HER2標的磁性ナノセンシタイザーによるHER2陽性がんのインビボMRI増強

概要

本研究の目的は、高磁気感度を持つヒト上皮成長因子受容体2（HER2）標的型磁気共鳴画像（MRI）造影剤の開発である。抗HER2アプタマー修飾磁性ナノセンシタイザー（Apt_HER2-MNS）を、5'-チオール修飾アプタマーとマレイミド基導入磁性ナノ結晶（MNC）の共役により調製した。Apt_HER2-MNSの物理化学的特性と標的能を確認し、HER2タンパク質への結合親和性（K_d）は0.57 ± 0.26 nMであった。3T臨床MRI装置を用いたHER2陽性がん細胞（NIH3T6.7）移植マウスモデル（n=3）でインビボMRI造影増強能を検証。非標識MNCを用いた対照実験も実施。Apt_HER2-MNS投与後のT2強調MRI画像で、腫瘍領域において最大150%の造影増強が得られた。

背景

ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）は上皮成長因子受容体（EGFR）ファミリーに属し、ヒト悪性腫瘍で重要な役割を果たし、ヒト乳がんの約30%で過剰発現し、胃、膀胱、卵巣、肺癌などでも過剰発現する。HER2過剰発現乳がん患者は非過剰発現患者より生存率が著しく低く、転移も増加する。したがってHER2はがん診断の重要バイオマーカーである。臨床ではエストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）とともに乳がん診断の典型的マーカーとして用いられる。しかし、組織学的検証は侵襲的で限られた病変でのみ可能。そのため、CT、PET、SPECT、MRI、マルチモーダル画像などで非侵襲的に診断マーカーを可視化する研究が進められている。

酸化鉄ナノ粒子（IONP）は、ガドリニウム系造影剤（GBCA）やニッケル・コバルト含有剤より高い磁気感度や生体適合性を持つため、分子画像に適している。特に、市販MRI造影剤やGBCAはGd³⁺イオン遊離によるインビボ毒性が問題だが、IONP系造影剤は鉄に分解・吸収・排泄されるためインビボ安全性が高い。

IONPを分子画像に応用するには標的モエティが極めて重要で、化学物質、糖類、タンパク質、抗体、アプタマーなどが用いられる。中でもアプタマーは、特定分子に高い結合親和性と特異性を持つ安定した一本鎖核酸の三次元構造を持つ。アプタマーの高親和性は、系統的リガンド進化（SELEX）による開発技術に起因する。SELEXでは、化学合成で提供される巨大なランダム配列オリゴヌクレオチドライブラリ（~10¹⁵）から並列スクリーニングで高親和性アプタマーを見出す。結果、アプタマーは一般的にピコモラー濃度レベルの高親和性を持つが、他の生体分子はマイクロモルからサブナノモル範囲である。近年開発された第3世代アプタマーは、修飾核酸使用でDNase/RNase耐性が向上し、インビトロ/インビボ安定性も備える。これらの理由でアプタマーは分子画像研究で好ましいモエティとして台頭している。

本研究の目的は、高磁気感度を持つ磁性ナノ結晶（MNC）ベースのアプタマー修飾T2造影剤を開発し、HER2過剰発現がん細胞に高特異性を持たせることである。熱分解法でMNCを調製し、HER2特異的アプタマー（K_d=0.42 nM）を用いた。合成造影剤の形態、磁化特性、磁気緩和率を解析し、HER2タンパク質に対するインビトロ/インビボ標的アッセイを、HER2発現がん細胞株移植腫瘍キセノグラフトモデルで実施した。

方法

材料

TWEEN® 80（T80）、4-(ジメチルアミノ)ピリジン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、トリエチルアミン、無水ジクロロメタン、アセチルアセトン酸鉄(III)、1,2-ヘキサデカンジオール、ドデカン酸、ドデシルアミン、ベンジルエーテルはSigma-Aldrich（米国）から、3-マレイミドプロピオン酸（MPA）はTCI America（米国）から購入。RPMI-1640、DMEM、胎児牛血清、Gibco®抗生物質・抗真菌剤溶液はLife Technologies（米国）から。NIH3T6.7はAmerican Tissue Type Culture（米国）から。ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水はバイオセサン（韓国）から。チオール修飾抗HER2アプタマー[Apt_HER2、配列: 5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6: NapdU)、5'-SH修飾、40-mer]はAptamer Science Inc.（韓国）から購入。

