抗体機能化シリカコート金ナノロッドによるクリプトコッカス・ネオフォルマンスの迅速診断と光熱治療

概要

背景

クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）は被膜酵母菌である。臨床現場では、C. neoformans感染の早期段階における迅速かつ効果的な診断や治療法はほとんど存在しない。抗体共役シリカ修飾金ナノロッド（GNR-SiO₂-Ab）はC. neoformansを選択的に結合できる。これはクリプトコッカス症の安全かつ効果的な治療の可能性を提供する。

方法

金ナノロッド（GNR）を種媒介テンプレート法で合成。抗C. neoformans抗体をシランカップリング剤でGNR表面に共有結合固定化。インビトロCT撮像でGNR-SiO₂-Abの診断効果を検証。細胞生存率評価で、近赤外（NIR）レーザー光との併用によるGNR-SiO₂-Abの光熱療法効果を確認。

結果

GNR-SiO₂-Abは陽性X線/CT撮像造影剤としての潜在的応用を持つ。抗体がC. neoformans細胞表面に結合することでGNRの凝集を大幅に誘導し、これまでにない高い減衰値を実現。照射後、C. neoformans細胞は光熱ダメージを受け、正常細胞構造が破壊された。未処理細胞と比較して細胞生存率が有意に低下。

結論

抗体共役シリカ修飾金ナノロッドがCT画像におけるC. neoformans細胞のX線減衰を増強することを確認。抗体で媒介される免疫GNRが、C. neoformans細胞におけるNIR誘起光熱療法の効果を増大させることが分かった。

背景

クリプトコッカス・ネオフォルマンスは被膜酵母菌で、1894年にBusseによって初めて記載された[1]。被膜酵母菌Cryptococcus neoformansの感染は気道の無害な定着をもたらす可能性があるが、髄膜炎や播種性疾患を引き起こすこともあり[2]、特に細胞性免疫不全の患者で問題となる。クリプトコッカス症は重度のHIV感染患者における主要な生命脅威真菌感染症であり、臓器移植、網内系悪性腫瘍、コルチコステロイド治療、サルコイドーシスでも合併することがある[3]。HIV関連クリプトコッカス髄膜炎は年間世界で60万人以上の死亡原因となっている[4]。クリプトコッカス髄膜炎と播種性疾患は必ずしも致死的である。1995年、SpeedとDuntはアンホテリシンBとフルシトシン併用治療患者で14%の死亡率を報告[5]。疑い患者のワークアップは真菌培養に依存していた。しかし、C. neoformans感染の早期段階における迅速かつ効果的な診断・治療法はほとんどない。さらに、ほとんどのクリプトコッカス感染患者が早期の適切な治療を受けられず、高い死亡率につながっている。

全画像技術の中で、X線CTは可用性、効率、コストの面で病院で最も有用な診断ツールの一つである[6]。CTは解剖学的パターンを特定し、腫瘍の位置、大きさ、広がりなどの補完的解剖学的情報を内因性コントラストで提供できる[7]。肺クリプトコッカス症の一般的所見は、単発または多発の肺結節・腫瘤、空洞化、実質異常であり、これらはCT画像で明確に検出可能[8]。放射線撮像では、クリプトコッカス髄膜炎の典型的所見として、拡大したVirchow-Robin腔、髄膜増強、著明な脈絡裂、海馬傍嚢胞が知られる[9]。しかし、早期クリプトコッカス症は放射線画像で検出できない。つまり、早期段階での迅速治療ができない。最近、金ナノ材料の表面形状/形態制御の進歩により、局在表面プラズモン共鳴をエンジニアリングする大きな能力が実証されている[10,11]。ここでは、選択的に真菌と結合できるナノスケール金材料である金ナノロッド（GNR）を調査した。臨床CT撮像ではヨウ素化化合物が最も一般的な造影剤だが、金の原子番号と電子密度はヨウ素よりはるかに高い。金は強いX線減衰を誘起し、理想的なCT造影剤候補となる[7]。GNRを特定抗体と共役させることで、科学者は特定組織や病原体からの標的画像取得が潜在的に可能になる[12]。

