携帯型プラズモニック熱デバイスによるラテラルフローアッセイの精密定量

概要

ポイントオブケアテスト（POCT）は疾患の早期診断とモニタリングに広く用いられています。ラテラルフローアッセイ（LFA）はPOCTで成功した商業ツールです。しかし、LFAには定量性と分析感度の欠如という課題があります。これらを解決するため、我々は以前、プラズモニック金ナノ粒子による熱コントラストを携帯デバイスに用いた熱LFAを開発しました。この手法は従来の目視検出と比較して分析感度を大幅に改善しましたが、定量の問題は残っていました。本研究では、伝導と放射の熱検出モードを用いてデバイスの動作条件を最適化し、LFAの定量を可能にしました。ナノ粒子のみを含むストリップの検出限界は、従来の目視検出と比較して伝導モードで5倍、放射モードで12倍低下しました。両検出法における周囲温度の影響を調べ、放射モードの方が伝導モードより周囲温度の影響を受けやすいことがわかりました。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG）バイオマーカーをLFAストリップで定量し、放射検出法で2.8 mIU/mLの検出限界を得ることで熱検出法を検証しました。

はじめに

早期発見と迅速な診断は疾患スクリーニングと治療に重要です。ほとんどの医療検査は時間がかかり、臨床検体の複雑な前処理、大型装置、熟練した検査技師を必要とします[1]。これらの要件は、資源制限地域での医療を大きく妨げてきました。ポイントオブケアテスト（POCT）はシンプルな装置を用い、臨床的に関連する結果を得るために必要な時間を最小限に抑え、臨床医と患者が迅速に意思決定できるようにします。POCTには、検出時間が短い、検体処理が迅速、装置がシンプル、操作要件が低いといった明確な利点があります[2, 3]。したがって、POCTの出現は、特に資源制限地域において疾患の早期かつ迅速な診断を助け、医療環境を改善できます。しかし、低分析感度、複雑な操作手順、高い装置コストが通常この技術の応用を妨げています。したがって、理想的な特徴の大半を備えつつ欠点を最小限に抑えたPOCT応用を見つけるため、さらなる研究が急務です。

これらの問題の一部を解決するため、ラテラルフローアッセイ（LFA）はPOCTにおける検査ツールとして優れた候補です。LFAは、与えられた検体中の標的分析物を同定するための紙ベースのポイントオブケアストリップバイオセンサーです[4, 5]。LFAは紙ベースのストリップ（スキーム1b）で実施され、検体パッド、コンジュゲートパッド、吸収パッド、検出が行われるニトロセルロース膜で構成されます。LFAの利点として、迅速性とワンステップアッセイ、コスト効率、簡単な操作、少量検体、様々な環境条件下での長期保存性が挙げられます[6, 7]。従来のLFAは、テストラインの色変化を肉眼で検査することで「はい/いいえ」の結果を提供します。これはこの種のアッセイで最も一般的な検出法です。したがって、このアプローチは精度の欠如と主観的判断の問題を抱えています[8]。しかし、LFAを電子デバイスと統合するのは容易であるため、ストリップリーダーを開発して正確な定量結果を得ることは実現可能な検出アプローチです。電荷結合素子（CCD）または相補型金属酸化膜半導体（CMOS）センサーがストリップリーダーで画像取得に通常用いられます。画像処理ソフトウェアを用いて定量結果を得ることが多いです。これらの光学リーダーでは、外部光源からの反射、透過、散乱光の光学情報を記録して定量化を可能にします[9-12]。比色リーダーでは、テストラインとコントロールラインからグレー値やRGB座標などの色強度を取得してLFAストリップを分析します[13-17]。このアプローチの欠点の一つは、色素が光損傷、機械的手段、その他の劣化プロセスにより時間とともに色を失う可能性があり、再現性と精度が低下することです。蛍光リーダーを用いるシステムでは[18, 19]、有機蛍光体が特定の励起波長に曝露され、ストリップに存在する蛍光体からより長い波長で発光が誘導されます。この放出光を収集して定量検出を行います。無視できない問題は、これらの応用で通常用いられる有機蛍光体が光退色と化学的劣化を受け、信号が時間とともに減衰し、特殊な取り扱いと保存が必要となることです[7]。

