ヒアルロン酸機能化Gd₂O₃ナノ粒子：MRIガイド下放射線治療の腫瘍への強化

概要

固形腫瘍の不正確な局在化と固有の放射線抵抗性が、放射線治療の臨床実装を深刻に妨げている。本研究では、ワンポット水熱プロセスでヒアルロン酸機能化酸化ガドリニウムナノ粒子（HA-Gd₂O₃ NPs）を作製し、腫瘍の効果的な磁気共鳴（MR）イメージングと放射線感受性化を実現した。HA機能化により、直径105nmの調製HA-Gd₂O₃ NPsは水中で優れた分散性、低細胞毒性、優れた生体適合性を示し、HA受容体媒介エンドサイトーシスにより癌細胞の細胞質に容易に取り込まれた。重要なことに、HA-Gd₂O₃ NPsはMRI造影剤として高い縦緩和率（r₁）6.0 mM⁻¹S⁻¹を示し、用量依存的に放射線感受性化増強を示した。これらの知見は、合成されたHA-Gd₂O₃ NPsが二機能性セラノスティック剤として、腫瘍診断と放射線治療に大きな潜在能力を持つことを実証した。

はじめに

放射線治療は癌で広く適用されており、高エネルギーX線と腫瘍部位への照射線量堆積により、フリーラジカル損傷やDNA損傷を引き起こす[1,2,3,4]。しかし、低い放射線感受性、腫瘍局在化の不正確さ、病変と正常組織の識別不良による照射副作用が、放射線治療の臨床実装を制限している[5]。したがって、全身副作用を最小限に抑えながら腫瘍放射線感受性を高める方法を開発することが重要である。ナノテクノロジーと放射線治療の組み合わせは、放射線感受性化の確立された優先事項である。

近年、ナノテクノロジーは癌診断と治療の魅力的な戦略と見なされている[6,7,8,9,10,11]。ナノ粒子（NPs）の主要機能の一つは、NPsの腫瘍組織への選択的蓄積（受動的標的化、増強透過性保持（EPR）効果、能動的標的化、長い循環時間）に基づく正確な腫瘍標的化である[12,13,14]。我々の先行研究では、炭素NPへのヘテロ原子ドーピングが固有特性を効果的に調整し、有益な特徴を導入することを実証した[15,16,17]。興味深いことに、NPsは放射線感受性化剤として使用できる[18]。高Z元素を持つ重金属NPs（Au、Bi、Gdなど）は、高いX線光子捕獲断面積とコンプトン散乱効果により、放射線感受性化療法の有望な放射線感受性化剤となる[19]。X線が高Zナノ粒子と相互作用すると、オージェ電子と光電子、二次電子の放出が癌細胞を傷つけ、放射線治療中に線量増強を提供する[20]。これまで、ガドリニウムベースNPs（GdNPs）は効果的なMRI造影剤（CA）[21, 22]として示されており、非侵襲的かつリアルタイムで正常組織と病変組織・病巣を区別できる。これらの剤は縦緩和時間を短縮し、縦緩和率r₁に影響を与える[23]。しかし、不正確な標的化が頻繁に副作用をもたらす。ヒアルロン酸（HA）がクラスターデターミナント44（CD44）などのHA受容体を持つ標的部位への主要なリガンドおよび薬物送達キャリアとしてよく知られている[24,25,26]。

先行研究の結果に基づき、我々はHAを標的リガンドとして用い、Gd₂O₃ NPsを二重機能で機能化した：効果的な腫瘍標的MRI CAと、固有の放射線抵抗性と腫瘍局在化の不正確さを克服する放射線感受性化剤。さらに、HA-Gd₂O₃ NPsは高い縦緩和率（r₁）を有望なMRイメージング剤として示し、より良いMRイメージング品質を実現。現在利用可能なCA[27, 28]と比較して、結果として得られたHA-Gd₂O₃ NPsは3つの顕著な利点を示す：第一に、天然細胞外マトリックスを前駆体として使用するため、HA-Gd₂O₃ NPsは優れた生体適合性を示す。第二に、HA機能化が腫瘍標的化を大幅に改善し、副作用を軽減する。第三に、HA-Gd₂O₃ NPsは診断と治療の二機能性を持つ。放射線感受性化増強の有効性とメカニズムを検証するため、HA-Gd₂O₃ NPsの腫瘍細胞生存率、細胞周期、アポトーシスへの放射線感受性化効果を評価した。

