BiF₃@Ln（Gd、Yb、Er）PVPコートナノ粒子の迅速合成：低毒性CTイメージングへの応用

概要

X線CT（コンピュータ断層撮影）は臨床で広く使用されており、正常組織と病変組織のCTイメージングコントラストを高めるためにヨード造影剤（イオヘキソールなど）がよく用いられる。しかし、これらの造影剤には毒性がある場合がある。したがって、新しいCT造影剤が緊急に必要とされている。ビスマスは高原子番号（Z=83）、低コスト、良好な生物学的安全性、優れたX線減衰特性（100keVで5.74cm²/kg）を持つため、ナノサイズCT造影剤分野で研究者から大きな関心を集めている。ここでは、平均粒子径約380nmのBiF₃:Ln@PVPナノ粒子（NP）を合成した。ポリビニルピロリドン（PVP）でコーティング後、BiF₃:Ln@PVP NPは良好な安定性と優れた生体適合性を示した。一方、臨床用造影剤イオヘキソールと比較して、BiF₃:Ln@PVP NPは優れたin vitro CTイメージングコントラストを示した。その後、BiF₃:Ln@PVP NPを腫瘍部位に局所注射すると、注射後の腫瘍部位のCT値が注射前より有意に高かった（注射前48.9HU、注射後194.58HU）。経口投与後、時間経過とともに消化管（GI）管の形態が明確に観察できた。最終的に、BiF₃:Ln@PVP NPは経口投与後48時間以内にマウスのGI管から完全に排泄され、GI管に明らかな損傷はなかった。要約すると、容易に合成可能なBiF₃:Ln@PVP NPは潜在的な臨床用造影剤として使用でき、CTイメージングにおける広範な応用展望を持つ。

はじめに

X線CTは、高分解能と低価格で内部組織や器官を断面的にイメージングできる[1,2]。したがって、呼吸器疾患、消化器疾患、泌尿器系疾患の診断に重要な手段となっている[3-8]。しかし、CTでは病変組織と正常組織のコントラストが低い場合がある。そこで、イオヘキソールなどの造影剤が臨床で広く用いられ、病変組織のX線減衰を特異的に高めている。しかし、CT検出器の感度が低いため、臨床用造影剤は大量投与されることが多い[9]。さらに、市販のヨードベース造影剤は体内での代謝が極めて速く、心臓発作や腎毒性などの重篤な副作用があり、これらが臨床使用を制限しており、緊急に解決が必要である[10-15]。

ナノ材料は環境修復、光起電力応用、触媒などで広い応用展望を示している[16-21]。例えば、Balatiら[22]はパルスレーザー液中アブレーション（PLAL）とマイクロ波照射を用いてヘテロ構造光触媒（HBTiO₂/RBIHM-MoS₂）を合成した。ナノ材料は医療分野でもイメージングや治療に広く使用されている。

金（Au）、タンタル（Ta）、白金（Pt）などX線減衰が高い元素が研究者の関心を集め、これらの元素から合成されたナノ材料がCTイメージング用潜在造影剤として十分研究されてきた[1,12-15,23,24]。しかし、それらの高価格と不確かな生物学的安全性が更なる利用を制限している。ビスマス（Bi）は生物学的安全性が高く低コストな元素としてよく知られている。臨床で使用され、ヘリコバクター・ピロリの除菌療法や慢性肝疾患、胃・十二指腸潰瘍などの治療で重要な役割を果たしている。治療中の生物学的安全性と耐容性が良好である[7,25]。また、Biは高原子番号（Z=83）と優れたX線減衰能力（100keVで5.74cm²/kg）により、HA-BiO NP、Bi₂S₃、BION、Bi₂Te₃などのナノスケール造影剤の調製に使用されてきた[26-29]。

例えば、Mohsen Mahviらはマイクロ波支援ポリオール法でBi₂Te₃ナノフレークを合成し、市販イオヘキソールより優れたX線減衰係数を示した[29]。したがって、Biは高性能CT造影剤の構築に有望な元素である。しかし、Biベースナノ造影剤の調製は複雑である[30,31]。

