磁気共鳴画像法による腫瘍の放射線治療のためのヒアルロン酸官能化酸化ガドリニウムナノ粒子

要約

固形腫瘍の不正確な局在化と内因性放射線耐性は、放射線療法の臨床的実施を深刻に妨げました。この研究では、ヒアルロン酸で官能化された酸化ガドリニウムナノ粒子（HA-Gd ₂ O ₃ NP）は、腫瘍の効果的な磁気共鳴（MR）イメージングおよび放射線増感のためのワンポット水熱プロセスを介して行われます。 HAの機能化により、準備されたままのHA-Gd ₂ O ₃ 直径105nmのNPは、水中での良好な分散性、低い細胞毒性、および優れた生体適合性を示し、HA受容体を介したエンドサイトーシスによって癌細胞の細胞質に容易に侵入しました。重要なのは、HA-Gd ₂ O ₃ NPは高い縦緩和能を示しました（ r ₁ ）6.0 mM ^-1 S ^-1 MRI造影剤および線量依存的な方法での放射線増感増強として。これらの発見は、合成されたままのHA-Gd ₂ O ₃ 二機能性治療薬としてのNPは、腫瘍の診断と放射線療法に大きな可能性を秘めています。

はじめに

放射線療法は癌に広く適用されており、高エネルギーX線と、フリーラジカル損傷またはDNA損傷を引き起こすことによる腫瘍部位への照射線量の沈着が含まれます[1,2,3,4]。しかし、放射線感受性の低さ、腫瘍の局在の不正確さ、病変間の識別の低さ、および照射の副作用を引き起こす正常組織は、放射線療法の臨床的実施を制限します[5]。したがって、全身性の副作用を最小限に抑えながら腫瘍の放射線感受性を高める方法を開発することが重要です。ナノテクノロジーと放射線療法の組み合わせは、放射線増感の確立された優先事項です。

近年、ナノテクノロジーは癌の診断と治療のための魅力的な戦略と見なされてきました[6,7,8,9,10,11]。ナノ粒子（NP）の主な機能の1つは、受動的ターゲティング、強化された透過性および保持（EPR）効果、能動的ターゲティング、および循環時間の延長による腫瘍組織内のNPの選択的蓄積に基づく正確な腫瘍ターゲティングです[12、 13,14]。私たちの以前の研究は、ヘテロ原子で炭素NPをドーピングすると、それらの固有の特性が効果的に調整され、有益な機能が導入されることを示しました[15、16、17]。興味深いことに、NPは放射線増感剤として使用できます[18]。有望な放射線増感剤としての重金属（高Z元素を含む）NP（Au、Bi、Gdなど）は、X線光子捕獲断面積が高くコンプトン散乱効果があるため、放射線増感療法に使用できます[19]。 X線が高Zナノ粒子、オージェ電子、および光電子と相互作用すると、二次電子の放出により癌細胞が損傷し、放射線療法中の線量が増加します[20]。現在まで、ガドリニウムベースのNP（GdNP）は、効果的なMRI造影剤（CA）[21、22]であり、正常組織を病変組織や病変から非侵襲的にリアルタイムで区別することが示されています。これらの薬剤は、縦緩和時間を短縮して縦緩和に影響を与えます r ₁ [23]、そしてそれらの不正確なターゲティングはしばしば副作用を引き起こします。ヒアルロン酸（HA）が主要なリガンドであり、クラスター決定基44（CD44）[24,25,26]などのHA受容体を持つ部位を標的とするドラッグデリバリーキャリアであることはよく知られています。

以前の研究の結果に基づいて、Gd ₂を機能化するためのターゲティングリガンドとしてHAを使用しました O ₃ 二重機能を備えたNP：固有の放射線耐性と腫瘍局在化の不正確さを克服するための効果的な腫瘍標的MRICAと放射線増感剤。さらに、HA-Gd ₂ O ₃ NPは高い縦緩和能を示します（ r ₁ ）より良いMRイメージング品質を備えた有望なMRイメージング剤として。現在利用可能なCA [27、28]と比較すると、結果として得られるHA-Gd ₂ O ₃ NPには、3つの重要な利点があります。1つは、HA-Gd ₂ O ₃ NPは、前駆体として天然の細胞外マトリックスを使用するため、良好な生体適合性を示します。第二に、HAの機能化は腫瘍の標的化を大幅に改善し、副作用を軽減します。最後に、HA-Gd ₂ O ₃ NPは、診断と治療において二機能性を備えています。有効性を検証し、放射線増感増強のメカニズムを調査するために、HA-Gd ₂の放射線増感効果を評価しました。 O ₃ 腫瘍細胞の生存率、細胞周期、およびアポトーシスに関するNP。