アンホテリシンBは1960年代後半から展開されているクリプトコッカス症の主要治療薬[13]。しかし、臨床効果は限定的で、著しい腎毒性を示す[14]。現行薬の効力は毒性、薬剤耐性、不十分な作用範囲によって損なわれている[15,16]。したがって、クリプトコッカス症の新たな選択的治療法の考案が必要。最近、光熱治療ががん細胞、ウイルス、細菌の標的破壊に広く用いられている[17-19]。従来治療とは全く異なるメカニズム。近赤外（NIR）レーザー光は、特定組織や物質に特異的に吸収される理想的な光熱治療法で、正常組織への最小限のダメージで効果的に組織を透過する[20]。GNRはNIR領域（650-900 nm）で光を吸収し、吸収光エネルギーを熱エネルギーに変換。この原理に基づき、NIRレーザー光とGNRの組み合わせが治療に理想的。古典的光増感剤と比較し、GNRは高吸収断面積、高溶解性、優れた生体適合性、低毒性、優れた光安定性、標的分子との容易な共役など利点を持つ[21]。GNRを光熱治療に用いた複数報告あり[22-24]。CarpinはHER2遺伝子過剰発現乳がん細胞を抗HER2共役シリカ-金ナノシェルでインキュベートし、808 nm NIR照射で対照群比較で細胞破壊を実証[17]。Wangは抗体共役GNRがNIR照射暴露時に病原性サルモネラ菌を選択的標的破壊し、細胞生存率有意低下を報告[19]。

本研究では、抗体共役シリカ修飾金ナノロッドを用いてC. neoformans細胞に特異的に結合。さらに、複合体と結合した細胞をCT画像で容易に識別可能。これらの金ナノ粒子は免疫共役によりC. neoformans細胞と結合し、光熱溶解で細胞生存率を有意に低下させた。本研究は、C. neoformansの診断と光熱療法の全く新しい選択肢をインビトロで確立し、クリプトコッカス症の安全かつ効果的な治療の可能性を提供する。

方法

材料

抗C. neoformans抗体をメリディアンライフサイエンス社（米国メンフィス）から購入。クロロ金酸（HAuCl₄·3H₂O）をシグマ社（米国セントルイス）から入手。硝酸銀（AgNO₃）、テトラエチルオルシリケート（TEOS）、3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTS）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）、ホウ化ナトリウム（NaBH₄）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）、ポリ(スチレンスルホン酸ナトリウム)（PSS）、アスコルビン酸をJ&Kケミカル社（中国）から入手。全試薬を無精製で使用。脱イオン水（ミリポアMilli-Qグレード、抵抗率18.2 MΩ·cm）を全調製に使用。

抗体共役シリカ修飾金ナノロッドの合成

典型実験では、GNRを種媒介テンプレート法[25-27]で合成。抗体共役シリカ修飾金ナノロッド（GNR-SiO₂-Ab）作製の合成経路を図1に示す。GNR溶液25 mLを12000 rpmで15分遠心分離。上清（主にCTAB分子）を除去、沈殿を無水エタノール20 mL（28%アンモニア20 μLでpH 10調整）に再分散。超音波処理後、TEOS 5 mL（10 mM）添加、24時間激しく攪拌。シリカコートGNRを4000 rpmで30分遠心回収、水で3回、エタノールで2回洗浄。精製GNR-SiO₂試料を10 mLエタノールに再分散し次工程へ[28]。続いてAPTS 10 mL添加し混合溶液形成、60°Cで1時間還流反応。脱イオン水で5回洗浄、真空オーブンで60°C、3時間乾燥しGNR-SiO₂-NH₂を得る。さらに層別法でポリマー（PSS）をコートし、溶媒へのアクセス可能なアミノ基を提供[29]。これらのアミノ末端ナノロッドを、水溶性カルボジイミドであるEDC存在下で精製抗体のカルボキシル基と12-16時間反応させ、アミド結合形成を促進[30]。インキュベーション後、遠心分離でナノロッド-抗体複合体を精製、PBSに再分散[31]。

GNR-SiO₂-Abの合成手順

GNR-SiO₂-Abの特性評価

GNRとGNR-SiO₂-Abのサイズと形態を透過電子顕微鏡（TEM、Tecnai G2 spirit Biotwin、FEI、米国、加速電圧120 kV）で評価[20]。UV-visスペクトルを20°CでUV-可視分光光度計（島津UV-2450、日本、10 mm石英セル、光路長1 cm）で測定。GNR、抗C. neoformans抗体、GNR-SiO₂-Abの吸収ピークを含む200-1000 nmを走査。GNR-SiO₂-Abを4°Cで2週と4週インキュベートし、同波長域を2時点走査。

GNR-SiO₂-Abのハウンズフィールド単位測定

0.04-4 mg/mL濃度範囲のGNR-SiO₂-Ab水溶液を、フィリップスBrilliance 64 CTスキャナー（フィリップスヘルスケア、オランダ・ベスト）で直接検出。CT撮像ソフトウェアから減衰値取得。

