アルツハイマー病のバイオマーカーとしてのコレステロール検出のための磁性ナノ粒子に基づく新しい造影剤

背景

いくつかの研究は、神経細胞膜に適切な量のコレステロール（CHO）が存在することが、アルツハイマー病（AD）におけるβ-アミロイドタンパク質の過剰産生に対抗するβ-アミロイドタンパク質の毒性から神経細胞を保護する上で重要な役割を果たすことを示しています。 [1,2,3]; CHOが豊富なニューロンは、酸化ストレスおよびβ-アミロイドタンパク質の毒性に対してより耐性があります[4、5]。

したがって、神経細胞膜に存在するCHOの量は、その血漿レベルだけでなく、神経変性疾患の病因にも関与している可能性があると考えられます[6]。実際、実験データは、毒性物質に対する保護バリアを作成するために、細胞膜に最適な量のCHOが必要であるという考えを支持しています。原形質膜中の細胞CHOの量が減少すると、この保護バリアが変化し、β-アミロイドタンパク質などの毒性物質に対する保護が低下します[7]。興味深いことに、トランスジェニックADマウスの大脳皮質のニューロンは、野生型マウスのニューロンよりも原形質膜に含まれるCHOが少ない[8]。

森ら[9]は、ヒトとトランスジェニックアミロイド前駆体タンパク質（APP）マウスの両方で、CHOが成熟したアミロイド斑に異常に蓄積するが、びまん性または未成熟の斑には蓄積しないことを示し、CHOが老人斑の形成と進行に役割を果たす可能性があることを示唆しています。他のその後の研究では、CHOとアポリポタンパク質Eが線維性プラークのコアに存在するが、初期のびまん性プラークには存在しないことがわかった。疾患のより進行した段階では、コレステロールオキシダーゼに対して免疫陽性の線維性プラークの数が多いことが報告されています[10]。質量分析によって決定された老人斑あたりの遊離CHOの量は、β-アミロイドタンパク質負荷と同様でした[8]。 ADにおけるCHOと老人斑の濃度のこの相互の増加は、この病気の新しい病因メカニズムを示唆している可能性があります[11]。さらに、AD患者の脳組織では、線維性老人斑と共局在する脂質沈着物が、チオフラビン-S染色サンプルでの抗ストークスラマン散乱および2光子蛍光顕微鏡を使用して説明されています[10]。 2つの脂質形態を観察することができます：ラメラ構造とサブミクロンサイズの合体マクロ凝集体。脂質の組成/組織はプラーク全体で異なるため、線維性老人斑におけるアミロイドと脂質の密接な相互作用の明らかな証拠があり、以前考えられていたよりも動的な組成になっています[12]。

さらに、疾患の初期段階でADのバイオマーカーを検出するために、いくつかの研究では、老人性プラークの磁気共鳴画像法（MRI）の特定の造影剤として機能化磁性酸化鉄ナノ粒子（MNP）を使用することが提案されています[13、14、 15]およびフェリチンタンパク質[16]の検出。 T2およびT2 *加重シーケンスでこれらの粒子によって示される低強度効果は、MRI画像でより大きなコントラストを提供します。したがって、MRIの造影剤としてMNPを使用することは、ADの早期診断のための有望な方法です。

本研究は、ADの潜在的なバイオマーカーとして使用できる老人斑におけるCHOの異常な蓄積をMRIで検出するために、生体機能化MNPに基づく新しいコントラストを使用するという仮説を提示します。

本研究は、私たちの知る限り、老人斑におけるCHOの異常な蓄積をMRIで検出するための生体機能化MNPに基づく新しい造影剤の設計を初めて提示します。これはADの潜在的なバイオマーカーとして使用できます。 。

仮説

何年にもわたって世界人口のADの発生率が高く[17]、国の健康および社会的観点から病理学に関連する費用がかかるため[17]、早期のバイオマーカーの検出を可能にする非侵襲的ツールの開発が急務です。病気の診断と進化。

