磁気誘導・近赤外線応答型rGO@Fe₃O₄マイクロスフェアによる化学光熱併用がん治療の簡易製造法

概要

近赤外線（NIR）応答性グラフェンは、がん光熱療法において優れた効果を示してきました。本研究では、スプレー乾燥法と共沈殿法を組み合わせた簡便な手法で、酸化鉄（Fe₃O₄）を修飾した中空グラフェンマイクロスフェア（rGO@Fe₃O₄）を調製し、磁気誘導型かつNIR応答型の化学光熱併用療法への応用を検討しました。得られたマイクロスフェアは、非常に高い比表面積（約120.7 m²/g）と大きな細孔容積（約1.012 cm³/g）を持ち、抗がん剤ドキソルビシン（DOX）の高い担持容量（約18.43%）を実現しています。NIR照射による光熱効果はオン・オフ制御が可能で、高い光熱変換効率を示しました。また、マイクロスフェア上のFe₃O₄は優れた腫瘍細胞標的能を発揮しました。rGO@Fe₃O₄/DOXを用いた化学光熱併用治療は、HeLa細胞に対してin vitroで優れた細胞毒性を示しました。これらの結果から、rGO@Fe₃O₄/DOXマイクロカプセルは併用がん治療における有望な候補であることが示唆されました。

はじめに

がんは世界でも最も悪性度の高い疾患の一つであり、ヒトの死因の上位を占めています[1, 2]。化学療法は臨床で広く用いられていますが、治療効率の低さや重篤な副作用がその適用を大きく制限しています[3]。薬物送達システム（DDS）は、薬物の溶解性、生体利用率、腫瘍への蓄積を向上させ、抗腫瘍効率を大幅に改善することが期待されています[4]。近年、大きな表面積と豊富な多孔構造を持つ中空マイクロスフェアをDDSとして用いる研究が注目されています[5-8]。また、革新的な技術を用いた様々な中空マイクロスフェア材料が設計されています[9-13]。

酸化グラフェン（GO）は、優れた生体適合性、低コスト、簡便な調製法などの特徴を持つ新規な無機非金属材料として、薬物送達への応用が広く研究されてきました[14-17]。特に、GOはNIR照射下で光を効率的に熱に変換する性質を持ち[18-20]、がん光熱療法の効果を高める有望な戦略となっています。Chenらは、GOがπ-πスタッキング、水素結合、静電吸着などの非共有結合相互作用を介して抗がん剤を送達できることを報告しています[21]。しかし、2次元GOナノシートは大きな比表面積と層間のファンデルワールス力により凝集しやすく[17, 22]、水溶性が低下し薬物担持能が減少するという課題がありました。この欠点を克服するための様々な戦略が検討されてきました。Tsukrukらは、層別組み立て技術を用いてグラフェン中空カプセルを開発し[23]、他のGO材料と比較して極めて高い薬物担持能を示しました。これは、GOによって安定化された中空カプセルの高い比表面積と大きな細孔容積に起因すると考えられます。しかし、薬物送達への応用において、三次元的に連結した細孔構造を持つGOに関する報告はほとんどありません。

多くの報告されたDDSが優れた薬物担持能と制御放出挙動を示す一方で、腫瘍組織への標的特異性が不十分であるため、臨床前研究や応用が限られています[24]。様々な標的送達システムの中で、Fe₃O₄は高い磁気応答性、安定した品質、容易な調製法から、がん治療における磁気標的材料として広く用いられています[25-29]。Niらは、超常磁性を示すFe₃O₄@SiO₂コアシェルナノ粒子を開発し、腫瘍の磁気標的化に成功しました[30]。さらに、Fe₃O₄担持GOナノ粒子は、磁気標的送達と光熱療法の併用において十分に研究されています[31-34]。