ここでは、ランタノイド（Gd、Yb、Er）とBiを容易かつ低コストなプロトコルで組み合わせ、BiF₃:Ln@PVPナノ粒子（NP）を製造した。その後、CTイメージング用造影剤としての可能性を調査した。PVPコーティング後、BiF₃:Ln@PVP NPは良好な安定性と低生物学的毒性を示した。これらのサンプルはin vitroで市販イオヘキソールより優れたX線減衰を示し、in vivoで良好なコントラストを持ち、優れた消化管（GI）管CTイメージングを提供する。重要なことに、BiF₃:Ln@PVP経口投与48時間後、ナノ粒子は体外に完全に排泄され、肝臓や腎臓などの重要臓器に明らかな損傷はなかった。本研究が、ナノスケールCT造影剤の臨床使用に新たな理論的基盤を提供すると信じている。

方法

動物実験を含むすべての実験プロトコルは、中国福建省厦門大学の倫理委員会により承認された。

材料と試薬

硝酸ビスマス五水和物（Bi(NO₃)₃·5H₂O、≥99.99%）、フッ化アンモニウム（NH₄F、≥99.99%）、硝酸イッテルビウム六水和物（Yb(NO₃)₃·6H₂O、≥99.9%）、硝酸エルビウム六水和物（Er(NO₃)₃·6H₂O、≥99.9%）、硝酸ガドリニウム六水和物（Gd(NO₃)₃·6H₂O、≥99.9%）、ポリビニルピロリドン（PVP、≥99.0%）、イオヘキソール（≥99.0%）はアラジン試薬（上海、中国）から購入。生死細胞染色キットとセルカウンティングキット-8（CCK-8）はイェーセン（上海、中国）から購入。RPMI 1640培地、ペニシリン、ストレプトマイシン、胎児牛血清（FBS）はギブコ（ニューヨーク、米国）から購入。

BiF₃:Ln@PVP NPの製造

BiF₃:Ln@PVP NPは水熱法で合成した。詳細には、1mmol Ln(NO₃)₃（Ln=Yb、Er、Gd）と1mmol Bi(NO₃)₃を、5mL脱イオン水（DI）と30mLエチレングリコールを含む35mL溶液に溶解し、透明な溶液Aを形成。これに0.5g PVP（M_W=10,000）を混ぜ、室温で10分撹拌。NH₄F（20mmol）を10mL DIに溶解し溶液Bを形成。溶液Bを溶液Aに注ぎ、20分撹拌後白色混合溶液Cを形成。溶液Cを50mLオートクレーブに入れ、180℃で24時間加熱。24時間後自然に室温まで冷却。最後に、遠心分離（8000rpm、3分）し、DIとアルコールで洗浄して未反応物質を除去。最終サンプルを凍結乾燥で回収。

BiF₃:Ln@PVP NPの特性評価

BiF₃:Ln@PVP NPの形態は透過型電子顕微鏡（TEM、TECNAI G20 F30 TWIN、オックスフォード）で観察し、作動電圧300kV。ナノ粒子の組成はTEMでのエネルギー分散型X線分光（EDS、マッピング解析含む）で分析。フーリエ変換赤外分光（FTIR、Thermo Scientific Nicolet iN10 MX分光計、米国）でサンプルの官能基を特定。BiF₃:Ln@PVP NPの結晶構造と相特徴は、Cu Kα線、40kV、40mA条件下で粉末X線回折（XRD、D8 Advance）で評価。DIとPBS（pH 7.4）に分散したナノ粒子のサイズ分布は動的光散乱（DLS、Brookhaven Instruments-Omni、米国）で調査。

細胞株と細胞培養：HepG2細胞は中国科学院上海細胞バンクから入手。RPMI 1640培地（10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン含有）で37℃、5% CO₂条件下で培養。培地は隔日で交換。