結果と考察

HA-Gd₂O₃ NPsの調製と特性評価

本研究では、HA-Gd₂O₃ NPsを図1に示すシンプルな水熱プロセスで成功裏に調製した。粒子サイズは動的光散乱で分析し、形態観察は透過電子顕微鏡で実施。図1aに示すように、HA-Gd₂O₃ NPsは均一な分散と明確な準球形を示し、明らかな凝集はない。HA-Gd₂O₃ NPsの平均直径は105nm。正常組織と比較して、腫瘍組織の毛細血管内皮透過性は増加し、内皮ギャップは100-600nm[29]。したがって、望ましいサイズのNPsは腫瘍組織に容易に浸透し、受動的標的薬物送達の効率を劇的に高める可能性がある。

水熱法によるHA-Gd₂O₃ NPsの合成スキーム（A）とその後の生物医学応用（B）

HA-Gd₂O₃ NPsの特性評価。低倍率（a）と高倍率（b）TEM画像。直径分布（c）とXRDパターン（d）

HA-Gd₂O₃ NPsの相構造を、グラファイト酸化物（GO）パウダーを対照としてXRDで調査。図1dに示すように、HA-Gd₂O₃ NPsの回折パターンでは、1つの主回折ピーク（2θ=12.04°）と2つの副ピーク（2θ=29.6°、42.1°）が観察され、それぞれGO（100面）とグラファイト（002面）の特性ピークに対応。HA-Gd₂O₃ NPsの主格子間隔は、ブラッグの式で計算すると0.73nmと、GOの間隔d₀₀₁=0.85nmより小さい。ピーク位置の上方シフトは、sp³層間の間隔減少に起因する可能性がある。すべての広い回折ピークは、HA-Gd₂O₃ NPsが非晶質構造を持つことを示し、これは炭素化プロセス中の高度に無秩序な炭素とsp²（C-C）層間隔の減少に起因する可能性がある。この結果はさらに、結晶性の乏しいHA-Gd₂O₃ NPsが不均一な多層構造を持つことを示し、これはカーボンドットに関する先行報告[30, 31]と一致する。

HA-Gd₂O₃ NPsの化学構造と表面組成

HA-Gd₂O₃ NPsの表面官能基と組成を、フーリエ変換赤外スペクトルとX線光電子分光法で調査。図2aに示すように、XPSスペクトルは284.0、400.0、530.6、1188.5eVの4つの典型的ピークを示し、HA-Gd₂O₃ NPsが主にガドリニウム、炭素、酸素、水素元素で構成されることを示す。Gd 3dの高分解能スペクトル（図2b）は、1187.5eVと1221eVの2つの強いピークを示し、32eVのスピン軌道分裂に対応し、それぞれGdの3d_5/2と3d_3/2準位に対応。これらの観測はHA-Gd₂O₃ NPsの先行報告と良好に一致。図2cのO (1s) スペクトルは、531.4eVに位置する1つの主要ピークで支配され、これはO²⁻とGd³⁺の結合に対応。裸とHA-Gd₂O₃ NPsサンプルの両方でFTIR分光法を実施（図2d）。裸サンプルでは、図2aに示すように、1580と1380cm⁻¹のν_as O-C-Oの特性吸収バンドが炭酸基の存在を示す。3340と2900cm⁻¹の幅広いピークは、それぞれO-HとC-H伸縮振動に帰属し、表面吸着水に対応。HA-Gd₂O₃ NPsでは、1580と1380cm⁻¹のCOO⁻伸縮振動が増強され、ヒアルロン酸のカルボキシル基の導入を示す。これらの結果は、HA-Gd₂O₃ NPsの表面官能基が主に多数のカルボニル、カルボキシル、水酸基を含むことを明らかにした。表面に位置するこれらの官能基の存在が、HA-Gd₂O₃ NPsに水中での優れた分散性を付与。重要なことに、NP表面に埋め込まれたGdイオンは、MRイメージングと放射線感受性化に有用であり、周囲環境へのGdイオン漏出を劇的に防止する。

HA-Gd₂O₃ NPsの化学構造と組成。a HA-Gd₂O₃ NPsのフルスキャンXPSスペクトル。b Gd_3dスペクトル。c O_1sスペクトル。d HA-Gd₂O₃ NPsのFTIRスペクトル