早期診断法の中で、分子イメージング（MI）用の造影剤の開発が特に有用になります。 MIは、従来のイメージング技術と分子プローブを組み合わせたもので、疾患の進行と治療反応の根底にある生化学と細胞生物学の側面を検出するように設計されています[18、19、20]。

ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされ、ストレプトアビジンで機能化されたMNPに基づく造影剤の合成を提案します（図1a）。これにより、老人斑（NANOCHOAD）に存在するCHOを特異的に認識するビオチン化抗体の方向性リンクが可能になります（NANOCHOAD）（図1b）。抗体はまた、細胞原形質膜に存在するCHOを認識し、ニューロンの原形質膜におけるCHOの減少を検出します。 MNPはPEG鎖でコーティングされ、ナノプラットフォームのコロイド安定性を改善し、血流への分散と血液脳関門（BBB）の通過を促進します[21]。

設計されたナノプラットフォームとその作用メカニズムの概略図。 a MNPの構造、および抗CHO抗体（NANOCHOAD）による機能化、 b BBBを介したナノプラットフォームの浸透のための戦略、 c NANOCHOADのBBBを介した交差メカニズム。 d アミロイド斑上のCHO沈着物を標的とするナノコンジュゲート抗CHO-MNP

BBBは、神経疾患の治療と診断で遭遇する最も排他的な生物学的障壁の1つであり、全身経路を介した脳へのほとんどの診断薬と治療薬のアクセスを制限します[22、23]。したがって、多数の脳障害の診断と治療における課題は、BBBを介して治療薬と造影剤を送達して脳の具体的な領域を標的にすることの難しさを克服することです。幸いなことに、脳の毛細血管内皮細胞は、いくつかの特定の受容体を介した輸送メカニズムを示しています。多数のトランスフェリン受容体が脳の毛細血管内皮細胞によって発現され、BBBを介した受容体を介したトランスサイトーシスに関与していることが報告されています[24]。

したがって、造影剤をBBBに通すという問題を解決するために、次の3つの代替戦略を提案します。（i）抗CHO-MNPをトランスフェリンと結合させる[25]。 （ii）抗CHO-MNPsコンジュゲートの鼻腔内投与。非侵襲的でBBBをバイパスする鼻腔内経路は、ナノコンジュゲートを脳に送達するための代替経路です[26、27]。 （iii）ナノコンジュゲートがBBBを通過するのを容易にするための外部磁場の適用（図2c）。この新しい送達技術は、BBBを介して脳（嗅覚野、皮質、海馬など）に臨床的に適切な投与量を送達することができます[28、29、30]（図1c）。さらに、ナノコンジュゲートがBBBを通過することは、PEGでコーティングされたMNPの使用と、病状自体によるBBBの劣化の両方によっても促進されます。ナノコンジュゲートは、抗原抗体の親和性によって、老人斑におけるCHOの異常な沈着を特異的に認識します（図1c、d）。老人斑としての脳実質の病理学的構造におけるナノ粒子の蓄積は、AD脳実質におけるCHO局在の変化を示している。したがって、老人斑に関連する抗CHO-MNPの存在は、T2 *加重MRIで低信号を示し、老人斑などの他の確立されたADの特徴に関連するCHOの検出を可能にし、したがってMRイメージングを可能にします。脳のCHOは、この病気の新しいバイオマーカーになる可能性があります。さらに、CHO原形質膜の減少によるMRIの変化が予想されます。

仮説をテストするための実験計画。まず、invitro（ a ）：合成されたナノコンジュゲートの生体適合性の決定。エクスビボ試験（ b ）：5XFADトランスジェニックマウスの固定脳スライス上でナノプラットフォームをインキュベートすることにより、抗CHO-MNPナノコンジュゲートの特異性をテストします。インビボ研究（ c ）：ナノプラットフォームは、静脈内または鼻腔内送達/外部磁場の適用として代替経路によって注入され、その有効性（ターゲティング）はMRIによって評価されます