BiF₃:Ln@PVP NPのin vitro細胞適合性

BiF₃:Ln@PVP NPのin vitro細胞適合性を生死染色アッセイとCCK-8アッセイで評価。詳細には、HepG2細胞を回収し、コンフォーカル皿に5.0×10⁵個播種。一晩培養後、BiF₃:Ln@PVP NP懸濁液を異なる濃度（100、200、400μg/mL）で添加し実験群とする。一方、ナノ粒子なし培地を対照群とする。その後、両群を24時間培養。24時間後、元の培地を優しく除去し、メーカーのプロトコルに従って生死アッセイを実施。簡単には、生細胞をカルセイン-AMで標識、死細胞をヨウ化プロピジウム（PI）で染色し、コンフォーカル顕微鏡（ニコン、日本）で観察。

CCK-8アッセイでBiF₃:Ln@PVP NPのin vitro細胞毒性をさらに決定。詳細には、HepG2細胞を96ウェルプレートにウェルあたり3000個播種し一晩培養。BiF₃:Ln@PVP NPの異なる濃度（0、25、50、100、200、400μg/mL）を細胞と混合し24時間培養。CCK-8試薬（10μL）を各ウェルに添加し37℃で2時間インキュベート。その後、SPECTRA maxマイクロプレートリーダー（モデル680、Bio-Rad、東京、日本）で450nmのOD値を測定し、メーカー提供の式に従って各濃度の細胞生存率を計算。これらの実験を3回繰り返した。

動物

雌性BALB/cヌードマウス（4-6週齢）を厦門大学実験動物センター（厦門、中国）から入得。無菌環境で飼育し、12時間明/暗サイクルを維持。マウスにHepG2細胞（1.0×10⁷/mL）を皮下注射し腫瘍形成を誘導。本研究のすべての動物実験は、厦門大学動物実験委員会承認のプロトコルに従って実施。

BiF₃:Ln@PVP NPのin vivo生体適合性

組織学的解析でBiF₃:Ln@PVP NPのin vivo生体適合性を観察。実験群マウスにBiF₃:Ln@PVP NP懸濁液を200mg/kgで尾静脈注射、対照群には同量PBSを静脈注射。24時間後、マウスを安楽死させ心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳など主要臓器を即座に摘出。すべての臓器を4%パラホルムアルデヒド固定液で12時間固定し、パラフィン包埋・切片化。最後にヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色を実施。臓器の形態を直立蛍光顕微鏡（Leica DM2700 P、ドイツ）で評価・撮影。

BiF₃:Ln@PVP NPのin vitroおよびin vivo CT性能

BiF₃:Ln@PVP NPのin vitro CTイメージング応用を研究するため、BiF₃:Ln@PVP NPとイオヘキソール懸濁液を調製し、0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0mg/mLに希釈して0.3mLエッペンドルフチューブに分注。BiF₃:Ln@PVP NPとイオヘキソール懸濁液のCT画像と対応するCT値を、X線CT装置（シーメンス）で動作電圧50kVと80kVでそれぞれ取得・記録。次に、BiF₃:Ln@PVP NPのin vivo CTイメージング能力を研究。BiF₃:Ln@PVP NP懸濁液を腫瘍保有ヌードマウスに腫瘍内注射（200mg/kg、100μL）。その後、マウスを麻酔し、X線CT装置（シーメンス、80kV、88μA）でBiF₃:Ln@PVP NP投与前後のCT画像を撮影。

BiF₃:Ln@PVP NPのGI管CT性能と組織学的解析

BiF₃:Ln@PVP NPのCTイメージングにおける価値をさらに探るため、マウスを一晩絶食させ、胃管を通じてBiF₃:Ln@PVP NP懸濁液（300μL、20mg/mL）を経口投与。マウスをクロラール水和物で腹腔内麻酔。次に、異なる時間間隔（0、15分、30分、120分、6時間、12時間、24時間、48時間）でGI画像を80kVで撮影。最後に、CT装置でマウスの3Dモデルを再構築。マウスを安楽死させ、胃、小腸、大腸を摘出し4%パラホルムアルデヒドで12時間固定。パラフィン包埋・切片化後、H&E染色でBiF₃:Ln@PVP NPの消化管毒性を評価。