最近、熱センシングがLFA検出に徐々に応用されています。熱センシングは、分析物の存在で発熱が増加する熱変換素子を用い、この熱信号をトランスデューサで検出するものです。Poloら[20]は、近赤外（NIR）光源を用いて異方性金ナノ粒子のプラズモニック特性による発熱を誘導し、癌バイオマーカー癌胎児性抗原（CEA）を検出するプラズモニック加熱駆動センシングの概念を探求しました。Qinら[21]は、緑色レーザーを光源として熱コントラストを用いたLFA定量法を提案し、分析感度が32倍向上することを示しました。2016年には、Wangによって類似の熱コントラストリーダー[22]が開発され、LFA定量で8倍の分析感度向上を実現しました。熱トランスデューサによる発熱誘導に用いられる光源は、それらの波長を吸収しない他の分子の影響を受けないよう特定波長に調整可能で、検出特異性を確保できます。電磁スペクトルのNIR領域にある光源の使用は、生物学的起源の大多数の分子、特に血液による光吸収を防止できます[23]。これらの利点は、NIR光源を用いたプラズモニック熱センシングが有望なLFA検出法であることを示しています。しかし、先行研究ではLFAストリップとNIR光源を組み合わせたPOCTデバイスは開発されていませんでした。

本研究では、ストリップの追加修正なしでLFAの分析感度を向上させるプラズモニック熱センシングベースの携帯デバイス（スキーム1a）を開発しました。NIRレーザー照射によりプラズモン共鳴を最大限に活用して信号を増幅しました。試作機のレーザー波長は、ナノ粒子（本設定では光-熱変換トランスデューサとして機能）の局在表面プラズモン共鳴（LSPR）ピーク内にあり、テストラインで発熱を生成します。その後、デバイス内の熱センサーが赤外放出（放射）または熱伝導により生成された熱を測定します。発熱量はテストラインのナノ粒子数と照射パワーに比例します[24]。追加操作は不要です。

熱伝達には伝導、対流、放射の3つの主要形式があります。異なる熱伝達形式の検出性能を研究するため、2種類のセンサー（スキーム1aおよび追加ファイル1：図S1）により伝導モード（接触）と放射モード（非接触）をテストしました。試作機全体はコンパクトで、組み込みシステム技術と表面実装部品を使用しています。検出能力に影響する主要因子を調査し、動作条件を最適化しました。携帯デバイスの検出能力を検証するため、膜に直接ナノ粒子をロードしたLFAストリップを定量し、従来の目視検出と比較しました。検出法が温度依存的であるため、周囲温度の熱信号検出への影響も調査し、伝導モードのキャリブレーション曲線を取得しました。最後に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG）バイオマーカーをモデルとして定量し、熱センシングの検出能力を検証しました。

材料と方法

材料と試薬

リン酸緩衝食塩水（PBS）はLonza®から購入。N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）とヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（HS-PEG-COOH、分子量5000 g/mol（5 kDa））はSIGMA®から購入。ツイーン20、トリトンX100、ウシ血清アルブミン（BSA）、トレハロース、ポリビニルピロリドン（PVP）、N-ヒドロキシスルホコハク酸イミド（S-NHS）、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、金(III)塩化物水和物、HCGホルモンはAladdin®から購入。スクロース、四ホウ酸ナトリウム十水和物、ホウ酸、ヨウ化カリウム、チオ硫酸ナトリウム五水和物はシノファーム化学試薬株式会社から購入。ホウ化ナトリウムは上海凌峰化学試薬株式会社から購入。抗-αHCG、抗-βHCG、抗マウス二次抗体、ニトロセルロース膜（NC-a110）、検体パッド（ガラス繊維BX108）、コンジュゲートパッド（ガラス繊維BX101）、ポリ塩化ビニル（PVC）表面はJieyYiBiotech™から購入。4-モルフォリンエタンスルホン酸（MES）は上海メジャーバイオから購入。純エタノールは常熟揚源化学株式会社から購入。