脳実質からの造影剤のクリアランスは、以前の研究で実証されているように、ミクログリア細胞によるMNPの内在化とそれに続くリソソームプロセシングによって達成することができます[16、31、32]。 MNPは、内因性鉄の代謝に使用される一般的な経路によって排除されます。それにもかかわらず、造影剤のサイズと表面電荷に基づく除去経路、およびそれらの潜在的な毒性は、以下に詳述するように、提案された仮説の開発中に決定されます。

仮説のテスト

磁性ナノ粒子の合成と特性評価

酸化鉄ナノ粒子の合成は、Predescu et al。の研究に従って、アルカリ性溶液中で第一鉄イオン（Fe2 +）と第二鉄イオン（Fe3 +）を混合することにより、制御された共沈法を使用して実行されます。 [33]。 MNPは、Liu etalによって以前に確立されたプロトコルに従ってPEGシェルでコーティングされます。 [34]。

PEGでコーティングされた鉄ナノ粒子の構造、形態、および磁気は、X線回折（XRD）、走査型電子顕微鏡（SEM）、透過型電子顕微鏡（TEM）、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、および超伝導量子干渉デバイス（SQUID）磁気測定。

合成された磁性ナノ材料の特性評価後、NHS / EDC法により（1）ストレプトアビジンタンパク質で官能化されます。この後、ビオチン化抗CHO抗体および（2）トランスフェリンタンパク質に結合します。トランスフェリン結合は、リガンドの表面に存在するカルボキシル基とPEGコーティングに存在するヒドロキシル基を結合することによって実行されます[35]。

インビトロ試験

最初のステップでは、ナノプラットフォームの生体適合性をin vitroでテストします（図2a）。ナノコンジュゲートは、ニューロンと星状細胞の共培養および内皮細胞培養[36]に追加され、典型的な脳細胞とのナノコンジュゲートの適合性を決定します。機能化されたMNPの細胞適合性が正しい場合、システムの有効性は、疾患のex vivoモデルでテストされます（図2b）。選択されたモデルは、5つの家族性AD変異（5XFAD）を共発現し、ADに見られるものと同様のアミロイド斑の病理を示すAPP /（プレセニリン-1）PS1ダブルトランスジェニックマウスです[37]。

5XFADトランスジェニックモデルにおける老人斑周辺のCHOの蓄積は、免疫組織化学によって評価されます。

モデルが有効である場合、老人斑におけるCHOの蓄積が実証されたら、合成されたナノコンジュゲートの特異性をテストすることが提案されます。そのためには、最初に5XFADトランスジェニックマウスから固定脳スライスを取得し、次に5XFADマウスの固定脳切片で抗CHO-MNPをインキュベートして、ナノコンジュゲートの結合を試みます。ナノコンジュゲートの特異性は、抗CHO-MNPと5XFAD脳切片に存在するCHO沈着物および老人斑との共局在を評価し、適切な制御を行うことによって決定されます。 5XFADで明らかなコレステロールの蓄積が検出されなかった場合、アミロイド前駆体タンパク質マウスモデル（APP _sw ）、ADのマウスモデルが使用されます。このモデルでは、アミロイド斑と明確に関連するCHOの蓄積が海馬で報告されているためです[9]。

インビボテスト

コンジュゲートの特異性が実証されると、invivoでのナノコジュゲートの生体適合性分析が実行されます。ナノプラットフォームは、さまざまな用量（25〜100 mg / kg [38]）で静脈内注射され（図2c）、研究期間中の亜急性毒性は、死亡率、萎縮の証拠を観察することによって分析されます。 、うっ血、炎症、またはマウスの全体的な行動の変化。体に対する各臓器の重量係数が計算されます。腎臓の毒性は、血中の尿素窒素とクレアチニンのレベルによって決定されます。血中の総ビリルビンおよびアルカリホスファターゼのレベルは、肝臓および胆汁の機能性の尺度としてテストすることができます。さらに、赤血球、白血球、ヘモグロビンのレベルの変化を評価するための尿酸のレベルと血液学的研究が決定されます。最後に、起こりうる毒性作用をより詳細に検索するために、さまざまな組織（腎臓、肝臓、脾臓、脳、または肺）の組織学的検査が行われます[39]。血液、尿、およびさまざまな臓器における機能化されたMNPの位置は、抗CHO-MNP注射の24時間後、72時間後、1週間後、2週間後、および1か月後に分析されます。