統計解析

データは一元配置分散分析（ANOVA）で解析。すべての解析でP値<0.05を統計的有意とした（95%信頼水準）。

結果と考察

BiF₃:Ln@PVP NPの製造と物理化学的特性

まず、BiF₃:Ln@PVP NPを水熱反応で調製した（スキーム1）。図1AはTEMによるBiF₃:Ln@PVP NPの形態を示す。BiF₃:Ln@PVP NPは均一な球状構造を持つ。平均粒子径は約380nmで均一に分散。挿入図は比較的狭い粒子径分布を示す（右下）。BiF₃:Ln@PVP NPの形態評価後、EDSで組成を分析。図1B-Fは元素分析前のBiF₃:Ln@PVP NPの暗視野像。結果は、ナノ粒子が主にGd、Yb、Er、Bi元素で構成されることを示し、BiF₃:Ln@PVP NPが成功裏に合成されたことを示す。

PVPはナノ材料の生体適合性と安定性を向上させる効果的な安定剤である[32]。したがって、先行研究[33]に従いナノ粒子をPVPで修飾した。FTIRスペクトルでPVPがナノ粒子表面に成功裏にコーティングされたかを判定（図2）。1658と1293cm⁻¹にそれぞれC=O基の強い吸収ピークとC-N基のピークが見られた。これらはPVP由来であり、ナノ粒子表面へのPVPコーティングが完了したことを示す[34]。BiF₃:Ln@PVP NPのXRDパターンを図3に示す。図3Aは全ピークが標準カードBiF₃:Lnデータ（PDF 74-0144）とよく一致し、BiF₃:Ln@PVP NPが成功裏に調製されたことをさらに実証。BiF₃構造の原子パラメータは、Diamondソフトウェアを介して標準cifカードの初期パラメータとして使用可能。標準構造はPDF 74-0144、a=b=c=5.865Å、V=201.75(3)ų、密度(c)=8.755を生成。C軸から見たBiF₃結晶構造はA軸に垂直な方向に層が積層（図4B）、A軸から見た単一構造ではBiが原子の中心に位置（図4C）。これらの結果は、BiF₃:Ln@PVP NPが良好な結晶構造を持ち、表面コーティングがBiF₃:Ln@PVP NPの結晶構造にわずかな影響しか与えないことを示す。

BiF₃:Ln@PVP NPの安定性と細胞適合性

ナノ粒子の分散サイズは生物学的システムとの相互作用に影響するため、異なる溶液での分散サイズ研究が必要[33]。図4A,Bは、BiF₃:Ln@PVP NPがDIとPBS（pH=7.4）で比較的狭い分布を持つことを示し、異なる溶液での良好な安定性を示唆。したがって、生物学的応用に適している。

BiF₃:Ln@PVP NPが異なる溶液で良好な安定性を持つことを確認後、細胞毒性を研究。生死実験でBiF₃:Ln@PVP NPの細胞毒性を評価。BiF₃:Ln@PVP NP懸濁液濃度が400μg/mLに達し、HepG2細胞と24時間共培養しても明らかな赤色蛍光（死細胞）は観察されなかった（対照群と比較；図4C）。これは実験群で有意な細胞死がないことを示す。その後、CCK-8アッセイで細胞毒性をさらに研究。図4Dは、様々な濃度のBiF₃:Ln@PVP NP懸濁液で24時間インキュベートしたHepG2細胞の細胞生存率を示す。実験群のHepG2細胞はすべて比較的高い細胞生存率を示した。さらに、BiF₃:Ln@PVP NP懸濁液濃度が400μg/mLに達しても細胞生存率は85.96%と高かった。これらの結果は、BiF₃:Ln@PVP NPがin vitroで好ましい生体適合性を持つことを実証し、これはBiF₃:Ln@PVP NP表面へのPVPコーティングに起因する可能性がある。