結果と考察

HA-Gd ₂の準備と特性評価 O ₃ NP

この研究では、HA-Gd ₂ O ₃ NPは、スキーム1に示すように、単純な水熱プロセスを使用して正常に準備されました。粒子サイズは動的光散乱によって分析され、形態学的検査は透過型電子顕微鏡によって行われました。図1aに示すように、HA-Gd ₂ O ₃ NPは、見かけの凝集がなく、均一な分散と離散的な準球形を示しました。 HA-Gd ₂の平均直径 O ₃ NPは105nmでした。正常組織と比較して、腫瘍組織の毛細血管内皮透過性は増加し、内皮ギャップは100〜600nmでした[29]。したがって、望ましいサイズのNPは腫瘍組織に容易に浸され、受動的標的化ドラッグデリバリーの効率を劇的に向上させる可能性があります。

HA-Gd ₂の相構造 O ₃ NPは、コントロールとして酸化グラファイト（GO）パワーを使用するXRDによって調査されました。図1dに示すように、1つの主要な回折ピーク（2 θ =12.04°）と2つのマイナーピーク（2 θ =29.6°、42.1°）がHA-Gd ₂で観察されました O ₃ GO（100面）とグラファイト（002面）の特徴的なピークにそれぞれ対応するNP回折パターン。 HA-Gd ₂の主な格子間隔 O ₃ NPは、 d のGO間隔よりも小さい間隔（ブラッグの式で計算すると0.73 nm）を示しました。 ₀₀₁ =0.85 nm、ピーク位置の上方シフトは、sp ³ 間の間隔の減少に起因する可能性があります。レイヤー。すべての広い回折ピークは、HA-Gd ₂ O ₃ NPはアモルファス構造を持っていました。これは、高度に無秩序な炭素とsp ² の減少に起因する可能性があります。（C–C）炭化プロセス中の層間隔。結果はさらにHA-Gd ₂を示しました O ₃ 結晶性の悪いNPは、不均一な多層構造を持っていました。これは、カーボンドットに関する以前の報告と一致していました[30、31]。

HA-Gd _{2の化学構造と表面組成} O ₃ NP

HA-Gd ₂の表面官能基と組成 O ₃ NPは、フーリエ変換赤外スペクトルとX線光電子分光法を使用して調査されました。図2aに示すように、XPSスペクトルは、284.0、400.0、530.6、および1188.5 eVに4つの典型的なピークを示し、HA-Gd ₂ O ₃ NPは主にガドリニウム、炭素、酸素、水素の元素で構成されていました。 Gd _{3 d の高解像度スペクトル} （図2b）は、1187.5eVと1221eVに2つの強いピークが存在することを示しています。これは、それぞれ3 d に対応する32eVのスピン軌道相互作用に対応します。 _5/2 および3 d _3/2 Gdのエネルギーレベル。これらの観察結果は、HA-Gd ₂の以前の報告とよく一致していました。 O ₃ NP。 O（1 s ）図2cに示すスペクトルは、531.4 eVに位置する1つの主要なピークによって支配されていました。これは、O ^2- 間の結合に対応します。およびGd ³⁺ 。 FITR分光法は、裸とHA-Gd ₂の両方に対して実施されました。 O ₃ NPサンプル（図2d）。裸のサンプルの場合、図2aに示すように、 v の特徴的な吸収帯 _as 1580および1380cm ^-1 でのO–C–O 炭酸基の存在を明らかにした。 3340および2900cm ^-1 の広いピーク表面吸着水に対応するO–HおよびC–H伸縮振動にそれぞれ起因していました。 HA-Gd ₂の場合 O ₃ NP、COOの伸縮振動^- 1580および1380cm ^-1 強化され、ヒアルロン酸のカルボン酸基の導入を示しています。これらの結果は、HA-Gd ₂の官能基が O ₃ NPは主に、特定の多数のカルボニル、カルボキシレート、およびヒドロキシル基を含んでいました。表面にあるこれらの官能基の存在は、HA-Gd ₂に恵まれています O ₃ 水への分散性に優れたNP。重要なことに、NPの表面に埋め込まれたGdイオンは、MRイメージングと放射線増感に役立つ可能性があり、Gdイオンが周囲の環境に漏れるのを劇的に防ぎました。