MNCの合成

単分散磁性酸化鉄ナノ粒子をSunの熱分解法で合成。これらは鉄(III)アセチルアセトネートとオレイン酸前駆体を用いるためMNCと呼ばれる。簡単に説明すると、鉄(III)アセチルアセトネート（2 mmol）、オレイン酸（6 mmol）、1-オクタデセン（6 mmol）、1,2-ヘキサデカンジオール（10 mmol）、ベンジルエーテル（20 mL）を三口丸底フラスコに入れ機械攪拌。残留酸素と水を除去するため100°Cで30分予熱。その後200°Cで2時間、300°Cで30分還流（窒素流下）。冷却後、過剰エタノールで精製。遠心分離を3回繰り返し未分散残渣から製品を分離。Fe₃O₄ナノ粒子製品を5 mLヘキサンに再分散。上記手順を100 mg Fe₃O₄とその前駆体で繰り返し最終製品を合成。MNC形態は高分解能透過電子顕微鏡（HR-TEM、JEM-2100、JEOL、日本）で評価。飽和磁化は振動試料磁力計（VSM、MODEL-7300、Lakeshore、米国）で室温測定。製品中のMNC量は熱重量分析（SDT-Q600、TA Instrument）で重量測定し、Fe₃O₄含有率が約80%になるまで洗浄。

マレイミド基導入TWEEN® 80の合成

マレイミド基導入T80（Tm80）調製のため、MPA 15.3 mmolとN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 22.9 mmolをそれぞれ10 mLジクロロメタンに溶解し混合。この混合物をT80 7.6 mmolを含む20 mLジクロロメタンに加え、さらにトリエチルアミン 3.2 mLを添加。最後に4-(ジメチルアミノ)ピリジン 22.9 mmolを10 mLジクロロメタンに溶解し、全試薬を70 mLバイアルで混合。マグネット攪拌で48時間反応。混合物の色がアプリコットから赤ワイン色に変化。48時間後、析出した尿素をろ過除去。ロータリーエバポレーター（N-1100、EYELA、日本）でジクロロメタンを蒸発除去。生成物を脱イオン水に懸濁し、透析（Spectra/Por®、1 kDa MWCO、Spectrum Laboratory Inc.、米国）で未共役試薬を除去。凍結乾燥で最終製品を調製。合成Tm80はUV-Vis分光光度計（UV-1800、島津製作所、日本）、フーリエ変換赤外（FT-IR）分光計（PerkinElmer、spectrum two）、¹H-NMR分光計（Bruker Biospin、Advance II、補足ファイル1: 図S1参照）でMPAとT80との比較確認。

マレイミド基導入MNCの調製

水分散性マレイミド基導入MNC（mWMNC）をナノエマルション法で調製。簡単に説明すると、Tm80 100 mgを20 mL脱イオン水に完全溶解し、MNC 20 mgを含む4 mL n-ヘキサンを超音波（190 W）と攪拌（1200 rpm）下でTm80溶解水に急速注入。エマルション処理を氷冷浴で10分継続。残留有機溶媒を室温で12時間蒸発、透析（Spectra/Por®、3.5 kDa MWCO、Spectrum Laboratory Inc.、米国）で3日間余剰界面活性剤除去。mWMNCを遠心濾過（NMWL 3000、Amicon® Ultra、Merk Milipore、ドイツ）で1.25 mg_Fe/mL（DEPC処理水）に濃縮。T80被覆MNC（WMNC）も同法で調製。