BiF₃:Ln@PVP NPのin vivo生体適合性

低細胞毒性に加え、良好なin vivo生体適合性は造影剤の臨床使用に必要なもう一つの条件[35]。したがって、BiF₃:Ln@PVP NP懸濁液を調製し、200mg/kg（100μL）でマウスに尾静脈注射。同量のPBS溶液を注射し対照群とする。24時間後、マウスを安楽死させ剖検時に主要臓器を摘出。H&E染色で全身毒性を評価。図5は、BiF₃:Ln@PVP NP投与24時間後に明らかな病理学的異常がないことを示す。これらの結果は、BiF₃:Ln@PVP NPが良好な生体適合性を持つことを示し、上記の低細胞毒性と一致する。

BiF₃:Ln@PVP NPのin vitro CTイメージング能力

高原子番号元素は通常、優れたX線減衰により高コントラスト効果を持つ。例えば、高原子番号貴金属（Au[36]、Ag[37]など）から調製された造影剤は、以前報告されたように優れたCTイメージング効果を持つ。したがって、有望なタイプの造影剤と見なせる。しかし、それらの高コストが更なる臨床応用を制限している。ビスマスは良好な生物学的安全性と低コスト、優れたX線減衰能力を持つ[38-41]。ここでは、BiF₃:Ln@PVP NPの造影剤効果を評価するため、市販造影剤イオヘキソール溶液とのX線減衰能力をin vitroで比較。図6A,Bは、異なる動作電圧（50kVと80kV）でのBiF₃:Ln@PVPとイオヘキソールの対応するCT画像を示す。図6A,Bは、懸濁液濃度の増加に伴い画像のグレーレベルが黒っぽい色調から白っぽい色調へ徐々に変化することを示す。しかし、同濃度ではBiF₃:Ln@PVPの方がイオヘキソールより明るい色調である。これはBiのX線減衰係数がIより高いため（Biは5.74cm²/kg、Iは1.94cm²/kg、100keVにて）[42]。

図6Cは、動作電圧に関わらず、BiF₃:Ln@PVP NPとイオヘキソール濃度の増加に伴いCT値（ハウンスフィールド単位、HU）が線形に増加することを示す（両方R²>0.99）。単位質量濃度あたりのBiF₃:Ln@PVP NPのCT値は、イオヘキソールよりはるかに高い（50kVで1.5倍、80kVで1.7倍高い）。これらの結果は、BiF₃:Ln@PVP NPが市販イオヘキソールと同用量でより優れたコントラスト効果を提供できることを示し、良好なin vitro CTイメージング能力を持つことを確認。これは、良好なイメージング効果を確保しながら造影剤量を減らせるため、毒性と副作用を大幅に軽減できるという点で大きな意義がある。

BiF₃:Ln@PVP NPのin vivo CTイメージングコントラスト効果

次に、BiF₃:Ln@PVP NP懸濁液を腫瘍保有マウスに腫瘍内注射（200mg/kg、100μL）し、in vivo CTイメージングでのコントラスト効果を評価。BiF₃:Ln@PVP NP懸濁液投与1時間後、同じ腫瘍領域でベースライン対比で強い信号強度変化が検出された（図7A）。一方、図7Bは投与後CT値（184.58HU）が投与前（48.9HU）よりはるかに高いことを示す。これはBiF₃:Ln@PVP NPが腫瘍組織に分布することで腫瘍組織のX線減衰係数が増加したため。結果は、BiF₃:Ln@PVP NPが優れたin vivo CTイメージング能力を持つことを示す。

BiF₃:Ln@PVP NPのGI管CTイメージング性能とGI毒性

上記の有望な結果に勇気づけられ、BiF₃:Ln@PVP NPのCTイメージングにおける潜在的応用をさらに評価する動機となった。一般的な非侵襲的イメージング法として、CTは便利な画像処理、組織損傷なし、患者の無痛などにより、GI疾患の診断と治療計画策定で重要な役割を果たす[43,44]。一般用いられる硫酸バリウム造影剤は通常、発泡剤と併用される。2物質の密度差によりGI管が常に明確に表示されず、見逃し診断を招き、臨床使用を制限している[45]。したがって、追加支援を必要としない高効率GI造影剤の探求は大きな意義がある。本研究では、ヌードマウスでのBiF₃:Ln@PVP NPのGI管への効果を探求した。