本研究では、酸化鉄修飾rGO中空マイクロスフェア（rGO@Fe₃O₄）からなるDDSプラットフォームを開発するための先進的な戦略を報告します。このシステムは、磁気誘導型およびNIR誘発型光熱療法（PTT）を目的としています。スキーム1に示すように、rGO@Fe₃O₄中空マイクロスフェアは3段階で調製されます。まず、SiO₂をテンプレートとしてスプレー乾燥法でrGO-SiO₂を合成し、その後HFエッチングでSiO₂を除去してrGO中空マイクロスフェアを得ます。続いて、共沈殿法でFe₃O₄ナノ粒子をrGO中空マイクロスフェアに担持し、rGO@Fe₃O₄マイクロスフェアを構築します。このシステムにおいて、rGOはNIR誘発型PTT剤として機能し、Fe₃O₄はHeLa細胞への磁気標的特性を付与します。細孔吸着とπ-πスタッキングに基づいてドキソルビシン（DOX）をカプセル化したマイクロスフェア（rGO@Fe₃O₄/DOX）は、超高薬物担持容量とpH応答性薬物放出挙動を示し、光熱療法と化学療法の併用により抗がん効果を大幅に向上させることが期待されます。

材料と方法

材料

塩化鉄六水和物（FeCl₃·H₂O）、水酸化ナトリウム（NaOH）、硫酸鉄七水和物（FeSO₄·7H₂O）は、シノファーム試薬株式会社から購入しました。HeLa細胞は天津がん病院由来です。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩酸ドキソルビシン（DOX·HCl）、ダルベッコ改良Eagle培地（DMEM）、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインダール（DAPI）、セルカウンティングキット-8（CCK-8）は、ソルバイオサイエンス株式会社から購入しました。SiO₂（約300 nm）は上海元江化学公司から、酸化グラフェン脱イオン水溶液（2 mg/ml）は南京先鋒公司から市販品として入手しました。

rGO@Fe₃O₄マイクロスフェアの調製

中空グラフェンマイクロスフェアは、テンプレートとしてSiO₂（300 nm）を用いたスプレー乾燥法で調製しました。簡単には、SiO₂懸濁液（50 mg/ml）100 mlを、激しく撹拌しながらGO水溶液（2 mg/ml）300 mlに滴下し、混合液をスプレー乾燥機で200℃で乾燥させました。得られた生成物をアルゴン雰囲気下で300℃、2時間保持し、rGO-SiO₂を得ました。SiO₂を除去するため、rGO-SiO₂を10% HF溶液中で60℃、48時間処理しました。固形分を数回洗浄後、真空乾燥機で60℃、12時間乾燥し、最終的にrGOを得ました（収率75%）。

rGO@Fe₃O₄ナノ粒子は共沈殿法で調製しました。典型的なプロセスでは、FeCl₃·H₂O（0.27 g）、FeSO₄·7H₂O（0.28 g）、rGO中空マイクロスフェア（0.1 g）を脱イオン水10 mlに溶解し、50℃で30分撹拌しました。その後、NaOH水溶液（0.15 mol/L）60 mlを50℃で連続撹拌下に12時間かけて滴加しました。生成物を磁気分離し、脱イオン水とエタノールで数回洗浄後、真空下で60℃、12時間乾燥させました。

構造解析

試料のサイズと形態は、電界放出型走査電子顕微鏡（FE-SEM、日立S-4800）と透過型電子顕微鏡（TEM、JEM2100F、JEOL）で観察しました。組成分析はX線回折装置（XRD、D8 Focus、Cu Kα線、ブルカー、ドイツ）を用い、スキャン速度12°/分、範囲10-80°で行いました。X線光電子分光（XPS）はXPS分光計（Thermo Fisher Scientific、ESCALAB 250Xi、アメリカ）で測定しました。フーリエ変換赤外分光（FT-IR、AVATAR360、Nicolet）は、分解能4 cm⁻¹で500-4000 cm⁻¹の範囲で記録しました。磁気測定は超伝導量子干渉デバイス（SQUID、Quantum Design MPMS）磁力計を用いて室温（300 K）で行いました。ラマンスペクトルはラマン分光計（Renishaw、inVia Reflex、イギリス）で、532 nmレーザーを用いて測定しました。rGO含有量は熱重量分析装置（TGA、TA Instruments-water LLC、SDTQ-600）で評価しました。比表面積はBET法で測定しました。UV-VisスペクトルはベックマンDU 800核酸/タンパク質分析装置（Beckman Instruments, Inc.、Rosemead, CA）で記録しました。