Apt_HER2-MNSの調製

mWMNCと抗HER2アプタマーの共役前に、チオール修飾アプタマーの還元ステップを実施。簡単に説明すると、アプタマー 1 nmolを0.3 mL脱イオン水に溶解し、トリエチルアミンアセテートと1,4-ジチオトレイトール溶液を添加し最終濃度をそれぞれ50、25 mMに。室温で1.5時間振盪し、エタノール沈殿で精製・脱塩。Apt_HER2-MNS、HER2特異的MRIプローブ調製のため、MNC分子量を理論計算（補足ファイル1: 図S2参照）し、mWMNCとアプタマーの混合比を1:7に設定。したがって、100 µg（Fe）mWMNC（Fe₃O₄換算、45 pmol）をPBS（1 mL）に溶解し、アプタマー 5 µg（0.35 nmol）を添加。室温で5分攪拌後、4°Cで2時間インキュベート。Apt_HER2-MNSの動的径分布を動的光散乱分析装置（ELS-Z、大塚電子、日本）で解析。MRI造影剤としての能力確認のため、1.5 T臨床MRI装置とマイクロ-47表面コイル（Intera、Philips Medical System、オランダ）を用い、様々な濃度のApt_HER2-MNSファントムでT2緩和率（R2）解析を実施。R2はCarr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）シーケンスで室温測定：TR=10 s、12 ms等間隔エコー32回、獲得数=1、点分解能=156×156 µm、スライス厚=0.6 mm。R2は1/T2（s⁻¹単位）で定義。

Apt_HER2-MNS結合親和性アッセイ

HER2特異性検証のため、ニトロセルロースフィルター結合法を使用。裸Apt_HER2とApt_HER2-MNSをアルカリホスファターゼ（New England Biolabs、MA、米国）で脱リン酸化。アプタマーの5'または3'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼと[³²P]-ATP（Amersham Pharmacia Biotech、NJ、米国）で標識。結合アッセイは、³²P標識アプタマー 10 pMを、選択バッファー（20 mM Tris·HCl、pH 7.5、4°C、6 mM NaCl、5 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM Na₃EDTA、10% v/v グリセロール）中でHER2タンパク質（100-10 pM濃度範囲）と37°C、30分インキュベート。混合物をG-50カラム（GE Heathcare Life Science、英国）でろ過し遊離放射性同位体を除去。ろ過混合物を再利用フィルムで現像し、HER2タンパク質結合アプタマー割合をホスファイメージャー（Fuji FLA-5100 Image Analyzer、東京、日本）で定量。非特異的背景結合の影響を除くため、³²P標識アプタマーのみで実験し生データを補正。

インビボMRI

全動物実験はAssociation for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care Internationalの承認下で実施。インビボMRIスキャンは相合マウス腫瘍モデルで実施。5週齢雌性BALB/cヌードマウス大腿部にNIH3T6.7細胞（1.0×10⁷ cells）を移植し生成。2週間後、MRIで腫瘍サイズ評価。腫瘍サイズが約500 mm³に達した時点で、Apt_HER2-MNS 100 µg（5 mg/kg）を尾静脈注射。インビボMRI実験は3.0 T臨床MRI装置と8チャネル人間手首コイルで実施。3.0 TでのT2強調MRIパラメータ：TR/TE=1054/70 ms、獲得数=2、点分解能=400×319 mm、スライス厚=1 mm、TSE factor=8。対照実験はWMNCで同法実施。全T2信号強度は各マウスモデル（n=3）のT2強調MRI画像に描かれた約5つのROI平均で算出。R2（またはR2*）値、T2の逆数を信号強度解析に使用。相対信号強度の経時変化を注射前信号強度で正規化。ROI内ボクセルのR2信号強度ヒストグラム解析も実施。