C. neoformansのGNR-SiO₂-Abへの付着

C. neoformans A型H99株を上海分子医学真菌学重点実験室（上海長征病院、第二軍医大学、中国）から入手。真菌をGNRと抗体-ナノロッド複合体と1時間インキュベート後、TEM解析用調製。TEM（Tecnai G2 spirit Biotwin、FEI、米国、120 kV）で撮像。

菌-抗体-ナノロッド複合体のインビトロCTスキャン

材料と真菌を3群に分割：真菌群（N）、GNR-SiO₂-Ab群（G）、GNR-SiO₂-Ab付着C. neoformans群（G+N）。GNR-SiO₂-Ab水溶液濃度は4 mg/mL。インビトロCT撮像用に、3群の溶液を1.5 mL無菌Eppendorfチューブに調製。全CTスキャンは上記CTシステムで実施。

インビトロ光熱療法効果

GNR-SiO₂-Abあり/なしでインキュベートしたC. neoformans細胞を、NIRレーザー（LWIRL 808、レーザーウェーブ社、中国）で5分間照射、波長808 nm、強度30 mW（4 W/cm²）。TEM（Tecnai G2 spirit Biotwin、FEI、米国、120 kV）で撮像。照射後、37°C暗所で2時間インキュベート。GNR-SiO₂-Abあり/なし細胞を対照群とする。細胞生存率をCellTiter-Glo®発光細胞生存率アッセイ（プロメガ社、米国ウィスコンシン）で製造元指示に従い測定[28]。このアッセイは均質法で、生存細胞数を決定可能。ルシフェラーゼ触媒によるルシフェリンとATPの反応で代謝活性細胞を合成。全実験を6回繰り返し、平均値を算出。

統計解析

全解析をSPSSバージョン13.0（SPSS Inc.、米国シカゴ）で実施。データを平均±SDで表示。P値<0.05を統計的有意とする。本稿の全図は3回以上の独立実験で同様の結果を得たもの。

結果

GNR-SiO₂-Abの合成と特性評価

TEOSをシリカ源、APTSをカップリング剤とするGNRシリカコート法が先行報告されている[30]。抗C. neoformans抗体との共役でGNRの形状・サイズは変化しない。図2にGNR-SiO₂-AbのTEM像示す。これらのナノ粒子は幅18.48±2.39 nm、長さ57.56±4.57 nm。

a, b GNR-SiO₂-AbのTEM像。ナノロッドはロッド状外観。抗C. neoformans抗体との共役でGNRの形状・サイズは変化せず

GNR-SiO₂-Abの分光特性と安定性

GNR-SiO₂-Abの光物理特性について、図3にGNR-SiO₂、GNR-SiO₂-Ab、抗C. neoformans抗体の吸収スペクトル示す。GNR-SiO₂スペクトルでは、弱い横表面プラズモン共鳴波長（TSPRW）520 nm付近、強い縦表面プラズモン共鳴波長（LSPRW）808 nm付近の2吸収バンド。抗体共役後、GNR-SiO₂-AbのTSPRWとLSPRWはそれぞれ540 nmと835 nm。抗体スペクトルとGNR-SiO₂-Abを比較すると、両者とも280 nm付近に同一特殊ピークを有し、抗C. neoformans抗体のGNR-SiO₂への成功共役を証明。4°Cで2週間インキュベーション後、TSPRWとLSPRWはそれぞれ540 nmと835 nmで同一、4週間後も同一データ。GNR-SiO₂-AbのTSPRWとLSPRWは4週間で変化せず、安定性を確認。

吸収スペクトル： GNR+SiO₂+Ab (A)、GNR+SiO₂ (B)、抗C. neoformans抗体 (C)。GNR-SiO₂は弱い横表面プラズモン共鳴波長（TSPRW）520 nm付近、強い縦表面プラズモン共鳴波長（LSPRW）808 nm付近の2吸収バンド。抗体共役後、GNR-SiO₂-AbのTSPRWとLSPRWは540と835 nm

GNR-SiO₂-Abのハウンズフィールド単位測定

臨床CTによるGNR-SiO₂-Abのハウンズフィールド単位（Hu）。図4に0.04-4 mg/mL範囲のGNR-SiO₂-Ab CT画像示す。GNR-SiO₂-Ab濃度増加に伴いCT信号強度連続増加。図3に示す通り、HuとGNR-SiO₂-Ab濃度の関係は良好な線形相関（R²=0.9903）、式 y = 12.52x + 11.971 で記述。これらの結果はGNR-SiO₂-Abが陽性X線/CT撮像造影剤として潜在的応用を持つことを示唆。

