親水性 HBP 修飾 rGO による二重 pH/NIR 応答性 DOX リリースで相乗的化学-光熱腫瘍治療を実現

概要

アミノ基終端ハイパーブランチポリマー（NHBP）でグラフェン酸化物（GO）を還元し、親水性還元グラフェン酸化物（NrGO）を合成する容易な経路を報告する。NrGO は優れた水分散性、強い近赤外（NIR）吸収、効率的な光熱変換、化学的安定性を示す。抗がん剤ドキソルビシン（DOX）を NrGO に担持させると、酸性腫瘍様条件下や NIR レーザー照射下で DOX リリースが加速する二重応答性薬物キャリアが得られる。In vitro 試験で NrGO の生体適合性を確認し、DOX@NrGO が遊離 DOX より優れた腫瘍細胞抑制を達成、効果的な化学-光熱相乗効果を実証。これらの知見は、DOX@NrGO が併用がん治療や他の生物医学応用への有望なプラットフォームであることを示す。

はじめに

近赤外（NIR）光熱療法（PTT）は、NIR 光（700–1100 nm）が低吸収で組織透過し、正常細胞を温存しながら局所加熱を可能にするため、低侵襲がん治療戦略として台頭している。PTT には高い光熱変換効率、良好な生体適合性、水環境でのコロイド安定性を兼ね備えた治療薬が必要。

グラフェンベース材料は、二次元構造、大きな比表面積、調整可能な光学特性で PTT 薬剤として注目されている。しかし、化学的または水熱法で作製される従来の還元グラフェン酸化物（rGO）は疎水性を残しがちで、生物学的システムでの適用を制限していた。

我々はこの限界を、水溶性・還元性アミノ基終端ハイパーブランチポリマー（NHBP）で GO を親水性・安定的 rGO（NrGO）に変換することで克服した。先行研究で NHBP が金属ナノ粒子を機能化しながら分散性を維持することを示している。

さらに、光熱キャリアに細胞毒性薬を担持させると、熱が腫瘍細胞をアブレーションするだけでなく薬物放出を加速し、化学療法と PTT を相乗させられる。ここでは、NHBP 修飾 rGO の合成、光熱特性、DOX 担持、pH/NIR トリガー薬物放出、HeLa 細胞に対する化学-光熱効果を報告する。

材料と方法

材料

グラフェン酸化物（GO、厚さ 0.8-1.2 nm、幅 0.5-5 µm）を XFNANO から購入。ドキソルビシン（DOX）を華峰聯合科技から購入。DMEM、FBS、トリプシン、ペニシリン（100 U/mL）、ストレプトマイシン（100 µg/mL）を Thermo Fisher Scientific から調達。MTT、DAPI、PI 試薬を Beyotime Biotechnology から購入。その他試薬は試薬級を Sinopharm Chemical Reagent から調達。

アミノ基終端ハイパーブランチポリマー（NHBP）の調製

NHBP は先行プロトコルに従い合成。簡略化すると、テトラエチレンペンタアミン（94 mL、0.5 mol）を 250 mL 三口丸底フラスコで窒素下攪拌。メチルアクリレート（43 mL、0.5 mol）のメタノール溶液を滴下、加熱冷却を繰り返し、室温で 4 時間攪拌。150 °C で旋回蒸発し、重量平均分子量約 7759 の黄褐色粘性ポリマーを得た。

NHBP 還元 GO（NrGO）の調製

GO を脱イオン水に分散し、NHBP を重量比 1:10, 1:20, 1:30 で超音波処理 10 分、90 °C で 1 時間攪拌。得られた懸濁液（NrGO-10, NrGO-20, NrGO-30）を遠心分離し、水で 3 回洗浄。

DOX 担持 NrGO（DOX@NrGO）の調製

NrGO 懸濁液と DOX 溶液を 1:1 重量比で混合、室温で 24 時間攪拌。遠心分離・洗浄で DOX@NrGO を回収。

特性評価と測定

透過型電子顕微鏡（TEM、JEOL JEM-2100）で形態観察。フーリエ変換赤外分光（FTIR、Nicolet iS10）を 400-4000 cm⁻¹（分解能 4 cm⁻¹）で測定。ゼータ電位と動的径を NanoBrook 90plus Zeta アナライザーで測定。UV-vis-NIR 吸収（400-900 nm、分解能 1 cm⁻¹）を Thermo Fisher Evolution 300 で記録。光熱性能は 808 nm レーザー（SFOLT）と熱電対温度計（DT-8891E）で評価。試料（0.2 mL）を 0.25 cm² スポットに滴下、1 W cm⁻² で 5 分間照射し、リアルタイムで温度変化を記録。