HA-Gd₂O₃ NPsの生体適合性

潜在的生物医学剤としてのHA-Gd₂O₃ NPsの生体適合性は、その生物医学応用にとって極めて重要。まず、CCK-8アッセイでHepG2とVSMC細胞におけるHA-Gd₂O₃ NPsの固有細胞毒性を評価。図3aと補足図1に示すように、HA-Gd₂O₃ NPsは3日間まで明らかな細胞毒性を示さなかった。200μg/mLの濃度でも24時間曝露後、細胞生存率は約90%。第二に、溶血アッセイでHA-Gd₂O₃ NPsの血液適合性をin vivoで推定。図3bに示すように、水（陽性対照）では赤血球の溶血を観察。対照的に、0〜200μg/mLの異なる濃度のHA-Gd₂O₃ NPsインキュベーション後、2時間で明らかな溶血は観察されず、PBS溶液（陰性対照）と類似の結果。陰性対照と比較して、541nmでの上清吸光度に基づき、HA-Gd₂O₃ NPsの様々な濃度での溶血率をわずかに評価。結果は、研究濃度範囲でHA-Gd₂O₃ NPsの溶血率がすべて3%未満であり、優れた血液適合性を確認。潜在的毒性を調べるため、HA-Gd₂O₃ NPsをBalb/cマウスに静脈注射（補足図2参照）。1週間後、これらのマウスを安楽死させ、膀胱、腎臓、脾臓を摘出して病理切片解析。補足図2に示すように、病理切片の結果、HA-Gd₂O₃ NPs処理マウスの臓器に観察可能な病変や炎症反応はなかった。これらの結果は、合成されたHA-Gd₂O₃ NPsが優れた細胞適合性と良好な血液適合性を持つことを明確に示した。

a CCK-8アッセイを用いたHA-Gd₂O₃ NPsのHepG2とVSMC細胞生存率への影響。b 異なる濃度（50、100、200、300、400μg/mL）でのHA-Gd₂O₃ NPsの溶血活性。PBSと水をそれぞれ陰性と陽性対照として使用

MRIファントムスタディ

市販造影剤マグネビスト（Gd-DTPA）を対照として、リン酸緩衝生理食塩水（pH=7.4、0.2M）を用いて、HA-Gd₂O₃ NPsの縦緩和時間（T₁）をin vitroで調査。Gd濃度増加に伴い、T₁強調ファントム画像の信号強度が明確に増加し、すべてのサンプルがT₁強調シーケンスでMRI造影増強を生成できることを示す（図4a）。さらに、信号強度と反転時間のプロットから、特定濃度での各造影剤のT₁緩和時間を得た。図4bに示すように、HA-Gd₂O₃ NPsのr₁値は6.0 mM⁻¹S⁻¹と測定され、同条件下でマグネビスト（3.86 mM⁻¹S⁻¹）より有意に高かった。増強されたr₁は、HA-Gd₂O₃ NPsの 훨씬 더 높은流体動力学的半径と表面積に起因し、したがってNP格子にドープされたより多くのGd原子が水分子にアクセス可能となり、縦緩和を短縮しr₁値を増強する。

a 総Gdイオン濃度の異なるHA-Gd₂O₃ NPsのT₁ファントム画像。b 総Gdイオン濃度に対する1/T₁のプロット。c 静脈注射後、造影剤としてのHA-Gd₂O₃ NPsによるマウスのin vivo T₁ MRイメージングと解析。d 投与後の異なる時間点での膀胱と腎臓の信号変化（SNR比）の定量化（n=3）。*p<0.05

In vivo MRイメージング

in vivoでの潜在的応用を決定するため、正常BALB/cマウスをモデルとしてMRIスキャナでHA-Gd₂O₃ NPs（10mg/kg）のMRイメージング性能と循環運命を調査。投与前画像（図4c）と比較して、破線で示した腎臓と膀胱のより明るい領域が投与後10分で明確に観察され、HA-Gd₂O₃ NPsがin vivoでこれらの主要臓器のT₁緩和を増強するCAとして使用できることを実証。重要なことに、HA-Gd₂O₃ NPsの造影増強は投与後60分まで維持され、これはGd複合体小分子（小動物で数分の半減期）[27]よりはるかに長く、HA-Gd₂O₃ NPsが市販造影剤より長いin vivo保持時間を持つことを示す。MR造影効果を定量的に分析するため、MRI画像の関心領域を詳細に分析して信号対雑音比（SNR）を計算し、SNR_post/SNR_preの値を相対信号増強（RSE）として表現（図4d）。腎臓でのHA-Gd₂O₃ NPsのRSE値は1.35、1.99、1.86。同様に、膀胱でのRSE値は腎臓より高く（1.29、3.59、2.26）。大きなサイズ（100nm以上）のHA-Gd₂O₃ NPsは長い循環時間を示し、先行結果[32]によると胆道腸管経路で排泄される可能性がある。さらに、in vivoでの延長された循環時間は、EPR効果を増強することで腫瘍への受動的標的化効率を高める可能性がある。

