アミノ末端HBP修飾rGOの光熱/ pH二重応答性ドラッグデリバリーシステムと腫瘍細胞に対する化学光熱療法

はじめに

近赤外（NIR）照射下での光熱療法（PTT）は、副作用が少なく、侵襲性が最小限であるため、腫瘍抑制の注目を集めています[1]。 NIR光（700〜1100 nm）は、健康な組織や細胞に損傷を与えることなく、体組織の奥深くまで浸透します[2、3]。したがって、NIRレーザー照射下では、光熱剤はその光熱変換能力を介して埋め込み位置の温度を上げることができます。さらに、適用される光熱剤には、優れた生体適合性、光熱変換効率、および安定性が必要です。

近年の研究では、貴金属（金ナノロッド[4]、金ナノプレート[5]）、半導体ナノ材料（CuS [6]、MoS 2 [7]、FeS [8]）、有機材料（ポリドーパミン[9]、ポリピロールナノ粒子[10]）、カーボンナノ材料（カーボンナノチューブ[11]、カーボンナノ粒子[12]、およびグラフェン[13]）。グラフェンは、有望なカーボンナノ材料の一種として、比表面積が非常に大きく、薬剤の充填効率が高い可能性を秘めた特殊な二次元ナノシートにより、PTT法による腫瘍抑制に広く利用されています[14、15]。ただし、尿素やヒドラジン水和物などの通常の方法で調製された還元型酸化グラフェン（rGO）の水熱プロセスは、常に高い疎水性を示します。これは、体組織の水現象への応用には有益ではありません[16]。

この場合、親水性rGOを調製するために還元能力を持つ水溶性ポリマーを使用するという新しいアイデアを提案しました。以前の研究では、アミノ末端ハイパーブランチポリマー（NHBP）を合成し、それを使用して金属酸化物ナノ粒子を処理し、HBP修飾銀ナノ粒子などの明らかな凝集がなく親水性の高い金属ナノスフェアを調製し、そのアンチへの応用を試みました。 -バクテリアフィールド[17、18]。

腫瘍抑制能力を向上させるために、抗腫瘍薬は通常、光熱剤に装填されて、薬剤充填システムを製造します[19]。一方では、光熱剤は、NIRレーザー照射下でPTT効果を発揮する可能性があります。一方、温度が上昇すると、分子運動速度が向上するため、薬物送達速度が加速する可能性があります。したがって、薬物を充填した光熱剤は、腫瘍抑制に対して化学光熱相乗療法効果を発揮することができます[20、21]。ここでは、アミノ末端HBPを使用して親水性rGO（NrGO、図1）を作成し、物理化学的特性と光熱能力を特性評価しました。その後、抗腫瘍薬（ドキソルビシン、DOX）がNrGOに組み込まれ、さまざまな条件下での薬物送達挙動と腫瘍抑制効果がinvitroでテストされました。

DOX @NrGOの準備と化学光熱療法の概略図

メソッド/実験

資料

酸化グラフェン（GO、厚さ0.8〜1.2 nm、幅0.5〜5μm）はXFNANO Co.、Ltdから供給されました。DOXはHuaFeng United Technology Co.、Ltdから購入しました。ダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）、トリプシン、ペニシリン（100 U / ml）、ストレプトマイシン（100μg/ ml）はすべてThermo Fisher Scientific Incから購入しました。メチルチアゾリルテトラゾリウム（MTT）、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI ）および酸化プロピジウム（PI）は、Beyotime Biotechnology Co.、Ltd。から入手しました。他のすべての試薬は、さらに精製することなくSinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd。から購入しました。

アミノ末端ハイパーブランチポリマー（NHBP）の調製

アミノ末端ハイパーブランチポリマーは、以前の研究[16]として合成されました。テトラエチレンペンタミン（94 ml、0.5 mol）を、窒素ガス保護とマグネチックスターラーを備えた250mlの3つ口丸底ガラスフラスコに加えました。反応混合物を加熱マグネチックスターラーで撹拌し、氷浴で冷却し、アクリル酸メチル（43 ml、0.5 mol）のメタノール（100 ml）溶液をフラスコに滴下した。次に、混合物を氷浴から取り出し、室温でさらに4時間撹拌したままにしました。混合物をナス型フラスコに移して自動回転真空蒸発させ、油浴を使用して温度を150°Cに上げ、重量平均分子量が約7759の黄色がかった粘稠なHBPスケールが得られるまで4時間放置しました。 。

NHBP削減GO（NrGO）の準備

GOを最初に脱イオン水に分散させ、適切なHBP（GOとNHBPの重量比は1：10、1：20、および1:30）と10分間超音波混合し、攪拌を続け、90°Cで1時間反応させました。次に、得られたもの（NrGO-10、NrGO-20、およびNrGO-30とマーク）を遠心分離し、脱イオン水で3回洗浄しました。