ナノ粒子（金ナノプリズム、AuNPrs）の合成

本研究で使用したナノ粒子は、以前報告されたプロトコル[25]の変法で得られ、後に改良されました[26]。簡単に述べると、0.5 mM Na₂S₂O₃ 220 mLに0.1 M KI 20 μLを添加。上記溶液110 mLを2 mM HAuCl₄含有溶液に30秒かけて徐々に添加し、室温で合計4分間インキュベート。残りのNa₂S₂O₃+KI溶液110 mLを30秒かけて添加し、さらに4分間インキュベート。最後にKIなしのNa₂S₂O₃ 100 mLを添加し、室温で60分間インキュベートして最終的なプリズム形状ナノ粒子を得ました。前述のすべてのインキュベーションステップは振とうなしで実施。合成後、ナノ粒子をPEGで安定化（PEG化）。ナノ粒子に添加するPEG量は、合成に使用した金の総重量に対する1:2の比率（NPs:PEG）で調製。PEGを1 mLミリQ水に溶解し、PEGとNaBH₄が1:1モル比になるようNaBH₄を添加。PEG-NaBH₄溶液全量をAuNPrsに添加し、2 M NaOHでpH 12に調整しながら穏やかに混合。最終的に60°Cで60分間超音波処理し、室温で4400 G、15分間遠心分離してAuNPrsを過剰PEGと未反応物から分離。ペレットをミリQ水に再懸濁し、室温で4400 G、9分間遠心分離を3回繰り返し。これらの最終サンプルを元の体積の4分の1に希釈し、数週間室温で静置。この後、上層（より小さく軽いナノメトリック金副産物の主要部分を含む）を、底部に沈殿したAuNPrsから除去可能。ナノ粒子濃度は、UV-Vis分光法で400 nmでの吸光度（OD）を測定し、換算係数（ε）11.3 mL mg⁻¹ cm⁻¹を適用して求めました。この値は、ICPで得られた金濃度と最終合成生成物のUV-Vis 400 nmでのODを相関させて実験的に得られました。

抗HCG抗体とのナノ粒子コンジュゲーション

簡単に述べると、0.5 mg/mLのPEG化ナノ粒子を含む3 mL溶液を、0.1 M MES緩衝液pH 5.5で遠心分離（ミニスピンマイクロフュージ、室温、6000 rpm、9分間）により3回洗浄。最終洗浄ナノ粒子を同緩衝液（0.1 M MES緩衝液pH 5.5）1 mLに再懸濁し、EDCとS-NHS各4 mgを添加。穏やかな混合下で20分間インキュベート、6000 rpmで9分間遠心分離、MES緩衝液で洗浄。抗体ストック（200 μg）20 μLを添加し、37°Cで3時間、その後4°Cで一晩インキュベート（振とうなし）。翌日、コンジュゲートナノ粒子を遠心分離（6000 rpm、9分間）し、ホウ酸緩衝液5 mM pH 9で2回洗浄。BSA 25 mgを添加。室温で穏やかな振とう下1時間インキュベート後、サンプルを洗浄（6000 rpm、9分間）、ツイーン20添加ホウ酸緩衝液（5 mM pH 9）で洗浄、最終的に4°Cで4–5日以内に使用するまで保存。

ナノ粒子調製後、テストストリップの組み立てを行いました（ESIに記載）。

ストリップ膜へのナノ粒子ロード

ストリップ膜へナノ粒子をロードするため、PEG化ナノ粒子（抗体なし）のオリジナルストック濃度を取得し、ミリQ水で一連の希釈を行い、0（ナノ粒子なしの純ミリQ水）から最大濃度10 OD/mL（ICP-AESで事前に特性評価した換算係数により0.9 mg/mLに対応）までの濃度範囲を作成。簡便性と外挿のため、重量濃度よりOD値を優先。前述の各希釈液2 μLをマイクロピペットでストリップのニトロセルロース膜に直接添加し、室温で約2時間乾燥。乾燥ストリップを照射試験前まで室温保存。