腫瘍イメージング

優れたMRイメージング性能と長い循環時間を持つHA-Gd₂O₃ NPsは、EPR効果を通じた腫瘍イメージングの大きな機会を提供。したがって、皮下肝腫瘍モデルを確立し、肝細胞癌（HCC）がHA-Gd₂O₃ NPs増強MRIで検出可能か調査。HA-Gd₂O₃ NPs静脈注射後、冠状断と横断走査の両方で、皮下腫瘍領域が周囲組織より明るくなることを観察（図5a）。皮下腫瘍のRSEは横断と冠状走査でそれぞれ1.54と1.83に劇的に達し、EPR効果を通じたHA-Gd₂O₃ NPsの腫瘍領域への効果的な蓄積を示唆。これらの知見は、HA-Gd₂O₃ NPsが腫瘍のMRI可視化に高感度であることを実証。多くの研究で、長い循環時間が固形腫瘍の漏れやすい血管を通じて受動的標的化効率を促進することが示されている[33]。

HA-Gd₂O₃ NPs静脈注射後のHepsマウス肝癌異種移植腫瘍のT₁強調MRイメージング（a）と対応する定量解析（b）

HA-Gd₂O₃ NPsの放射線感受性化増強

HA-Gd₂O₃ NPsのT₁造影剤としての優れた性能は、腫瘍の放射線感受性化での位置を正確に決定することを促した。まず、CCK-8アッセイを用いて、この併用治療で線量増強が起こるか探った。図6aに示すように、単独HA-Gd₂O₃ NPs（濃度0-200μg/mL）はHepG-2生存率に有意な影響を与えなかったが、X線（範囲0-9Gy）照射で9Gy時にHepG-2細胞生存率を70%未満に低下。重要なことに、X線照射とHA-Gd₂O₃ NPsの併用で、特に200μg/mL、9Gy時にHepG-2細胞生存率を50%未満に劇的に低下。次に、コロニー形成アッセイで、X線照射とHA-Gd₂O₃ NPs併用後のHepG-2細胞生存率を評価。図6bに示すように、単独HA-Gd₂O₃ NPsはHepG-2細胞コロニー形成に劇的影響なし、X線照射でコロニー形成を46.7%に低下。しかし、X線照射とHA-Gd₂O₃ NPs治療で、細胞コロニー形成生存率を29.8%に顕著に抑制。対応する画像がさらに、HepG-2細胞に対するHA-Gd₂O₃ NPsの放射線感受性化を検証。

HA-Gd₂O₃ NPsのin vitro放射線感受性化効果。a CCK-8アッセイを用いたHA-Gd₂O₃ NPs（0、12.5、25、50、100、200μg/mL）とX線照射（0、3、6、9Gy）のHepG2細胞生存率への相乗効果。*p<0.05、**p<0.01、差は統計的に有意。b HA-Gd₂O₃ NPsとX線照射で処理したHepG2細胞のコロニー生存アッセイとc 対応するクローン形成能の定量解析。d 異なる治療後のマウス群の腫瘍体積増加曲線。群：a対照、b放射線、cHA-Gd₂O₃ NPs、d放射線+HA-Gd₂O₃ NPs。e 治療終了時の各群マウスから採取した腫瘍の写真

in vitroでの放射線治療効果に勇気づけられ、HA-Gd₂O₃ NPsと照射を併用して腫瘍保有マウスの腫瘍増殖制御に適用。対照群と単独HA-Gd₂O₃ NPs治療群の腫瘍体積は急速に増加し、両方とも180%増加。単独照射治療58%と比較して、HA-Gd₂O₃ NPsと放射線併用で10日照射後、38%の効率的な腫瘍抑制を示した（図6d）。腫瘍を撮影し、各群の平均腫瘍体積は、群（a）が最高、群（d）が全群中最低（図6e）。これらの結果は、調製HA-Gd₂O₃ NPsがX線照射下での腫瘍増殖抑制に有望であることを明らかにした。