GNR-SiO₂-Abのハウンズフィールド単位。 a PBS懸濁GNR-SiO₂-AbのインビトロCT画像。各サンプルの濃度（mg/mL）を各画像上部に表示。 b 0.04-4 mg/mL範囲のGNR-SiO₂-Ab濃度別CT減衰プロット

C. neoformans細胞のGNR-SiO₂-Abへの付着

TEM像でC. neoformans細胞と菌-抗体-ナノロッド複合体の形態的特徴を示す。細胞直径2-20 μm。図5aに多糖カプセルに囲まれたC. neoformans細胞のTEM像、構造未結合時4-6 μm径。図5bに抗体-ナノロッド複合体インキュベーション後、大量凝集GNR-SiO₂-Abで覆われたC. neoformans細胞。GNR-SiO₂を真菌細胞とインキュベートし、GNR-SiO₂がC. neoformansに付着するか検証。結果、図5cのようにGNR-SiO₂は散在。本研究でC. neoformans細胞がGNR-SiO₂-Abと選択的に共役可能ことを示す。

GNR-SiO₂-AbとC. neoformans細胞の相互作用を示すTEM像。 a C. neoformans細胞TEM像。 b 菌-抗体-ナノロッド複合体TEM像。 c GNR-SiO₂インキュベートC. neoformans細胞TEM像

菌-抗体-ナノロッド複合体のインビトロCTスキャン

メーカー標準表示プログラム（フィリップスポータル、フィリップスヘルスケア、オランダ・ベスト）でCT信号強度の定量解析実施。図6に3群のX線減衰値示す。G+N群値がG群とN群より有意に高い。さらにG群値がN群より有意に高い。この結果は先行文献[31]の知見と一致。

a, b 異なる群のインビトロCTスキャン。G+N群値がG群とN群より有意に高い。さらにG群X線減衰値がN群より有意に高い

インビトロ光熱療法効果

CellTiter-Glo®発光細胞生存率測定装置で細胞生存率アッセイ実施評価。非照射細胞の生存率がNIR照射細胞より高い（P<0.05）。さらに、NIR照射後、真菌の生存率がGNR-SiO₂-Ab共役細胞より高い（P<0.05）。また、細胞生存率が菌-抗体-ナノロッド複合体より高い（P<0.05）。図7に異なる処理でのC. neoformans細胞生存率変動を明確に示す。照射後、C. neoformans細胞は光熱ダメージを受け、正常細胞構造が破壊。図8に示す通り、細胞は萎縮、不規則、崩壊した外観を示し、特徴的多糖カプセルが損傷。

異なる処理を受けた細胞の生存率。非照射細胞の生存率がNIR照射細胞より高い（P<0.05）。さらに、NIR照射後、真菌生存率がGNR-SiO₂-Ab共役細胞より高い（P<0.05）。また、細胞生存率が菌-抗体-ナノロッド複合体より高い（P<0.05）

a, b GNR-SiO₂-Ab共役C. neoformans細胞の光熱ダメージを示すTEM像。細胞は萎縮、不規則、崩壊した外観。特徴的多糖カプセルが損傷

議論

シリカはポリマーに対して多くの利点を持つ[32]。調製プロセスが非常に容易、シリカシェル厚を所望サイズと多孔性に調整可能。さらにシリカは極めて安定で生体適合性があり、pH変化による膨潤や多孔性変化がなく、微生物攻撃に脆弱でない。また、シラン化学と市販オルガノシラン試薬を用いた多様な官能基による表面修飾が容易で、バイオターゲティングに適する。シリカコートGNRはGNRの優れた光学特性を保持し、高エネルギー照射下での熱安定性を向上。本研究では、シリカコートと抗C. neoformans抗体共役後、GNRは周囲媒質屈折率上昇により表面プラズモン共鳴ピークのレッドシフトを示した[32,33]。結果は修飾・共役後に試料サイズが増大することも示し、抗C. neoformans抗体との金ナノ粒子共役成功を示唆。ただし、抗体結合後にGNR-SiO₂が細胞共役特殊能力を持つ可能性を除外できず、今後さらなる研究で検証予定。本研究では、単純な抗原-抗体反応でGNR-SiO₂-Abを細胞カプセルに付着させることに成功。さらに、複合体が細胞カプセル上の抗原を標的とすることを確認。