MNPの適切な濃度が決定されると、ナノプラットフォームがコントロールマウスと5XFADマウスに注入され、その有効性がMRIによって評価されます（図2c）。ナノプラットフォームの抗体がinvivoシステムの抗原を認識しない場合、MNPはフェニルジインコレステロールで機能化される可能性があります。これは、以前の研究でCHO蓄積にinvivoで結合できることがわかっている化合物です[40]。 。このナノコンジュゲートの生体適合性は、MNP-CHOナノコンジュゲートについて上記のように評価されます。静脈内投与経路がBBBを通過するのに効果的でない場合は、鼻腔内送達または外部磁場の適用として代替投与経路が提案されます（図2c）。

仮説の意味

MRIによってinvivoでADを検出するための生体機能化MNPの使用は、MNPをさまざまなペプチド（Aβ1-40[41]、Aβ1-30[42]、Aβ1-42[15]）に結合させることにより、これまでの多くの研究で広く実証されています。 、および抗Aβ-1-42抗体[43]。 ADの動物モデルに静脈内投与した後、老人斑と血管アミロイド沈着物（コンゴ親和性血管症）の両方がMRIによって検出されました。ただし、使用されるアミロイドペプチドのフラグメントは神経毒性があるため、これらのナノコンジュゲートはそれ自体が毒性があります（Aβ1-40、Aβ1-42）。さらに、サイズが大きいため、BBBの通過を促進する化合物の同時投与が必要です。

NANOCHOADは、2つのAD特異的バイオマーカーの同時局在化を可能にする造影剤として機能します：アミロイド斑と脳の白質におけるCHOの喪失[44]、毒性を回避します。その構造にPEGが存在するため、BBBを介したナノプラットフォームの通過も促進されます[43]。

見てわかるように、これらの特性のほとんどの研究は、老人斑の検出に向けられています。老人斑は、ADの主要なバイオマーカーの1つですが、唯一ではありません。最近、MNPに基づくナノコンジュゲートによってフェリチン、したがって鉄鉱床が検出された論文が発表されました[16]。ただし、フェリチンを検出するためのこの造影剤は、MRIによって検出されず、脳の特定の場所での定量化によってのみ検出されるため、感度が低くなります。脳内の白質の喪失は大規模な現象であり[44]、局所的ではありません。したがって、提案された造影剤は、ADバイオマーカーの早期検出に対してより感度が高い可能性があると考えられています。疾患の初期段階でADに関連する他のバイオマーカーを効率的に検出できる新しい造影剤の開発を促進する必要があります。

一方、提案されたナノコンジュゲートの組成は、静脈内注射された造影剤の有効性を克服するための2つの主要な障害を解決する可能性があります。 PEG鎖によるナノプラットフォームの機能化は、血流中のナノコンジュゲートのコロイド安定性を保証します[15、21]。一方、BBBを通過する戦略として、MNPとペプチドトランスフェリンの結合[25]は、BBBにある特定の受容体によるトランスフェリンの認識を促進し、ナノコンジュゲートがBBBを通過してその最終標的に結合できるようにします。 。この事実は、ナノシステムのサイズの縮小とAD患者のBBBの変化と相まって、BBBを介したナノコンジュゲートの通過を促進します。

記載されているナノコンジュゲートの設計は目新しいため、生体適合性とナノプラットフォームの投与量を詳細に研究する必要があります。特に、生物の造影剤の除去経路を決定する必要があります。

略語

AD：

アルツハイマー病

BBB：

血液脳関門

CHO：

コレステロール

MI：

分子イメージング

MNP：

磁性酸化鉄ナノ粒子

MRI：

磁気共鳴画像法

PEG：

ポリエチレングリコール