薬物放出アッセイ

DOX@NrGO を透析バッグ（MWCO 8000）に入れ、PBS（pH 7.4 または 4.0）中で 37 °C、100 rpm 撹拌下インキュベート。NIR 群では各サンプリング時点で 5 分間照射。各時点で 10 mL PBS を採取、同量の新鮮バッファーで置換、UV-vis 分光光度法で DOX 濃度を測定。

細胞毒性と化学-光熱評価

HeLa 細胞を 96 ウェルプレートに 5×10³ cells/well で播種、約 80% コンフルエントまで培養。NrGO（3.125-50 µg mL⁻¹）で 24 と 48 時間処理後、式（1）に従い MTT アッセイで生存率測定。DOX@NrGO（3.125-50 µg mL⁻¹）で 4 時間インキュベート後、808 nm レーザー（0.5 W cm⁻²）で 5 分間照射、さらに 20 時間培養。MTT で生存率評価、DAPI と PI 染色で共焦点顕微鏡下で細胞形態観察。

細胞生存率（%）= (OD_sample / OD_control) × 100%。

結果と考察

物理化学的特性評価

NHBP で GO を還元すると褐色懸濁液が黒色水分散液に変化、変換成功を確認。TEM 像（図 2）で NrGO-30 が凝集なしで単層シート構造を保持し、NHBP がグラフェン形態を損なわないことを確認。FTIR スペクトル（図 3）で GO の 1725 cm⁻¹ C=O ピークが消失し、1633 cm⁻¹ の C-N アミド信号が出現、NHBP の共有結合を確認。ゼータ電位測定（図 4）で GO の負電位から NrGO の正電位へシフト、表面機能化をさらに支持。UV-vis-NIR スペクトル（図 5）で全 NrGO 試料が NIR 窓で強い吸収を示す一方、GO と NHBP 単独では無視できる NIR 応答。動的径（図 6）は NHBP 比にかかわらず一定で、サイズ安定性を示す。

光熱特性

808 nm 照射下で水はほぼ加温せず、GO は <5 °C 上昇。対照的に NrGO 試料は 200 µg mL⁻¹ で 40-45 °C に到達、NHBP 比が高いほど温度上昇大（図 7）。温度上昇は NrGO 濃度とレーザー出力に比例し、治療窓（約 41-43 °C）を達成しつつ正常細胞を傷つけない。光熱サイクリング（図 7d）と照射後 UV-vis（図 8）で優れた安定性と光学特性保持を確認。

薬物送達挙動

DOX@NrGO からの DOX 放出は酸性（pH 4.0）と NIR 照射条件で顕著に促進（図 9）。酸性 pH で NHBP アミン基がイオン化し、DOX との静電結合が弱まり放出促進。NIR 加熱で分子運動が加速し、薬物拡散をさらに促進。したがって、DOX@NrGO は腫瘍微小環境に適した二重応答性を提供。

NrGO の細胞毒性

MTT アッセイ（図 10a）で 24 時間後、50 µg mL⁻¹ で 80% 以上の細胞生存率、低い固有毒性と薬物キャリアとしての適合性を確認。

相乗的腫瘍細胞抑制

DOX@NrGO 単独で HeLa 生存率を用量依存的に低下（図 10b）。NIR 照射（0.5 W cm⁻²、5 分）と併用で生存率が有意にさらに低下、化学-光熱相乗効果を実証。共焦点像（図 11）で DOX@NrGO では核が分散、照射で広範な細胞剥離を観察。PI 染色（図 12）で併用療法後に死細胞増加、増強された細胞毒性効果を裏付け。

結論

要約すると、強力な光熱変換とコロイド安定性を備えた簡便な水溶性 NHBP 修飾 rGO を開発した。DOX 担持で pH と NIR トリガー放出を付与し、DOX@NrGO システムが in vitro で優れた化学-光熱腫瘍細胞抑制を達成。これらの結果は、DOX@NrGO ががん治療や他の生物医学応用への汎用プラットフォームとして有望であることを示す。

略語

CLSM

共焦点レーザー走査顕微鏡

DAPI

4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインダール

DOX

ドキソルビシン

DOX@NrGO

DOX 担持 NrGO

FTIR

フーリエ変換赤外分光

GO

グラフェン酸化物

HBP

ハイパーブランチポリマー

MTT

メチルチアゾリルテトラゾリウム

NHBP

アミノ基終端 HBP

NIR

近赤外

NrGO

アミノ基終端ハイパーブランチポリマー還元グラフェン酸化物

PI

ヨウ化プロピジウム

PTT

光熱療法

rGO

還元グラフェン酸化物

SEM

走査型電子顕微鏡

TEM

透過型電子顕微鏡