DOX担持と放出

モデル化学療法薬であるドキソルビシン（DOX）をrGO@Fe₃O₄の内部に封入し、抗がん剤の担持と放出挙動をin vitroで評価しました。rGO@Fe₃O₄/DOXは先行研究の方法に従って調製しました。簡単には、DOX水溶液（0.2 mg/ml）10 mlをrGO@Fe₃O₄懸濁液（10 mg）に加え、超音波ホモジナイザーで十分に分散させました。その後、往復シェーカー（SK-O180-Pro）で150 rpm、24時間平衡させました。6000 rpm、10分遠心分離後、遊離DOXを除去し、上清液のUV-Vis吸光度を490 nmで測定して担持DOX量を決定しました。担持効率（LE）と担持容量（LC）は以下の式で計算しました。

LE = （総DOX量 - 遊離DOX量）／総DOX量

LC = （総DOX量 - 遊離DOX量）／rGO@Fe₃O₄/DOX量

DOXのin vitro放出試験は、rGO@Fe₃O₄/DOX（10 mg）を透析チューブ（MWCO = 1000）に入れ、pH 5.4、6.5、7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS、30 ml）中に浸漬し、37℃水浴で80 rpmで振盪しました。所定の時間間隔で3 mlずつ採取し、放出されたDOX量をUV-Vis（480 nm）で測定して算出しました。

NIR誘発光熱効果

rGO@Fe₃O₄の濃度がNIR誘発光熱効果に及ぼす影響を調べるため、異なる濃度（0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/ml）のrGO@Fe₃O₄溶液を、2 W/cm²のNIRレーザーで5分間照射しました。また、rGO@Fe₃O₄（0.25 mg/ml）に異なる出力密度（1、1.5、2 W/cm²）のNIRレーザーを5分間照射し、光エネルギーの影響を評価しました。リアルタイム温度はFLIR I5赤外線サーモグラフィカメラで測定しました。

細胞取り込み試験

HeLa細胞を35 mm²コンフォーカルディッシュに1×10⁵ cells/wellの密度で播種し、24時間培養（5% CO₂、37℃）後、培地を除去し、rGO@Fe₃O₄/DOXマイクロスフェア含有新鮮培地（磁石あり/なし）を加えてさらに5時間培養しました。rGO@Fe₃O₄/DOX濃度は0.1 mg/mlとしました。細胞を冷PBS（pH 7.4）で3回洗浄後、4%パラホルムアルデヒドで20分固定し、コンフォーカルレーザー走査顕微鏡（CLSM、TCSSP5II、Leica、ドイツ）で観察しました。

細胞生存率アッセイ

マイクロスフェアの細胞毒性を、NIR処理後のCCK-8アッセイで評価しました。HeLa細胞を96ウェルプレート（5×10³ cells/well）に100 μl培地で播種し、5% CO₂、37℃で24時間培養しました。生体適合性評価では、rGO@Fe₃O₄を0.01-0.2 mg/mlの濃度範囲で添加しました。単独光熱療法群では、同濃度範囲のrGO@Fe₃O₄添加後、NIR照射（2 W/cm²、808 nm、10分）を行いました。併用療法群では、rGO@Fe₃O₄/DOXを同濃度範囲で添加後、NIR照射（2 W/cm²、808 nm、10分）を行いました。さらに24時間または48時間培養後、PBSで洗浄し、10 μl CCK-8溶液を含む100 μl DMEM培地で40分インキュベートしました。マイクロプレートリーダーで450 nmにて吸光度を測定しました。すべての実験は三重複で行いました。