HA-Gd ₂の生体適合性 O ₃ NP

HA-Gd ₂の生体適合性 O ₃ 潜在的な生物医学的薬剤としてのNPは、それらの生物医学的応用にとって重要です。まず、HA-Gd ₂の固有の細胞毒性 O ₃ NPは、CCK-8アッセイを使用してHepG2およびVSMC細胞で評価されました。図3aおよびSに示すように。図1、HA-Gd ₂ O ₃ NPは3日まで明らかな細胞毒性を示さなかった。 24時間の曝露時間後の200μg/ mLの濃度でも、細胞生存率は約90％でした。第二に、HA-Gd ₂の血液適合性 O ₃ インビボでのＮＰは、溶血アッセイを使用して推定された。図3bに示すように、水中の赤血球の溶血を観察しました（陽性対照）。対照的に、HA-Gd ₂の後に明らかな溶血は観察されませんでした O ₃ 0〜200μg / mLのさまざまな濃度で2時間のNPインキュベーション。これは、PBS溶液（ネガティブコントロール）の結果と同様でした。ネガティブコントロールと比較して、HA-Gd ₂のさまざまな濃度での溶血の割合 O ₃ NPは、541nmでの上清の吸光度に基づいてわずかに評価されました。結果は、HA-Gd ₂の溶血率が O ₃ NPはすべて、研究された濃度で3％未満であり、それらの好ましい血液適合性を確認しました。潜在的な毒性を調べるために、HA-Gd ₂ O ₃ NPをBalb / cマウスに静脈内注射しました（S.図2に見られるように）。１週間後、これらのマウスを処刑し、膀胱、腎臓、および脾臓を病理学的切片分析のために採取した。 S.図2に示すように、病理学的切片の結果は、HA-Gd ₂の臓器に観察可能な病変または炎症反応がないことを示しました。 O ₃ NP処理マウス。これらの結果は、合成されたままのHA-Gd ₂ O ₃ NPは良好な細胞適合性と良好な血液適合性を示しました。

MRIファントム研究

縦方向（ T ₁ ）HA-Gd ₂の緩和時間 O ₃ NPは、リン酸緩衝生理食塩水（pH =7.4、0.2 M）を使用して、コントロールとして市販のコントラストMagnevist（Gd-DTPA）と一緒にinvitroで調査されました。 Gd濃度の増加に伴い、 T の信号強度 ₁ -重みファントム画像は明らかに増加し、すべてのサンプルが T でMRIコントラスト強調を生成できることを示しています ₁ -重み付けされたシーケンス（図4a）。さらに、信号強度と反転時間のプロットから、 T が得られました。 ₁ -特定の濃度での各造影剤の緩和時間。図4bに示すように、 r ₁ HA-Gd ₂の値 O ₃ NPは6.0mM ^-1 と測定されました S ^-1 、マグネビストよりも有意に高かった（3.86 mM ^-1 S ^-1 ）同じ条件下で。強化された r ₁ HA-Gd ₂のはるかに高い流体力学的半径と表面積に起因する可能性があります O ₃ NP;したがって、NPの格子にドープされたより多くのGd原子が水分子にアクセスできるようになり、縦方向の緩和が短縮され、 r が強化されました。 ₁ 値。

MR Imaging In Vivo

インビボでの潜在的な用途を決定するために、HA-Gd ₂のMRイメージング性能と循環運命 O ₃ NP（10 mg / kg）は、モデルとして通常のBALB / cマウスを使用したMRIスキャナーを使用して調査されました。注射前の画像（図4c）と比較すると、破線の円で示されている腎臓と膀胱の明るい領域は、注射後10分ではっきりと観察され、HA-Gd ₂ O ₃ CAが T を強化するため、NPを使用できます。 ₁ インビボでのこれらの主要な器官における弛緩。重要なのは、HA-Gd ₂のコントラスト強調です。 O ₃ NPは注射後60分まで維持されました。これはGd複合体小分子の半減期よりもはるかに長かった[27]。これはHA-Gd ₂ O ₃ NPは、市販のコントラストよりもinvivoでの保持時間が長くなりました。 MR造影効果を定量的に分析するために、MRI画像の関心領域を細かく分析して信号対雑音比（SNR）を計算し、SNR _postの値を計算しました。 / SNR _pre 相対信号増強（RSE）を表すため（図4d）。 HA-Gd ₂のRSE値 O ₃ 腎臓のNPは1.35、1.99、および1.86でした。同様に、HA-Gd ₂のRSE値 O ₃ 膀胱のNPは腎臓のNPよりも高かった（1.29、3.59、および2.26）。 HA-Gd ₂ O ₃ 大きなサイズ（100 nm以上）のNPは長い循環時間を示し、以前の結果[32]によれば、胆道腸経路で排除される可能性があります。さらに、in vivoでの循環時間が長くなると、EPR効果が高まるため、腫瘍の受動的ターゲティングが増加する可能性があります。