フローサイトメトリーアッセイとライブ/デッド染色アッセイを実施し、HA-Gd₂O₃ NPsとX線照射の併用治療における放射線感受性化メカニズムをさらに理解。図7aに示すように、単独HA-Gd₂O₃ NPs処理HepG-2細胞では緑色蛍光が強く赤色は観察されず、高い細胞生存率を検証。X線照射治療後は少量の赤色蛍光が観察され、低レベルの細胞アポトーシスを示唆。しかし、HA-Gd₂O₃ NPs（200μg/mL）と放射線の併用治療後、強い赤色蛍光が観察され、HA-Gd₂O₃ NPsがX線照射誘起細胞アポトーシスを劇的に増強できることを実証。HA-Gd₂O₃ NPsの放射線感受性化メカニズムをフローサイトメトリーでさらに調査。図7bに示すように、単独放射線とHA-Gd₂O₃ NPsはそれぞれ27.55%と19.12%のG2/M期停止を誘導。しかし、HA-Gd₂O₃ NPsと放射線の併用治療で、G2/M期停止が30.89〜33.27%に用量依存的に顕著に増加。一方、併用治療でサブG1比率で反映されるアポトーシス細胞死が10.63〜22.67%を誘導、単独HA-Gd₂O₃ NPsと放射線はそれぞれ3.02%と13.87%。細胞死の可能性のあるメカニズムをさらに調査するため、フローサイトメトリーでAnnexin V-EGFP/PI法を実施。Annexin V-EGFP発光信号をx軸、PI発光信号をy軸にプロット（図8）。ネクロシス細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞、生存細胞の量は、Annexin V⁻/PI⁺（Q3）、Annexin V⁺/PI⁺（Q2）、Annexin V⁻/PI⁻（Q4）の割合で決定。対照群と単独HA-Gd₂O₃ NPs（100μg/mL）群の細胞アポトーシス率は5%未満で、微妙な影響。単独放射線治療群（8.8%）と比較して、HA-Gd₂O₃ NPsと放射線の併用でのアポトーシス率は濃度増加（50〜200μg/mL）に伴い上昇。特に、初期アポトーシス率が明確に33.2%に増加し、初期と後期アポトーシス合計が濃度200μg/mLで44.3%に到達。一般的に、HA-Gd₂O₃ NPsとX線照射の併用は、細胞コロニー形成、用量依存的な細胞生存率、放射線感受性化増強効果で相乗効果を持つ。これらの結果に基づき、HA-Gd₂O₃ NPsは放射線治療の放射線感受性化増強の効率的な代替となり得る。

HA-Gd₂O₃ NPsの放射線線量増強。a HepG2細胞のライブ-デッド染色。緑（フルオレセインジアセテート染色）=生存細胞、赤（ヨウ化プロピジウム染色）=死細胞。スケールバー=200μm。b 異なる治療後の細胞周期分布を、フローサイトメトリーアッセイでDNA含量を定量化して分析

HA-Gd₂O₃ NPsのアポトーシス解析。a X線照射後24時間でのHepG-2細胞のアポトーシスレベル。b 対応する定量解析

結論

結論として、ワンポット水熱プロセスで、腫瘍の効果的なMRイメージングと放射線感受性化のための二機能性HA-Gd₂O₃ NPsを開発した。HAコーティング後、合成HA-Gd₂O₃ NPsは水中で優れた分散性、優れた生体適合性を示した。結果として得られたHA-Gd₂O₃ NPsはGd原子をカプセル化し、MRIのT₁造影剤として高い縦緩和率（r₁）を効果的に示すだけでなく、細胞アポトーシス誘導と細胞周期ブロックにより腫瘍の放射線感受性を高める放射線感受性化剤としても機能。したがって、新規HA-Gd₂O₃ NPsは腫瘍診断と放射線治療に有望な潜在能力を示す。

材料と方法

材料

フルオレセインジアセテート（FDA）とヨウ化プロピジウム（PI）はSigma（ニューヨーク、NY、USA）から入手。GdCl₃·6H₂O、エチレングリコール（99%）はHengrui製薬（連雲港、江蘇、中国）から購入。Cell Counting Kit-8（CCK-8）は同仁堂（熊本、日本）から購入。NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、H₂SO₄はGuangfu微細化学研究所（南開、天津、中国）から入手。胎児牛血清とDulbecco改良最小必須培地（DMEM）はInvitrogen中国（上海、中国）から購入。すべての化学薬品は分析グレードで、さらなる精製なしで使用。