結果と考察

合成と形態解析

rGO@Fe₃O₄マイクロスフェアの調製は3段階で行われました。まず、SiO₂をテンプレートとしたスプレー乾燥法でrGO-SiO₂マイクロスフェアを合成しました。SEMとTEMで形態を観察したところ（図1a）、直径約3 μmの均一な球状を呈し、多数のSiO₂ナノ粒子（約300 nm）が密集して構成されていました。TEM像と動的光散乱による動的直径測定でも同様の結果が確認されました（図1d, g）。次に、300℃加熱とHFエッチングでSiO₂を除去し、中空rGOマイクロスフェアを得ました。SiO₂溶解により約300 nmの明確な細孔が観察されました（図1b, e）。最後に、磁気標的能を付与するためFe₃O₄を共沈殿法で多孔性rGOに担持しました。SEMとTEM観察により、Fe₃O₄担持後に細孔サイズが著しく減少することが確認されました（図1c, f）。これは薬物送達と制御放出の可能性を示唆しています。特筆すべきは、rGO-SiO₂、rGO、rGO@Fe₃O₄の粒子サイズと動的サイズ分布に、これらの処理過程でほとんど変化が見られなかったことです（図1g, h, i）。

構造と組成解析

rGO@Fe₃O₄の成功的調製をさらに確認するため、SEM-EDSで構造と組成を解析しました。EDSマッピングでは、元素O、Fe、Cに対応する非弾性散乱電子を可視化し、それぞれ異なる色で実構造中の濃淡を示しました。図2a, bに示すように、FeとOはrGO@Fe₃O₄マイクロスフェア全体に高密度で分布していました。図2dは、直径約18 nmのFe₃O₄ナノ粒子がrGO内に均一に分散しており、これによりrGO@Fe₃O₄マイクロスフェアの細孔サイズが急減したことを確認しています。選択面電子回折（SAED）パターンでもFe₃O₄の存在が確認されました（図2e）。2.98、2.53、2.09、1.62、1.49 nmの面間隔は、Fe₃O₄の面心立方構造における220、311、400、511、440面に対応しています。XRDスペクトルでもこれらの面に対応するピークが検出され、SAED結果と一致しました（図2c）。ただし、Fe₃O₄とγ-Fe₂O₃は特徴ピークの位置が同じため、XRDのみでは区別できません[35]。XPS結果では、725.9/724.5 eVと714.1/711.0 eVの主要ピークがそれぞれFe 2p₁/₂とFe 2p₃/₂に帰属し、Fe₃O₄中にFe³⁺とFe²⁺が共存することを示しました[36]（図2g, h）。熱重量分析（TGA）でrGO@Fe₃O₄中のrGOの熱分解挙動を調べました（図2f）。質量減少曲線は、脱水領域（40-300℃）と脱揮発領域（300-800℃）の2段階を示し、試料中の炭素含有量は25.6 wt.%と算出されました。

rGO@Fe₃O₄マイクロスフェアの磁気特性はSQUIDで測定しました。磁場範囲は-20,000から20,000 Oe、室温で測定しました。図2iに示すように、Fe₃O₄の飽和磁化（Ms）は66.6 emu/g、保磁力（Hc）は9.3 Oeでした。Fe₃O₄をrGOに担持後、rGO@Fe₃O₄のMsは33.9 emu/g、Hcは7.44 Oeに低下しました。この磁化飽和の大幅な低下は、rGOの反磁性に起因すると考えられます。また、磁気分離実験でrGO@Fe₃O₄の選択的凝集能を直感的に確認しました。Fe₃O₄とrGO@Fe₃O₄の懸濁液を外部磁石を当てたバイアルに入れると、2分で磁石側に凝集し溶液は透明になりました。磁石を離すと、ゆっくり振とうするだけでrGO@Fe₃O₄は再び均一に分散し、優れた水分散性を持つことが確認されました。この優れた水分散性と磁気応答性は、rGO@Fe₃O₄をがん治療用薬物担体として磁気標的応用する道を開きます。