ストリップでのHCG抗原検出のため、アナライト（HCG）の一連の希釈をPBSで実施。各ストリップは、抗HCG抗体コンジュゲートAuNPr 5 μLをコンジュゲートパッドにロードし、必要な希釈のHCG 50 μLをロードして実施。ストリップは前回のテストと同様に乾燥。

携帯デバイスの開発

携帯デバイス（図1aおよび追加ファイル1：図S1）は、小型でコスト効率の良い組み込みシステム技術と表面実装部品を用いて組み立てました。試作機の構成を図1bに示します。マザーボード（追加ファイル1：図S1）はデバイスのコアモジュールで、データ処理と他コンポーネントの制御を行います。このモジュールは主にMCU STM32F407で構成され、大容量メモリと低消費電力動作を特徴とします。マザーボード上に電圧変換回路を設計し、デバイス内の各モジュールへ正しい電圧供給を行います。

マザーボードには他モジュールとの接続用に5つのインターフェースを実装。温度センサーはIICインターフェースでマザーボードに接続し、センサーから送信される温度信号を受信。正確な温度測定のため、デジタル出力の温度センサーを選択。伝導モード用センサーは半導体センサー（ADT7420、Analog Devices）で、16ビット温度分解能（0.0078°C）と低消費電力（700 μW）。放射モードでは赤外線温度計（MLX90614、Melexis）を使用、17ビット温度分解能と3.9 mW消費電力。レーザー制御モジュールとマザーボードのインターフェースはリレー制御回路で構成し、レーザーダイオードの正確な管理とマザーボードの大電流からの保護を確保。レーザーモジュールは3構成要素からなる：（1）レーザー制御コンポーネント（追加ファイル1：図S1）、（2）レーザーダイオード（Thorlabs、M9-A64-0200）、波長1064 nm、光学最大出力200 mWの光源を提供、（3）非球面レンズ（Thorlabs、354330-C）、レーザーモジュールに取り付け、レーザーダイオードからの放出光を1 mm × 2.5 mm領域に集光。これらのコンポーネントにより、ストリップのテストラインを精密に照明可能。LCDタッチスクリーン（TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN、480 × 272ピクセル）をグラフィカルユーザーインターフェースとして利用。ボードのインターフェース4はプログラムダウンロードとデバッグ用に確保。USBインターフェースをデバイスに実装し、バッテリー充電ポートとデバイスと外部コンピュータ間の通信ポートとして機能。試作機は10,000 mAhリチウム電池で駆動。MCUプログラムはIARソフトウェア（バージョン7.50.2.10505）でコンパイル。グラフィカルユーザーインターフェースはUSART HMIソフトウェアで設計。

試作機ケースとテストストリップカートリッジの設計

デバイスをユーザーフレンドリーで携帯可能にするため、3Dプリントシェルとカートリッジを設計し、デバイスの耐干渉性と安定性を向上。ケースとカートリッジ両方に白色樹脂を材料として使用。Solidworks 2018ソフトウェアで設計。

内部コンポーネントの形状に合わせて直方体ケース（追加ファイル1：図S2a）と長方形底板（追加ファイル1：図S2b）を設計。直方体ケースはLCDスクリーンとレーザーダイオード制御モジュールの固定取り付け位置を提供。ハウジング側面の長方形スロットでテストストリップカートリッジを挿入。底板にはバッテリーとマザーボード取り付けベースを設け、コンポーネントを底板に固定して動かないように。すべての検出部品を底板に固定。センサーとストリップカートリッジ両方のサポートフレームを底板に配置し、密接接触を実現。レーザーダイオードとレンズの微調整移動トラックを設け、固定と距離調整を可能に。ケース全体のサイズは133 mm × 108 mm × 73 mm。

テストストリップ保護用の特別なカートリッジ（図1c、15 mm × 4 mm × 70 mm）を設計。カートリッジには3つの窓があり、一つは検体ロード用、残り二つはテストラインとコントロールラインの可視化用。テストラインの窓はテストストリップ幅よりわずかに小さく設計し、レーザーがストリップを通過してセンサー検出に影響しないように。カートリッジ背面にバッキングノッチを設け、伝導センサーがテストライン位置でストリップ背面に完全に接触できるようにしつつ、放射センサーが温度を適切に検出できるように。