DOXをロードしたNrGO（DOX @ NrGO）の準備

調製したままのNrGO懸濁液を、重量比1：1のDOX溶液に分散させ、室温で24時間撹拌し続けました。次に、複合溶液を遠心分離して洗浄し、DOX @NrGOを収集しました。

測定値

表面形態は、透過型電子顕微鏡法（TEM、JEM-2100、JEOL、日本）によって特徴づけられました。フーリエ変換赤外（FTIR、Nicolet iS10、Thermo Scientific、アメリカ）分光法を実行して、GOとNrGOの間の化学成分の変化を説明しました。すべてのスペクトルは、400〜4000 cm ^-1 の波長範囲で測定されました。 解像度は4cm ^-1 。表面電位と粒子サイズは、ゼータ電位-粒子サイズアナライザー（NanoBrook 90plus Zeta、ブルックヘブン、米国）を介して調査されました。 NIR領域でのNrGOの吸収は、波長範囲400〜900 nm、分解能1 cm ^-1 のUV-vis（Evolution 300、Thermo Fisher、USA）によって研究されました。 。

光熱特性は、NIRレーザーデバイス（SFOLT Co.、Ltd。、上海、中国）と熱電対温度計（DT-8891E、Shenzhen Everbest Machinery Industry Co.、Ltd。、中国）を使用して測定しました。 NrGOの光熱特性は、808nmのレーザー照射下で測定されました。レーザーのスポット面積は約0.25cm ² 、およびテストされたサンプル懸濁液の温度変化をリアルタイムで監視しました。ここでは、純水とGO懸濁液をコントロールグループとして適用しました。（1）0.2 mlの純水、GO、およびNrGO（NrGO-10、NrGO-20、およびNrGO-30）懸濁液を0.25 mlのエッペンドルフチューブに入れ、次にNIRレーザーに1W / cm ² の出力密度で照射しました 5分間; （2）異なる濃度（100、200、および300μg/ ml）の0.2 ml NrGO-30懸濁液を照射しました（1 W / cm ² ）5分間; （3）0.2 mlのNrGO-30懸濁液（200μg/ ml）にさまざまな出力密度（1、1.5、および2 W / cm ² ）を照射しました。 ）5分間; （4）0.2 ml NrGO-30（200μg/ ml）懸濁液を照射しました（1 W / cm ² ）3回のオン/オフサイクル。

収集されたDOX @ NrGOは、薬物送達挙動を調査するために、異なる処理のために3つのグループに分けられました。 （2）pH =4.0のPBS溶液に分散させ、酸基としてマークします。 （3）pH =7.4のPBS溶液に分散し、NIRグループとしてマークされたNIRレーザーを照射します。上記の3つのグループ（各グループは3つの平行線に設定）をカットオフ分子量8000の透析バッグ（5 ml）に入れ、20mlの対応するPBS溶液を入れた遠心分離管に入れました。その後、すべてのチューブを100 rpmの37°Cシェーカーに入れ、薬物放出分析のために各チューブの10 mlのPBS溶液を所定の時点で抜き取り、対応する新しいPBSを等量戻しました。さらに、NIRグループは、所定の各時点の後に5分間NIR光が照射されたものとして扱われました。回収されたすべての溶液をUV-vis分光光度法で分析し、ドラッグデリバリープロファイルを取得しました。

腫瘍細胞（HeLa）に対するNrGOの細胞毒性をMTTアッセイで調べた。簡単に説明すると、HeLa細胞を96ウェルプレートに5×10 ³ の密度で播種しました。 ウェルあたりの細胞数を増やし、ウェルの80％が覆われるまでインキュベートを続けました。次に、古い培地をNrGOを含む新しい培地（3.125、6.25、12.5、25、および50μg/ ml）に交換し、NrGOを含まない培地を対照群として設定しました。 24時間および48時間インキュベートした後、MTTアッセイを使用して、式（1）を介して相対的な細胞生存率を測定しました。 （1）：

ここで、OD _サンプル およびOD _{コントロール} それぞれ異なる濃度および対照群のNrGOで処理された細胞の測定された吸光度を表しています。

次に、NIR照射下でHeLa細胞をDOX @ NrGO（3.125、6.25、12.5、25、および50μg/ ml）で処理することにより、化学光熱相乗療法を調査しました。 DOX @ NrGOと4時間インキュベートした後、HeLa細胞にNIRレーザーを5分間照射し、さらに20時間インキュベートし続けました。その後、細胞生存率を再度MTTアッセイでテストしました。細胞観察のために、HeLa細胞をそれぞれDAPIとPIで染色し、CLSMと蛍光顕微鏡で観察しました。