HA-Gd₂O₃ NPsの合成

HA-Gd₂O₃ NPsをワンポット水熱法で以下のように調製：まず、0.1gのHAを20ml水に室温で一晩激しく攪拌して溶解。その後、0.1gのGdCl₃·6H₂Oと0.5mlのNaOH（1M）をそれぞれ添加。さらに5分間攪拌して均一な透明溶液を形成し、50mlオートクレーブに移し、密封して120℃で6時間水熱処理。室温まで自然冷却後、透明懸濁液を0.22μm膜で濾過し、大型凝集体を除去。調製溶液を14kDa分子量カットオフの透析バッグで水に対して3日間透析。透析液を回収し、真空凍結乾燥機で凍結乾燥。こうして得られたHA-Gd₂O₃ NPs粉末を保存し、さらなる特性評価に用いた。

機器と特性評価

HA-Gd₂O₃ NPsの形態を、200kV加速電圧のJEM-2100顕微鏡（JEOL、東京、日本）の高分解能透過電子顕微鏡で観察。HA-Gd₂O₃ NPsの元素組成を、Al-Kα（1486.6eV）をX線源とするMK II光電子分光計でのXPS測定とフーリエ変換赤外（FTIR）分光計（Nicolet Nexus 470、GMI、Ramsey、MN、USA）で決定。HA-Gd₂O₃ NPsの結晶構造を、Cu Kα（λ=0.15405nm）放射を装備したRigaku-D/MAX2500 X線回折計（Rigaku、日本）でのXRDパターンで特性評価、スキャン速度4°/分、5-80°範囲。

細胞生存率アッセイ

HA-Gd₂O₃ NPsの細胞生存率への影響を、Cell Counting Kit CCK-8アッセイ（CCK-8アッセイ）で研究。HepG2（ヒト肝癌、ATCC番号：HB-8065）とVSMC（血管平滑筋細胞）を、3×10³細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種し、37℃、5% CO₂インキュベータで24時間培養。その後、HA-Gd₂O₃ NPsの異なる濃度（0、25、50、100、200μg/mL）を含むDMEMで培地を置換。さらに4時間インキュベート後、各ウェルに10μLのCCK-8溶液を添加、暗所で4時間インキュベート。吸光度を490nmでSynergy HT Multi-Mode Microplate Reader（Bio Tek、Winooski、VT、USA）で測定。非処理細胞（DMEM）を対照とし、相対細胞生存率（平均±SD、n=5）をAbs_sample/Abs_control×100%で表現。

溶血アッセイ

簡単に、厚生省動物管理規則に従い、19-21g、6週齢の雌BALB/cマウスを準備。ヘパリンナトリウムで安定化した3ml血液を眼球摘出で採取。文献に従い1200rpm、15分で遠心分離し上清を除去。その後、PBSで5回洗浄してマウス赤血球（MRBC）を得る。さらに約3ml血液を眼球摘出で採取、ヘパリンナトリウムで安定化、遠心分離（1200rpm、15分）で上清除去、文献[27]に従いPBSで5回洗浄してMRBCを得る。PBSで10倍希釈、0.1ml MRBCを、HA-Gd₂O₃ NPsの異なる粒子濃度（50-200μg/mL）を含む0.9ml PBS、0.9ml水（陽性対照）、0.9ml PBS（陰性対照）をプレフィルした1.5mlチューブにそれぞれ移す。穏やかに振盪後、室温で2時間インキュベート、その後12,000rpmで1分遠心分離。最後に全サンプルを撮影し、上清（ヘモグロビン）の吸光度をUV-2450 UV-Vis分光光度計で541nmで測定。サンプル、陽性、陰性対照の吸光度差を541nmで割って各サンプルの溶血率を計算。

In vitroおよびIn vivo MRファントムスタディ

In vitroおよびin vivo MR画像を3テスラMRIスキャナ（Magnetom Trio Tim、Siemens、ドイツ）で取得。In vitro T₁ファントム画像研究では、0-16mM範囲の異なる濃度のHA-Gd₂O₃ NPs溶液を96ウェル培養プレートに添加、マグネビスト（市販MR造影剤、Gd-DTPA）を対照として使用。In vivo MRイメージングでは、正常BALB/cマウスをモデルとして選択（n=4）。動物実験は厚生省動物管理規則に厳密に準拠。10mg/kgのHA-Gd₂O₃ NPsを滅菌膜フィルター（孔径0.22μm）で濾過し、静脈注射、即座にMRIスキャナで調査。これらのin vitro MRイメージングサンプルとin vivo動物は以下のパラメータで撮像：TR/TE=300/10ms、256×256マトリックス、スライス=5、厚さ=2mm、平均=2、FOV=80×80。