熱センシングとパラメータ計算のアルゴリズム

レーザーがナノ粒子を照明すると、テストラインで熱が発生し、検出可能な温度変化が生じます。この発熱（Q、W/m³）は、ナノ粒子濃度（C、OD/mL）、照明面積（A、m²）、レーザー強度（I、W/m²）に依存します[22]：

$$ Q= CIA $$ (1)

レーザーがストリップを照明したとき、熱信号（温度）が収集されました。照明面積とレーザー強度を一定に保ったため、熱信号はテストラインに結合したナノ粒子量に応じて変化します。発熱の定量化のため、2つの方法を比較しました。1つ目は温度変化（追加ファイル1：図S3）を用いて熱信号を定量化。温度変化（∆T）を以下で計算：

$$ \Delta T={T}_{\mathrm{end}}-{T}_0 $$ (2)

ここで、T_endは照射終了時の最終（最大）温度、T₀は照射開始前のセンサーが記録した初期周囲温度です。もう1つの方法は曲線下面積（AUC、追加ファイル1：図S3）の定量的計算を用いました。この方法では、サンプリング周波数10 Hzに従って曲線を台形に分割し、すべての台形の加算を計算。熱信号は面積を検出時間（t_det）で割ることで達成：

$$ \mathrm{AUC}=\sum \limits_{i=1}^n\left(\Delta {T}_i+\Delta {T}_{i-1}\right)\times 0.1\div 2 $$ (3) $$ {T}_{\mathrm{auc}}= AUC\div {t}_{\mathrm{det}} $$ (4)

両方法を検出に適用したとき、AUC解析の方が定量の再現性が優れていました（追加ファイル1：図S4）。したがって、最終的な発熱定量にはAUC解析を採用しました。

異なる検出法の性能を評価するため、定量のLODを評価しました。各実験で、1濃度あたり4サンプル（4ストリップ、n = 4）を測定。ブランク群の標準偏差（σ₀）と感度（S、線形範囲での標準曲線の傾き）を考慮し、LODを以下で評価：

$$ \mathrm{LOD}=\frac{3{\sigma}_0}{s} $$ (5)

アッセイ手順

アッセイ手順全体は3つの主要ステップで構成：（1）データ収集、（2）検出と結果取得、（3）結果表示と保存。まず、テストストリップをカートリッジにロードしデバイスに挿入。検出ボタンをタップし、患者情報を入力（任意で匿名コード入力可能）するだけで測定実施。情報はマイクロコントローラユニット（MCU）に送信され保存。MCUが温度センサーとレーザーダイオードを起動しテスト開始。同時に、MCUが受信した温度データをLCDに送信しリアルタイム表示とプロット。検出後、MCUがAUC値を計算し画面に結果表示。

結果と考察

ナノ粒子のキャラクタリゼーション

コンジュゲートナノプリズムのUV-Visスペクトルを図2aに示し、最大ピークが1130 nmにあることを示しました。レーザー波長（1064 nm）でのAuNPr吸光度は、1130 nmでの最大吸光度の92%でした。SEMとTEM画像（図2b、c）を取得し、ナノ粒子の形態を可視化、三角形が大多数であることを確認。

デバイス内測定条件の最適化

熱センシングでは、検出時間とレーザーダイオードからテストラインまでの距離が信号応答に影響する主因子です[27, 28]。これら2因子を研究し測定条件を最適化。照射時間の最適化のため、ストリップを10分間照射し、両センサーで温度変化を記録。図3aから、温度は10分間上昇し続けたが、120秒後から上昇がプラトーに達し始めたことがわかります。この結果は、熱信号変化の時間経過で類似の傾向が観察された先行研究と一致します[28]。POCT要件と消費電力を考慮し、デバイスの検出時間を120秒に設定。

距離の最適化を実施。図3bは、レーザーダイオードとテストラインの距離増加に伴い熱信号が減少することを示しました。理由は、距離増加により有効照射面積が増え、テストラインに到達するレーザー出力が減衰するためと考えられます。最大信号応答を得るため、距離を7 mmに設定。