組織学的解析

腫瘍組織中のFeイオン検出にプルシアンブルー染色を用い、インビボMRI後の各腫瘍モデルから採取した腫瘍組織でApt_HER2-MNSのHER2発現がん標的能を確認。採取腫瘍組織を10%ホルマリン溶液で24時間固定、エタノール濃度勾配脱水とHisto-Clear®（National Diagnotics、米国）透明化後パラフィン包埋。組織切片（厚さ5 µm）をガラススライドにマウントし、Histo-Clear®と濃縮エタノールで脱パラフィンと水和。プルシアンブルー作業液（10%フェロシアン化カリウムと20%塩酸溶液=1:1）で1時間染色。核をNuclear Fast Red染色液（Sigma Aldrich、米国）で染色。30分間3回洗浄後、マウント剤2-3滴を滴下しカバースリップで覆う。染色組織切片をOlympus BX51とOlyviaソフトウェア（Olympus、日本）で観察。

結果と考察

Apt_HER2-MNSは、IONPベースの単一分子標的剤として、MRIを用いたHER2発現腫瘍の分子画像化向けに設計された。したがって、標的分子への高特異性と大きな磁気感受性が必要。まず高磁気感度を得るため、熱分解法と種成長法で単分散Fe₃O₄ナノ粒子であるMNCを合成。Apt_HER2-MNSの調製とインビボ応用手順を図1に示す。まずHR-TEMでMNCのサイズと形状を確認（図2a,b）。図2cではTEM像からランダムに選択した130個のMNCで平均サイズを測定、非常に狭いサイズ分布（10.49 ± 1.74 nm）と球形を観察。MNCの超常磁性もVSMで評価、飽和磁化値98.8 emu/g_Feを得た（図2d）。静脈投与可能な現在のT2造影剤は超常磁性酸化鉄（SPIO）または超微小超常磁性酸化鉄（USPIO）ベース。SPIO/USPIOも超常磁性だが飽和磁化は70 emu/g_Fe未満。超常磁性は磁場中でのみ磁性を示し凝集を防ぐため、IONPを静脈造影剤として用いるために必要。さらにMNCの高い飽和磁化は、SPIO/USPIOベース造影剤より投与量削減に有利。

インビボ実験用にMNCを用いるため、WMNCとmWMNCをT80またはTm80を用いたナノエマルション法で調製。調製Tm80とその前駆体MPA、T80の物理化学的特性を吸収、FT-IR、¹H-NMRスペクトル解析で確認（補足ファイル1: 図S1参照）。先行研究通り、Tm80を用いたナノエマルション法で調製したmWMNCは水中で安定分散。さらにmWMNCのマレイミド基は中性pHチオール基を持つ分子と容易に共役可能で副生成物を生成しない。またNapdU修飾アプタマーを用いてインビボ半減期を延長、ヒト血清中で151時間（補足ファイル1: 図S3参照）。Apt_HER2-MNSはmWMNCとApt_HER2-SHの共役で調製、動的光散乱とMR緩和率解析で動力学的特性を評価（図3）。WMNCとApt_HER2-MNSの直径はそれぞれ28.8 ± 7.2 nm、34.1 ± 8.2 nm（図3a）。Apt_HER2は40-merオリゴヌクレオチドで約5-10 nm長のため、動的径の差の原因となりうる。WMNCとApt_HER2-MNSの緩和率はそれぞれ265.7、257.2 mM⁻¹_Fe s⁻¹（図3b）、MRI造影剤としての磁気感度を確認。FDA承認のSPIO/USPIOベースT2造影剤は共沈法合成が多く、結晶性低下で磁場下での緩和率は190 mM⁻¹_Fe s⁻¹未満。本研究ではMNC使用により、Apt_HER2-MNSはSPIO/USPIOベース剤比35-500%高い磁気緩和率を達成。

Apt_HER2-MNSのHER2タンパク質結合親和性をフィルター結合アッセイで評価（図4a）、Apt_HER2-SHとApt_HER2-MNSのK_d値はそれぞれ26.88 ± 8.24、0.57 ± 0.26 nM（図4b,c）。裸Apt_HER2-OHはK_d=0.42 ± 0.05 nMでHER2タンパク質に極めて高い特異性、この親和性はHerceptin®の5 nMより約10倍高い。しかし、裸Apt_HER2の結合親和性は化学物質、分子、ナノ粒子との共役で変化しうる。したがってmWMNCとの共役後も評価が必要。Apt_HER2-SHのHER2親和性はチオール基存在により裸Apt_HER2より低下（チオール基がタンパク質中の他チオール残基やチオール修飾アプタマーと結合しうるため）。しかし、Apt_HER2-MNSの親和性はApt_HER2と類似、これは非結合Apt_HER2-SHがアプタマー-HER2相互作用を阻害するほど存在しないか、mWMNCがアプタマー親和性にほぼ影響しないことを意味する。

