77°、および26.27°[17]。ただし、HVD-NLC製剤（VER-9）のWAXS /2θスキャンでは、ベラパミルのピークが減少し、HVD-NLCの脂質に組み込まれた場合に薬物の結晶化度が低下することが示されました。スキャンはまた、2θ散乱角12.47°、15.17°、16.87°、21.07°、および23.82°に優勢なピークを示しました。これは、Compritol888ATO®およびトレハロースの結晶構造に起因する可能性があります。純粋なベラパミルのピーク[10]。結果は、ベラパミルがHVD-NLC製剤に組み込まれたときにアモルファス形態であることを示唆しました。 Compritol888ATO®は、加熱すると多形結晶変態を示し、それによってより安定した形に変化し、HVD-NLCおよびブランク製剤で21.1°および23.3°に強度ピークの低下を示しました。純粋なデキストラン硫酸のWAXSパターンは、そのアモルファス形態を示していました。

a のX線パターン 凍結乾燥HVD-NLC製剤（VER-9）、 b 凍結乾燥ブランク製剤、 c トレハロース、 d デキストラン硫酸、 e ベラパミルHCl、および f Compritol 888 ATO

電子顕微鏡検査

HVD-NLC製剤（VER-9）の粒子形状とサイズを電子顕微鏡を使用して調べました。透過型電子顕微鏡（TEM）で観察されたHVD-NLC製剤（VER-9）の液体調製物は、粒子が200 nm未満のサイズの球形をしていることを示しました（図10）。対照的に、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）下での観察は、トレハロースなしで製剤を凍結乾燥した後、ナノ粒子がもはや球形を有さないことを明らかにした。ただし、トレハロースをHVD-NLC製剤（VER-9）に組み込んだ場合、トレハロースの凍結保護効果が見られました。 SEM画像は、凍結防止剤を含まない凍結​​乾燥製剤と比較した場合、トレハロースがナノ粒子の構造をその程度まで保護するのに役立つことを示しました（図11）。

凍結乾燥前のVER-9のTEM画像

VER-9製剤のSEM画像 a トレハロースなし; b トレハロースを含む

HVD-NLCの細胞取り込み研究

Caco-2細胞は、薬物の腸内細胞取り込みを研究するために広く使用されてきました[18]。 Caco-2細胞株は自発的に分化して単層を形成し、腸上皮と形態学的および生物学的に有意に類似しています[19]。数人の研究者が、CompritolATO888®[20]、オレイン酸[21、22]、Tween80®[23、24]、およびポロキサマー188 [25]のinvitro細胞毒性研究を報告しています。これらの物質は、HVD-NLC（VER-9）の最適化された製剤の賦形剤として使用されました。それらの発見に基づいて、これらの賦形剤は、本研究で使用された使用濃度、細胞株タイプ、および細胞密度内で安全でした。細胞取り込み研究で使用されたVER-9、ベラパミル溶液、およびベラパミル-デキストラン複合体のサンプル中のベラパミルの濃度は、10.03μg/200μLから30.1μg/200μLの範囲でした。ベラパミルの細胞取り込みは、サンプル中のベラパミル濃度の増加とともに増加することが見出された。 VER-9、ベラパミル溶液、およびベラパミル-デキストラン複合体からのベラパミルの細胞取り込み値は、6.45±2.62から15.92±4.78μg、0.89±0.28から1.46±0.119±0.65μg、および0.064±0.1に増加しました。それぞれ（図12）。 VER-9製剤からのベラパミル細胞取り込みは、ベラパミル溶液およびベラパミル-デキストラン複合体よりもそれぞれ10.90倍および134.91倍高かった。結果は、ベラパミルが、caco2細胞内のHVD-NLC、ベラパミル溶液、およびベラパミル-デキストラン複合体から受動的に輸送されたことを示した。脂質ベースのナノ製剤からの薬物のより高い細胞取り込みの同様の発見が報告されました[26]。

HVD-NLC（VER-9）、ベラパミル溶液、およびベラパミル-デキストラン複合体（平均±SD、 n ）の細胞取り込みを示すCaco-2細胞株のinvitroモデル =3）

Caco-2細胞は、脂肪酸によって刺激されると、動物の細胞と同じように機能します。 van Greevenbroek etal。長鎖不飽和脂肪酸（オレイン酸やリノール酸など）をCaco-2細胞に組み込むと、超低密度リポタンパク質（VLDL）とカイロミクロンの分泌が刺激されることが示唆されました。対照的に、飽和脂肪酸の投与は、主に中間密度および低密度リポタンパク質（IDLおよびLDL）を分泌します[27]。長鎖脂肪酸によるカイロミクロン分泌の増加に関する同様の所見は、Caliphetal。によっても報告されました。動物モデルで[28]。今回の調査では、HVD-NLCの調製に使用される長鎖脂肪酸（Compritol888ATO®およびオレイン酸）もカイロミクロンの分泌を刺激し、モデル薬物の細胞への取り込みを増加させる可能性があります。

安定性調査

凍結乾燥されたVER-9製剤は、冷蔵条件（5±3°C）で6か月間安定していることがわかりました（表6）。 5±3°Cの保管温度で6か月の安定性試験を行った後、PS、PDI、ZP、および％EEに有意差はありませんでした。ただし、VER-9製剤は、25±2°C / 60±5％RHおよび40±2°C / 75±5％RHの温度で1か月間保管した後は安定していませんでした。 PSとPDIは大幅に増加しましたが、総薬物含有量は大幅に減少しました。 1か月の安定性研究の後、ナノ粒子の凝集と粘着性のある挙動のため、サンプルは測定できませんでした。

結論

凍結乾燥したHVD-NLC製剤の開発と最適化に成功しました。脂質担体は、HVD-NLC製剤からのベラパミルの放出を延長しました。製剤はナノサイズの範囲であり、5±3°Cで6か月間安定していました。ベラパミル脂質製剤（NLC）の細胞への取り込みは、非脂質製剤よりも高いことがわかりました。これは、ベラパミルの脂質担体としてのNLCが、薬物の吸収を改善する上で重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。

略語

％EE：

捕捉効率のパーセンテージ

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

DSC：

示差走査熱量測定

FBS：

ウシ胎児血清

HVD-NLC：

ハイブリッドベラパミル-デキストランナノ構造脂質担体

ICH：

人間のための医薬品の技術的要件の調和のための国際評議会

IDL：

中間密度リポタンパク質

LDL：

低密度リポタンパク質

NLC：

ナノ構造脂質担体

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

PDI：

多分散度指数

PS：

粒子サイズ

RH：

相対湿度

SEM：

走査型電子顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡

VLDL：

超低密度リポタンパク質

WAXS：

広角X線散乱

ZP：

ゼータ電位