周囲温度の熱センシングへの影響

熱センシングは温度と密接に関連するため、周囲温度が熱センシングにどう影響するか研究する必要がありました。周囲温度を27.5–40°Cの範囲でインキュベータを用いて変化。各温度ポイントで2.5°C間隔で4サンプルずつ測定。ブランクと1 OD/mLストリップについて、両熱検出法で周囲温度対熱信号曲線を測定。周囲温度のフィッティング曲線パラメータを表1に示します。図4aは伝導モードでは、異なる濃度で曲線傾きが概ね一貫しており、周囲温度変化が異なる濃度に同じ効果を持つことを示します。結果として、周囲温度効果曲線を用いて定量結果をキャリブレーション可能。放射モードでは、2濃度に対応する曲線傾き（図4b）は互いに一致しましたが、両曲線とも下降傾向を示しました。結果は、伝導モードの方が温度変動の大きい条件下でのサンプル測定により信頼性が高いことを示唆します。

ナノ粒子の定量

熱センシング検出

標準定量曲線を得るため、0–10 OD/mLの範囲でナノ粒子を含むテストストリップを2つの熱センシング法（追加ファイル1：図S5）でそれぞれ検出。これらのストリップ（追加ファイル1：図S6a）を前述の携帯デバイスで検出（「材料と方法」参照）。デバイス内の両センサー設定は追加ファイル1：図S5aとS5bに提示。各濃度で周囲温度27.5°Cで4サンプルテスト。デバイスはAUC法でテストラインの熱信号を計算。したがって、熱信号の定量化はテストラインのナノ粒子量に比例。熱信号とナノ粒子濃度のデータから線形回帰で定量曲線（図5a）を作成し、表2の式で表現。

表2は、放射モードの感度が伝導モードの15倍高いことを示しました。伝導と放射モードのLODはそれぞれ0.053 OD/mLと0.023 OD/mL。熱センシングでは、放射モードが伝導モードと比較してLODを2倍改善。LFAストリップの安定性もテスト（追加ファイル1：図S7）。伝導熱センシングモードでは2つの固体間の熱伝達が必要。テストライン温度が急上昇すると、センサーがテストラインと同じ温度に達するまで時間（緩和時間）がかかります。結果として、検出終了時のセンサー温度はテストラインの実際の温度より低くなります。一方、放射モードでは熱をセンサーに伝達する必要がなく、センサーがテストラインから放射されるIR波を直接検出して現在の温度を取得。伝導検出モードでは、優良な熱伝導体がヒートシンクとして働くため熱の一部が放散しますが、放射検出では空気とストリップ自体のみが放散に介在。これらの理由が伝導法の感度が放射法より低いことを説明できます。

10 OD/mL濃度のストリップをテストしたとき、放射（非接触）センシングモードで焦げ跡が見つかりました。この現象の一つの理由は、非接触測定では空気の低熱伝導率により熱がテストラインに留まり、効率的に放散されず、実効局所温度が上昇し、最終的に膜の燃焼を引き起こすためと考えられます。