図8Aは、BiF₃:Ln@PVP NP懸濁液（20mg/mL、300μL）経口投与後15分で胃と小腸の形状が可視化されたことを示す。30分で胃の蠕動運動とともにBiF₃:Ln@PVP NPが代謝され、胃形態が弱まる。120分で大部分が胃から代謝され、胃の輪郭のみが残る。6時間で大腸の輪郭にBiF₃:Ln@PVP NPが現れ始め、ナノ粒子が大腸に富み始めることを示唆。12時間で大腸形態が明確に可視化。24時間で大部分が排泄され少量のみ残存。48時間間隔ではGI形態が観察できず、全BiF₃:Ln@PVP NPがGI管から排泄されたことを示す。ナノ粒子がGI管から完全排泄後、マウスを安楽死させ胃、小腸、大腸を摘出しH&EアッセイでBiF₃:Ln@PVP NPのGI毒性を評価。図8Bは、BiF₃:Ln@PVP NP経口投与48時間後に胃、小腸、大腸に明らかな組織学的変化がないことを示し、BiF₃:Ln@PVP NPがGI管に有意な毒性を持たないことを実証。これらの結果は、BiF₃:Ln@PVP NPがGI管のCTイメージング性能を高める潜在的CT造影剤として使用でき、GI管に明らかな毒性がないことを示す。

これらの結果は、BiF₃:Ln@PVP NPが腫瘍および消化管イメージング用臨床CT造影剤としての可能性を持つことを示す。しかし、粒子径の制約により、BiF₃:Ln@PVP NPは良好なEPR（浸透・保持）効果[46]を達成できない。BiF₃:Ln@PVP NPの長期生物学的安全性とin vivo代謝プロセスには更なる研究が必要である。

結論

ここでは、水熱プロセスで新規CT造影剤を合成した。TEMデータはBiF₃:Ln@PVP NPが平均サイズ約380nmの均一球状構造を持つことを示す。FTIRスペクトルはPVPがナノ粒子表面に成功裏にラッピングされ、ナノ粒子の生物学的安全性を向上させたことを示す。その後、異なる動作電圧下でイオヘキソールとのin vitro CTイメージング効果を比較。結果はBiF₃:Ln@PVP NPがイオヘキソールより優れたX線減衰能力を持つことを示す。生体適合性研究は、BiF₃:Ln@PVP NPがin vivoで主要臓器に明らかな毒性を持たないことを示す。最後に、優れたX線減衰能力によりBiF₃:Ln@PVP NPはin vivoで良好なコントラストイメージング効果を持ち、GI管を詳細に可視化しつつGI管に損傷を与えない。したがって、本研究は良好な水溶性安定性、生物学的安全性、高効率を持つ高効率CT造影剤を提供し、これらの特徴により臨床造影剤の潜在的候補となる。

データと材料の入手可能性

現在の研究で使用・分析されたデータセットは、対応著者から合理的な要請に基づき入手可能。

略語

CT

コンピュータ断層撮影

PVP

ポリビニルピロリドン

GI

消化管

PLAL

パルスレーザー液中アブレーション

Bi

ビスマス

Gd

ガドリニウム

Yb

イッテルビウム

Er

エルビウム

Au

金

Ta

タンタル

Pt

白金

I

ヨウ素

NP

ナノ粒子

CCK-8

セルカウンティングキット-8

RPMI

ロズウェルパーク記念研究所

FBS

胎児牛血清

Ln

ランタノイド

DI

脱イオン水

TEM

透過型電子顕微鏡

EDS

エネルギー分散型X線分光

FTIR

フーリエ変換赤外分光

XRD

粉末X線回折

DLS

動的光散乱

PI

ヨウ化プロピジウム

H&E

ヘマトキシリン-エオシン

HU

ハウンスフィールド単位

EPR

浸透・保持効果