光熱効果解析

NIRは組織への透過深度が深く、周囲組織へのダメージが少ないため、NIR応答性光熱療法が腫瘍治療に用いられてきました。そこで、異なる濃度と出力密度のrGO@Fe₃O₄水溶液について、808 nm NIRレーザー照射下（5分間）での光熱変換挙動を記録しました。図3a, bに示すように、温度上昇は濃度とレーザー出力密度に強く依存しました。濃度1 mg/mlでは、2 W/cm²照射で27.9℃から70.3℃まで上昇したのに対し、PBS対照群では31.7℃から36.2℃の上昇にとどまりました。タンパク質変性とDNA損傷が50℃で4-6分の曝露で生じるという報告[21, 37]を考慮すると、rGO@Fe₃O₄の高い光熱変換効率は腫瘍光熱療法への大きな可能性を示しています。光熱変換挙動を直感的に示すため、赤外線サーモグラフィを実施しました（図3c）。濃度1 mg/mlのrGO@Fe₃O₄溶液は、NIR照射5分後に70.3℃まで急上昇したのに対し、水対照群ではほとんど変化がなく、温度計測結果と一致しました。さらに、808 nmレーザー（2 W/cm²）によるオン/オフサイクルを6回繰り返し、光熱安定性を検証しました（図3d）。同一の温度上昇が得られ、rGO@Fe₃O₄複合体の完全なNIR光熱安立性が確認されました。これらの結果は、rGO@Fe₃O₄マイクロスフェアががん光熱療法用光熱剤として大きな可能性を秘めていることを示しています。

薬物担持と放出

rGO@Fe₃O₄の比表面積と細孔サイズはBETとBJH法で評価しました（図4a, b）。N₂吸着脱着等温線はIV型で、比表面積120.7 m²/g、細孔サイズ2-8 nm、細孔容積1.012 cm³/gでした。これらの結果は、rGO@Fe₃O₄がメソポーラスチャネルと平均的な細孔分布を持ち、抗腫瘍薬物担持に大きな可能性を有することを示しています。多孔構造を持つrGO@Fe₃O₄マイクロスフェアを用い、モデル薬物ドキソルビシンを単純混合と弱い超音波処理で担持させました。ATR-FTIR分析により、DOXの-COOHとベンゼン環に由来する1726 cm⁻¹と1618 cm⁻¹の特徴ピークが確認され、DOXがrGO@Fe₃O₄に安定的に組み込まれていることが裏付けられました（図4c）。SEM観察では、DOXに由来するN元素の新しいシグナルがマイクロスフェア全体に均一に分布していました（図4d, e）。rGO@Fe₃O₄/DOXのDOX担持効率（LE）と担持容量（LC）はそれぞれ92.15%と18.43%でした。多くの薬物担体と比較して著しく高いLCは、極めて高い比表面積と細孔容積に起因すると考えられます[19]。高いLEは2つの要因によるものと考えられます。一つは、rGO@Fe₃O₄のsp²混成π結合とDOXのキノン部分との間の強いπ-πスタッキング相互作用[21]、もう一つは、rGO@Fe₃O₄のカルボキシル基（-COOH）、水酸基（-OH）とDOXのアミノ基（-NH₂）、水酸基（-OH）との間の水素結合形成です。続いて、腫瘍と正常組織の細胞外環境を模倣するpH 7.4、6.5、5.4のPBS中でDOX放出挙動を監視しました。図4fに示すように、pHを7.4から5.4に下げるとDOX放出速度が加速し、pH 5.4では98時間後に累積放出率が73%に達しました。したがって、rGO@Fe₃O₄からのDOX累積放出プロファイルはpH依存性を示しました。酸性条件下での放出加速は、DOXの水酸基とアミノ基の部分的プロトン化により薬物溶解度が高まり、DOXとグラフェン間の水素結合が弱まるためと考えられます[38]。さらに、NIR応答性DOX放出挙動もin vitroで検討しました。図4gに示すように、NIR照射によりDOX放出が加速し、放出率は最大85%に達しました。このpHとNIRの二重刺激応答性は、腫瘍部位への効果的な薬物送達において重要な役割を果たします。