GNRは過去10年間で広範な注目を集めている。Hainfeldら[34]が最初にGNRをX線造影剤として使用可能と報告。GNRは条件付き造影剤であるヨウ素化分子に対して複数利点を持つ。高原子番号と電子密度により、GNRは比較的高いX線減衰係数を示す。金の原子番号と電子密度（79、19.32 g/cm³）はヨウ素（53、4.9 g/cm³）より高い[7]。ヨウ素造影剤は腎毒性、重篤アレルギー反応など深刻な副作用あり。一方GNRはヨウ素造影剤より体内持続時間が長く、十分な観察時間確保可能。さらに、ペプチドや抗体など多様な分子で表面官能基化することで、GNRはがん細胞、ウイルス、細菌を標的可能。Reuveniら[31]がGNR表面に複数種類分子の付着可能性を示す。本研究では、GNR-SiO₂-Ab濃度増加に伴いCT信号強度連続増加、より明るい画像獲得。GNR-SiO₂-AbはGNRと同様に陽性X線/CT撮像造影剤として有意な潜在性示す。表面修飾後も金ナノロッドのX線吸収は影響受けず。これらデータは、表面修飾結果としてGNR-SiO₂-AbのX線減衰特性が有意に変化しないことを示し、先行文献[35-37]の知見と一致。表面官能基化はGNRの特定部位への受動/能動標的化を可能にする強力ツール。本研究では、GNR-SiO₂-AbをC. neoformansカプセルに成功付着。さらに、これら抗体共役粒子がC. neoformans細胞の標的CT撮像におけるナノプローブとして機能するか検証。PBS分散C. neoformans細胞CT画像は水分散細胞由来画像と類似。しかし、真菌画像を軟部組織から区別するのは困難。抗体がC. neoformans細胞表面に結合しGNR凝集を大幅誘導、これまでにない高減衰値実現。 thus、真菌の識別可能なX線減衰達成。本結果に基づき、CT撮像によるC. neoformans検出達成可能、診断に新機会提供。

GNRは腫瘍光熱療法に広く採用[22,38,39]。本研究はGNR-SiO₂-AbがC. neoformans細胞破壊の選択的ツールとなり得ることを示唆。結果は、NIR照射でC. neoformans細胞膜が修復不能な重度破壊受けること確認。さらに、未処理細胞比で細胞生存率有意低下。NIR放射単独でもC. neoformans細胞死誘発示唆。しかし、GNR-SiO₂-Abインキュベート細胞の生存率も低下。GNR-SiO₂-AbインキュベートかつNIR照射細胞では、他群比較で生存率有意低下。GNR-SiO₂-Abが真菌に選択的共役しNIR放射効果改善すること確認。GNR-SiO₂-AbはC. neoformans細胞に選択的光熱療法効果発揮可能。効果メカニズムは未報告。照射誘起細胞死により細胞膜破壊誘発と推測。Normanら[18]が、特定抗体共役金ナノロッド結合シュードモナス・アエリギノサを照射暴露で生存率有意低下報告。これら細胞もNIR照射で修復不能な重度細胞膜破壊領域示す。ナノ粒子NIR照射暴露時、ナノ粒子爆発、衝撃波、気泡形成、熱分解など複数因子で細胞膜破壊[40]。

本研究では、熱エネルギーによる細胞膜崩壊破壊でC. neoformans細胞死・活性低下発生。更なる研究で仮説検証必要。C. neoformans細胞は以下因子で損傷：局所的温度上昇、ナノ粒子爆発、衝撃波、気泡形成、NIR放射による熱分解。特に、C. neoformans細胞はNIR放射単独でも実質的に損傷。標的GNR-SiO₂-AbがNIR放射を刺激しC. neoformans細胞光熱破壊誘発する2可能性：(1) C. neoformansカプセル内で標的GNR-SiO₂-Abが局所的温度上昇誘発。(2) GNR-SiO₂-AbとC. neoformansカプセルの抗原-抗体反応により細胞壁・カプセルに構造変化、光熱治療感受性増大[41]。金ナノロッド低毒性は先行研究[22,42,43]で確認済み、インビボ光熱療法効果検証には更なる研究必要。本研究最大の遺憾はGNR-SiO₂-Abの負荷容量未議論。今後、GNR-SiO₂-Ab負荷容量と光熱効果の関係に集中予定。

結論

C. neoformans細胞標的GNR-SiO₂-Ab作製に成功。これら特定抗体共役金ナノロッドがCT画像におけるC. neoformans細胞のX線減衰を増強。免疫GNRが抗体媒介でC. neoformans細胞のNIR誘起光熱療法効果を増大させることを結果が示す。さらに、GNR-SiO₂-AbはC. neoformans感染の診断と治療における容易な操作と低侵襲手技を可能にし、このアプローチの潜在的臨床応用に焦点を当てたものである。