一方、接触モードでは、大きな熱伝導率を持つセンサーが媒質とヒートシンクとして機能。熱がセンサーに伝導されるため、テストラインで燃焼は発生しません。

熱センシングと目視検出の比較

携帯デバイスでの普及と幅広い使用から、熱センシングと目視検出を検出能力で比較。目視検出では、従来の顕微鏡デジタルカメラでストリップ画像を撮影。テストストリップをカートリッジにマウントし、熱センシングと同様に画像解析の位置一貫性を確保。ソフトウェアImage Jを用いて、異なるナノ粒子濃度でのテストラインのグレー値を解析。この解析結果に基づき目視検出法の標準曲線（図5a）をプロット。グレー値とナノ粒子濃度の線形範囲は0.2–10 OD/mL（0–0.2 OD/mL範囲のR²は0.770だったため、更なる解析から除外）。検出限界は0.268 OD/mL。結果は熱センシングが目視検出と比較してLODを5〜12倍低減できることを示しました。Qinの研究では、目視分析のLODが熱コントラストの100倍高いことがわかりました[21]。彼らは高レーザー出力と赤外線カメラを用いたため、LODの差が大きくなりました。LOD改善の合理的説明の一つは、熱センシングが膜表面の上部と下部両方のナノ粒子を測定できること。熱センシングのもう一つの利点は、目視検出より高い安定性を持つこと。熱センシングはテストライン全体のナノ粒子で熱を発生。目視検出はテストライン表面のナノ粒子の色反応のみに依存。同じアナライト濃度の2ストリップでも、テストラインの接平面上のナノ粒子分布は異なるため、目視検査では検出結果に差が生じますが、熱センシングはより安定で再現性があります。逆に、目視検出の感度は熱センシングの2倍高かったです。目視検出はナノ粒子定量の直接法であるのに対し、熱センシングは温度変化を測定してナノ粒子濃度を間接的に測定するため、感度不足を部分的に説明できます。図5bは、熱センシングの検出線形範囲が0 OD/mLまで低く、R²が0.972（伝導）と0.987（放射）であることを示し、熱センシングが標的分析物がより低濃度にあるPOCTでの早期検出応用により良いポテンシャルを持つことを示唆。

HCGの定量検出

最後に、バイオマーカーHCGを本システムで定量し、熱センシングを検証。伝導と放射両モードをHCG定量に適用。ストリップの燃焼を防ぐため光学出力を150 mWに低下。4濃度のストリップ（追加ファイル1：図S6b）をテスト。図6aとbは、熱信号が35–700 mIU/mLでHCG濃度に対して線形であることを示しました。濃度を35–7000 mIU/mLまで拡張すると、HCG濃度の対数と熱信号の間に線形性がありました（図6c、d）。伝導モードではLODは64.2 mIU/mLで目視検出と同程度。しかし、放射モードの理想的LODは2.8 mIU/mL。データはナノ粒子定量と一致。光熱効果を適用した他デバイス（LOD = 5.5 mIU/mL）[27]と比較し、放射モードでLODをほぼ2倍低減。これらの結果は、熱センシングがLFA検出と定量に効果的な方法であることを証明しました。

結論

LFA検出のためのプラズモニック熱センシング法を確立。異なる温度センサー（伝導と放射モード）を適用し、この手法に基づく携帯デバイスを開発。周囲温度の影響研究により、熱センシングに負の影響があり、伝導モードの方が放射モードより影響が少ないことを実証。放射モードでは高濃度で影響がより顕著。両モードで定量能力も比較。従来の目視検出と比較して、熱センシング法はナノ粒子定量でLODを5〜12倍改善。放射モードは感度とLODの両面で伝導モードより優れた性能。熱センシングの検証では、HCG検出用LFAストリップをテストし、放射モードが伝導モードよりはるかに高感度であることを実証。このように、熱センシングがLFAプラットフォームでの早期検出に実現可能で効果的な方法であることを証明しました。

結論として、プラズモニック熱センシングは分析感度を真に向上させ、早期診断応用におけるLFA検出の有望な未来を示しています。本稿で説明した携帯デバイスは、異なる要件を満たす2つのセンシングアプローチを提供します。

データと材料の入手可能性

本研究で使用および/または分析されたデータセットは、対応著者から合理的な要請に基づき入手可能です。

略語

AUC:

曲線下面積

AuNPrs:

金ナノプリズム

BSA:

ウシ血清アルブミン

CCD:

電荷結合素子

CMOS:

相補型金属酸化膜半導体

HCG:

ヒト絨毛性ゴナドトロピン

LFA:

ラテラルフローアッセイ

LOD:

検出限界

LSPR:

局在表面プラズモン共鳴

MCU:

マイクロコントローラユニット

MES:

4-モルフォリンエタンスルホン酸

NIR:

近赤外

PBS:

リン酸緩衝食塩水

POCT:

ポイントオブケアテスト

PVC:

ポリ塩化ビニル

PVP:

ポリビニルピロリドン

S-NHS:

N-ヒドロキシスルホコハク酸イミド