結果と考察

物理的および化学的特性評価

NHBPと反応した後、GO溶液は茶色から黒色に変わり、GOがrGOに正常に還元され、水に分散可能であることを示しています。図2a、bに示すように、GOとNrGO-30のTEM画像がそれぞれ表示されましたが、NrGOで明らかなクリスピーや凝集は検出されなかったため、HBP処理によって還元反応で形態変化が発生することはありませんでした。図3のFT-IRスペクトルに基づくと、NrGO-30の透過率曲線はNHBPの透過率曲線と非常に似ていました。重要なのは、1725 cm ^-1 のピークです。 還元反応後、GOの量は消失しました。これは、カルボキシル基からのC =Oの振動吸収であることが示唆されました[22]。アミノ末端NHBPの分子構造によると、還元性アミノ基はGOと反応し、1633 cm ^-1 に新しいFT-IRピークが生成されました。 、アミド結合からのC-Nであると思われます。ゼータ電位の結果を図4に示しました。明らかに、すべてのNrGOサンプルは正の電位でしたが、GOは負の電位でした。これは、GOのカルボキシル基がHBPのアミノ基と反応したことを示しています。 UV-vis-NIRスペクトル（図5）を使用して、NrGOのNIR吸収を説明しました。原材料比率が異なるNrGOサンプルの曲線は、NIR領域での吸収が高く、同様の傾向を示しました。これは、PTTでのアプリケーションに有益です。一方、GOおよびHBP溶液は、NIR領域でほとんど吸収を示さず、GOおよびNHBPからの光熱剤の製造が成功したことを示唆しています。さらに、NrGOのナノサイズも測定されましたが（図6）、NHBP比の上昇による明らかな変化は見られませんでした。

GOのTEM画像（ a ）およびNrGO（ b ）。挿入図は、1 mg / mlの濃度のサンプル分散に対応する光学写真です

GO、NrGO、およびNHBPのFT-IRスペクトル

GOおよびNrGOサンプルのゼータ電位テスト

GO、HBP、およびNrGOサンプルのUV-vis-NIRスペクトル

NrGOサンプルのナノサイズ測定

光熱特性測定

得られたNrGOに基づいて、808nmのレーザー照射下で光熱特性を調査しました。図7に示すように、水、GO、およびNrGOの加熱曲線は異なる傾向を示しました。純水の温度はほとんど上昇せず、GOは5°C未満にしか上昇しませんでしたが、NrGOは40°Cまで向上し、NrGO-20とNrGO-30は45°Cを超えるまで上昇しました。 NrGOはNIRレーザーを吸収して光熱挙動を引き起こすことができ、HBP比を上げることで光熱変換効率が向上しました。したがって、以下の調査を完了するためにNrGO-30が選択されました。図7b、cに示すように、到達温度はNrGO濃度またはレーザー出力の増加に伴って上昇し、後者の要因がより強く影響しました。 41〜43°Cは、正常細胞にほとんど悪影響を与えることなく、腫瘍細胞の抑制に適切であることが証明されました。したがって、調製されたNrGOは、低用量のレーザー粉末でPTTの要件を満たすことができます。次に、光熱安定性をテストして図7dに示しましたが、3回のオン/オフサイクル後に明らかな違いはありません。このように、NrGOはNIR領域で優れた光熱特性を獲得しました。 NIRレーザー照射前後のNrGOの吸収安定性を確認するために、UV-visスペクトルを図8に示しました。明らかに、NIR照射後も曲線は変化せず、NIR照射がNrGOの吸収に影響を与えないことがわかりました。

光熱特性測定。 a 808 nmのレーザー照射（1 W / cm ² ）下での水、GO、およびNrGOサンプル（200μg/ ml）の加熱曲線 ）。 b 808 nmのレーザー照射（1 W / cm ² ）下でのさまざまな濃度のNrGO-30の加熱曲線 ）。 c さまざまな出力密度での808nmレーザー照射下でのNrGO-30（200μg/ ml）の加熱曲線。 d 3回のサイクル照射（1 W / cm ² ）での808 nmレーザー照射下でのNrGO-30（200μg/ ml）の温度変化曲線 ）

NIRレーザー照射前後のNrGOのUV-vis-NIRスペクトル

ドラッグデリバリー動作テスト

DOXがNrGOにロードされた後、ドラッグデリバリー実験が実行されました。腫瘍組織の弱酸性環境のため、NIR照射とpHの両方の影響が研究されました。本明細書では、ｐＨ７．４または４．０のＰＢＳを適用して、それぞれ正常組織または腫瘍組織を模倣した。図9に示すように、薬物送達速度は、低pHおよびNIR照射下で明らかに加速されました。一方では、NrGOのアミノ基が低pH値でイオン化され、次にDOXとイオン化アミノ基間の反発力が低pH条件下で改善され、ドラッグデリバリーが加速され、pH感度が示されます。さらに、低pH条件でのDOXの良好な溶解性は、ドラッグデリバリー速度も向上させる可能性があります[23]。一方、近赤外レーザー照射では、局所温度が上昇し、分子運動速度が速くなりました。したがって、DOX @ NrGOは、薬物送達挙動においてpH /光熱感受性であり、これは、腫瘍組織における薬物送達速度を制御し、化学光熱相乗療法を発揮するのに有益です。