In vitro放射線感受性化効果

CCK-8アッセイでHA-Gd₂O₃ NPsのin vitro放射線感受性化活性を評価。細胞を3×10³細胞/ウェルの密度で5枚の96ウェルプレートに播種、各プレートを同条件で処理：37℃、5% CO₂インキュベータで24時間培養、その後HA-Gd₂O₃ NPsの異なる濃度（0、12.5、25、50、100、200μg/mL）を含むDMEMで培地置換。4時間インキュベート後、5プレートを異なるX線線量（0、3、6、9Gy）、300cGy/分でそれぞれ照射。照射後、全プレートを4時間インキュベート、同パラメータで吸光度測定。

クローン形成生存アッセイもin vitro放射線感受性化効果研究で実施。HepG2細胞を4.0×10⁴細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種、16時間増殖許容。細胞を細胞培養培地で希釈したHA-Gd₂O₃ NPsで6時間インキュベート。その後、臨床用リニアック（Oncor、Siemens、ドイツ）で6MeV照射、10cm×10cm照射野、ソース・スキン距離（SSD）100cmで全細胞をカバー。その後、照射細胞を14日間増殖許容、室温で4%パラホルムアルデヒドで40分固定、洗浄後1%結晶紫で染色。

ライブ-デッド染色アッセイとフローサイトメトリー

HA-Gd₂O₃ NPsの放射線感受性化効果を研究するため、HepG2細胞を4.0×10⁴細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種、12時間増殖許容、6群設定（対照、HA-Gd₂O₃ NPs、放射線、放射線+50μg/mL HA-Gd₂O₃ NPs、放射線+100μg/mL HA-Gd₂O₃ NPs、放射線+200μg/mL HA-Gd₂O₃ NPs）。プレートで細胞が80%増殖したら、第1群は無処理、第2群は100μg/mL HA-Gd₂O₃ NPsで24時間インキュベート、第3群は照射のみ、第4-6群は照射後、異なる濃度のHA-Gd₂O₃ NPs（50、100、200μg/mL）で24時間インキュベート。その後、FDAとPI作業バッファーを添加して細胞染色。染色細胞の蛍光を蛍光顕微鏡（×20）で観察、生存細胞は緑色、死細胞は赤色。さらに、異なる処理の細胞をPBSで3回洗浄、消化、回収、2000rpmで5分遠心分離、-20℃で一晩70%エタノールで固定、PI染色。DNA断片化をフローサイトメーター（BD、Accuri、C6）でのPI蛍光強度で定量化、ソフトウェア（FLOWJO 7.6.2）で解析し細胞周期分布を明確化。

In vivo放射線感受性化効果

体重19-21g、6週齢の雌BALB/cマウスを揚州大学実験動物センターから標準条件で入手。動物実験は厚生省動物管理規則に準拠。皮下腫瘍モデルを以下の手順で確立：まず、1×10⁶ HepS細胞をマウス腹腔内接種、5日後に腹水採取。次に、これらの腹水を皮下注射。腫瘍サイズが約100mm³に達したら、皮下腫瘍モデルが確立され、以下の実験に適用。

群あたり8匹の皮下腫瘍保有マウスを、7日以内に総線量9Gyとなる3Gy/フラクションで放射線治療。放射線治療は、HA-Gd₂O₃ NPs（10mg/kg）静脈注射3時間後、Siemens Primus臨床用リニアック（6MeV）で自作デバイスを用いて腫瘍全体をカバーして実施。マウスを1%ペントバルビタール（50mg/kg）で麻酔し、照射中の不動を確保。体積を毎日測定記録、ノギス測定から決定、式V=0.5×a×b²で計算。V（mm³）は腫瘍体積、a（mm）とb（mm）は腫瘍長と幅。相対腫瘍体積を初期サイズで正規化。各群8匹で実施、統計解析はStudentの両側t検定（*p<0.05、**p<0.001）。

データと材料の入手可能性

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