インビボMRI実験を相合マウス腫瘍モデルで実施し、Apt_HER2-MNSのHER2過剰発現腫瘍標的能を評価。NIH3T6.7細胞移植大腿部腫瘍モデルで、WMNCまたはApt_HER2-MNS注射前から120分後までMRI実施（図5、補足ファイル1: 図S4も参照）。IONPベース造影剤のT2造影効果は周囲プロトンのT2短縮により画像暗黒化として観察。したがって信号強度解析ではT2またはT2*値をR2またはR2*で表現。R2はT2の逆数で正値比較に使用。WMNCの場合、注射30分後に最高R2信号強度、その後漸減（図5a,b）。WMNC注射120分後ではT2信号強度は注射前状態に類似。R2信号強度平均値の変化率は10%未満、T2強調MRIで肉眼識別困難。先行研究では標的モエティなしでもT80被覆酸化鉄ナノ粒子が腫瘍組織周辺に蓄積することを実証。しかしその研究ではT2強調MRIでマウスあたり1.4 mg_Feの造影剤用量を使用、本研究の14倍。これはWMNCが0.1 mg_Fe/マウス（5 mg_Fe/kg）用量では有効な造影増強効果を示せないことを意味する。R2*信号強度の経時変化も10%未満で統計的有意差なし。対照的に、Apt_HER2-MNSではWMNCと同用量注射にもかかわらず、注射120分後に注射前比130%高い信号強度増強を観察（図5c,d）。この投与用量はアプタマー修飾磁性ナノ粒子ベース造影剤に関する他研究の2-30分の1。この結果はApt_HER2-MNSがWMNCや他アプタマー修飾造影剤より高い標的能を持ち、WMNCより低用量でも高造影増強効果が期待できることを示唆。造影増強は主に腫瘍組織の末梢血管と中心部に出現。末梢血管はApt_HER2-MNS注射直後に暗黒化、腫瘍病変中心部の造影増強は60分後に初出現し120分まで増大傾向。

注射前後での造影増強効果の可視的変化を強調するため、T2強調MRI画像のROIでR2信号強度のヒストグラム解析を実施（図5e）。T2信号はT2強調MRIで負の増強として現れるためR2で表現。Apt_HER2-MNS注射後、ヒストグラムの中心が右側にシフト。ヒストグラム中心の差から約10%の造影増強増加を確認。

Apt_HER2-MNSの腫瘍内存在を組織学的に確認するためプルシアンブルー染色を実施（図5f）。プルシアンブルー染色組織では核と細胞質が濃淡ピンク、腫瘍細胞周辺に青色ドットが複数観察。Apt_HER2-MNSが腫瘍を標的とすれば組織が青色染色されると想定。プルシアンブルー染色結果で腫瘍組織に青色ドット観察、Apt_HER2-MNS組織スライドはWMNCの約3倍の青色ドット数。プルシアンブルー染色は組織中Feイオン検出可能で、IONPベース造影剤の腫瘍組織蓄積確認に用いられる。

結論

結論として、物理化学的キャラクタリゼーションとHER2発現マウス腫瘍モデルでのインビボMRI実験により、Apt_HER2-MNSがインビボHER2標的型MRI造影剤として機能することを確認した。Apt_HER2-MNSはHER2への高緩和率と特異性を持ち、鉄酸化ナノ粒子により他T2造影剤より低投与量で顕著な造影増強効果を示した。この造影剤はがん患者のHER2発現情報を提供し、HER2標的薬による化学療法中のHER2陽性がん患者モニタリングに利用可能。本成果がHER2過剰発現がん診断と患者治療の有望な戦略を提供することを期待する。