さまざまな条件下でのDOX @ NrGOのinvitro薬物放出プロファイル

NrGOの細胞毒性

生体適合性は、生体材料に必要な基本的な特性です。したがって、異なる濃度のNrGOの細胞毒性は、MTTアッセイを介したinvitro実験中に最初にテストされました。図10aに示すように、24時間のMTTアッセイの結果は、NrGO濃度が50μg/ mlに達したときに細胞生存率が80％以上を維持していることを示しています。これは、NrGOが生体適合性が高く、腫瘍における有望な生体適合性PTT剤と見なされていることを証明できます。抑制。

a 24時間と48時間の異なる濃度でのNrGOの細胞毒性試験。 b 異なる治療法によるDOX @ NrGOの腫瘍細胞阻害調査

腫瘍細胞に対するDOX @ NrGOの相乗的阻害

NrGOの生体適合性に基づいて、DOX @NrGOの腫瘍抑制効果をinvitroで研究しました。光熱挙動の影響を調べるために、NIRレーザーを対応する腫瘍細胞に0.5 W / cm ² の出力密度で5分間照射しました。 。図10bに示すように、腫瘍細胞をDOX @ NrGOで24時間処理すると、濃度の増加に伴って生存率が明らかに低下し、放出されたDOXが腫瘍細胞の増殖を阻害する可能性があることが明らかになりました。さらに、NIR照射も適用された場合、生存率ははるかに急速に低下し、温度の上昇とDOX放出速度が化学光熱相乗療法を行う可能性があることを示しています。

DAPIで染色した後、細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で観察し、核を青色に染色し、さまざまな処理の画像をそれぞれ図11a〜cに表示しました。 NrGOで培養した細胞は培養プレート上に大量に拡散し（図11a）、DOX @ NrGOで処理すると数が減少し（図11b）、放出されたDOXが腫瘍増殖を阻害する可能性があることがわかりました。重要なことに、NIRレーザー照射領域の腫瘍細胞は効率的に破壊されて脱落し、その結果、画像上に暗い領域が生じました（図11c）。

NrGO（ a ）で処理した後のDAPI（青）染色細胞核のCLSM画像 ）、DOX @ NrGO（ b ）、およびDOX @ NrGO + NIR（ c ）。 （×400）

さらに、PIを適用して、化学光熱相乗治療後の腫瘍細胞の抑制を観察しました。これは、死んだ細胞を赤色蛍光に染色するための一種の小分子色素です。図12に示すように、治療を行わなかった場合、図12aではほとんど死んだ細胞（画像の赤い点）は観察されませんでしたが、化学光熱処理後、曝露領域外の腫瘍細胞はDOXの損傷を受けました。細胞の生存率をさらに低下させるための高温（図12b）。上記の結果によると、DOX @NrGOは腫瘍治療の望ましい候補であることが証明されました。

さまざまな治療法による腫瘍細胞のPI染色。 a コントロール。 b DOX @ NrGO + NIR

結論

要約すると、新規の親水性NrGOが設計され、GOとアミノ末端HBPの単純な反応によって首尾よく調製されました。さまざまな特性評価により、NrGOが安定した優れた光熱特性を獲得したことが示されました。 DOXローディング後、ドラッグデリバリーはpHと光熱二重応答挙動を示しました。これは低pH値とNIR照射で加速する可能性があります。さらに、インビトロ細胞毒性実験の結果は、調製されたままのNrGOが十分に生体適合性であることを示した。この利点により、化学光熱相乗療法に基づいて腫瘍細胞を効果的に阻害することができ、抗腫瘍薬をロードしたNrGOは腫瘍治療で有望な用途を獲得しました。

略語

CLSM：

共焦点レーザー走査顕微鏡

DAPI：

4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール

DOX：

ドキソルビシン

DOX @ NrGO：

DOXをロードしたNrGO

FTIR：

フーリエ変換赤外

GO：

酸化グラフェン

HBP：

ハイパーブランチポリマー

MTT：

メチルチアゾリルテトラゾリウム

NHBP：

アミノ末端HBP

NIR：

近赤外線

NrGO：

アミノ末端ハイパーブランチポリマー還元グラフェンオキシド

PI：

ヨウ化プロピジウム

PTT：

光熱療法

rGO：

還元型酸化グラフェン

SEM：

走査型電子顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