In vitro細胞取り込み

rGO@Fe₃O₄マイクロスフェア中のFe₃O₄の磁気標的能を検証するため、磁場処理の有無で細胞取り込み実験を行い、コンフォーカルレーザー走査顕微鏡（CLSM）で定性評価しました。HeLa細胞をrGO@Fe₃O₄/DOXで4時間インキュベートし、核をDAPIで染色しました。図5の結果では、磁場処理あり群では、rGO@Fe₃O₄マイクロスフェアに対応する黒いスポットと、DOXに由来する明確な赤色蛍光が細胞内で観察されました。一方、磁場なし群では黒いスポットが少なく、DOX蛍光も弱かったです。これは、磁石によって細胞内へのrGO@Fe₃O₄取り込みが促進されたことを示唆しています。結果として、rGO@Fe₃O₄/DOX中のFe₃O₄がHeLa細胞を効率的に特異的に標的化し、マイクロスフェアの細胞内取り込みを有意に増強することが示され、がん治療におけるDDSとして好ましい磁気標的能を有することが確認されました。

In vitro細胞毒性解析

rGO@Fe₃O₄の生体適合性をCCK-8アッセイでHeLa細胞に対して評価しました。図6aに示すように、幅広い濃度範囲でインキュベートした後も、高濃度（200 μg/ml）でも細胞生存率は90%以上を維持し、rGO@Fe₃O₄が高い生体適合性を持ち、効率的な薬物送達プラットフォームとなり得ることが示されました。rGO@Fe₃O₄の光熱療法効果を、HeLa細胞と24時間および48時間インキュベート後、NIR照射（808 nm、10分）下で検討しました。図6bに示すように、光毒性はNIR照射下で明確な用量依存性を示し、24時間で細胞生存率が90.37%から35.52%に、48時間で93.77%から31.75%に低下しました。これはrGO@Fe₃O₄が優れた光毒性を持ち、光熱療法への大きな可能性を秘めていることを示しています。光熱療法と化学療法の相乗効果を評価するため、rGO@Fe₃O₄/DOXのNIR照射あり/なしでのHeLa細胞に対する細胞毒性を調べました。図6c, dに示すように、細胞生存率は濃度依存的かつ時間制御的に変化しました。NIR照射なしでは、rGO@Fe₃O₄/DOXと遊離DOXでそれぞれ約65%と80%のHeLa細胞が死滅しました。rGO@Fe₃O₄/DOXの腫瘍殺傷能が遊離DOXより低下したのは、マイクロスフェアからのDOX放出が遅延するためと考えられます。NIRレーザー照射（808 nm、10分）後、同等DOX用量（30 μg/ml）でrGO@Fe₃O₄/DOX+レーザー群は86%以上の細胞を死滅させました。48時間後の同様の処理では、DOX、rGO@Fe₃O₄/DOX、rGO@Fe₃O₄/DOX+照射群の生存率低下はそれぞれ80%、76%、90%であり、光熱療法と化学療法の併用による相乗効果が確認されました。

結論

まとめると、本研究ではrGOベースの薬物送達プラットフォームrGO@Fe₃O₄/DOXを、相乗的化学光熱療法のために構築する簡便な戦略を検討しました。rGO@Fe₃O₄/DOXマイクロスフェアは、優れたNIR誘発PTT効果と完全なNIR光熱安定性を示しました。マイクロスフェア上のFe₃O₄は優れた腫瘍細胞標的能を確保しました。DOXはrGO@Fe₃O₄に超高薬物担持容量で封入可能であり、同時にpH応答性薬物放出挙動も達成できました。さらに、化学療法と光熱療法の併用により抗腫瘍効率が向上しました。したがって、この多機能薬物送達プラットフォームは、将来的に腫瘍標的化と併用がん治療の有望な候補となり得ます。