腫瘍画像

HA-Gd ₂ O ₃ 優れたMRイメージング性能と長い循環時間を備えたNPは、EPR効果を通じて腫瘍をイメージングする絶好の機会を提供します。したがって、肝細胞癌（HCC）がHA-Gd ₂によって検出できるかどうかを調査するために、皮下肝腫瘍モデルを確立しました。 O ₃ NPで強化されたMRI。 HA-Gd ₂の静脈内注射後 O ₃ NPの場合、冠状スキャンと横スキャンの両方で見られるように、皮下腫瘍領域が周囲の組織よりも明るくなることが観察されました（図5a）。皮下腫瘍のRESは、横方向および冠状方向のスキャンでそれぞれ1.54および1.83に劇的に達し、HA-Gd ₂の効果的な蓄積を示しています。 O ₃ EPR効果による腫瘍領域のNP。これらの調査結果は、HA-Gd ₂ O ₃ NPは、腫瘍のMRI視覚化に非常に敏感です。多くの研究は、長い循環時間が固形腫瘍の漏出性血管系を介した受動的標的化の効率を促進する可能性があることを示しました[33]。

HA-Gd ₂の放射線増感強化 O ₃ NP

HA-Gd ₂の優れたパフォーマンス O ₃ T としてのNP ₁ 造影剤は、腫瘍の放射線増感におけるその位置を正確に決定するように促しました。最初に、この併用療法で用量増強が起こったかどうかを、CCK-8アッセイを使用して調べた。図6aに示すように、単一のHA-Gd ₂ O ₃ NP（濃度0–200μg / mL）はHepG-2の生存率に有意な影響を与えませんでしたが、X線（範囲0–9 Gy）照射はHepG-2細胞の生存率を9 Gyで70％未満に減少させました。重要なのは、X線照射とHA-Gd ₂の組み合わせです。 O ₃ NPは、特に9Gyで200μg/ mLの濃度でHepG-2細胞の生存率を50％未満に劇的に低下させました。次に、クローン原性アッセイを実施して、X線照射とHA-Gd ₂の組み合わせ後のHepG-2細胞の細胞生存率を評価しました。 O ₃ NP。図6bに示すように、単一のHA-Gd ₂ O ₃ NPはHepG-2細胞コロニー形成に劇的な影響を与えませんでしたが、X線照射はHepG-2細胞コロニー形成を46.7％に減少させました。ただし、X線照射とHA-Gd ₂による治療 O ₃ NPは、細胞コロニー形成の生存率を29.8％まで著しく抑制しました。対応する画像は、HA-Gd ₂の放射線増感をさらに検証しました O ₃ HepG-2細胞に対するNP。

インビトロでの放射線療法の有効性は、HA-Gd ₂を適用することを私たちに促しました O ₃ NPを照射と組み合わせて、担癌マウスの腫瘍増殖を制御します。コントロールおよび単一のHA-Gd ₂における腫瘍の体積 O ₃ NP治療は急速に成長し、両方とも180％増加しました。単回照射処理58％と比較して、HA-Gd ₂ O ₃ 放射線と組み合わせたNPは、10日間の照射後に38％の効率的な腫瘍抑制を示しました（図6d）。腫瘍の写真を撮り、各グループの平均腫瘍体積は、グループ（a）の平均腫瘍体積が最も高く、グループ（d）の平均腫瘍体積がすべてのグループの中で最も低いことを示しました（図6e）。これらの結果は、調製されたままのHA-Gd ₂ O ₃ NPは、X線照射下での腫瘍増殖の抑制に有望です。

HA-Gd ₂の併用治療における放射線増感メカニズムをさらに理解するために、フローサイトメトリーアッセイと生/死染色アッセイを実施しました。 O ₃ NPとX線放射。図7aに示すように、単一のHA-Gd ₂で処理したHepG-2細胞では、赤色のない強い緑色の蛍光が観察されました。 O ₃ 高い細胞生存率を確認したNP。 X線放射線治療後に少量の赤色蛍光が観察され、細胞アポトーシスのレベルが低いことを示しています。しかし、HA-Gd ₂の併用治療後、強い赤色蛍光が観察されました。 O ₃ NP（200μg/ mL）と放射線、HA-Gd ₂ O ₃ NPは、X線照射によって誘導される細胞アポトーシスを劇的に増強する可能性があります。 HA-Gd ₂の放射線増感メカニズム O ₃ NPは、フローサイトメトリーを使用してさらに調査されました。図7bに示すように、単一放射線とHA-Gd ₂ O ₃ NPは、G2 / M期停止のそれぞれ27.55％と19.12％を誘発しました。ただし、HA-Gd ₂の併用治療 O ₃ NPと放射線は、G2 / M期停止を著しく増加させ、線量依存的に30.89から33.27％の範囲でした。一方、併用療法は、単一のHA-Gd ₂の場合のサブG1の比率に反映されるように、10.63％から22.67％のアポトーシス細胞死を誘発しました。 O ₃ NPと放射線は3.02％と13.87％を誘発しました。細胞死の考えられるメカニズムをさらに調査するために、フローサイトメトリーによってアネキシンV-EGFP / PI法を実施しました。アネキシンV-EGFP発光シグナルを x にプロットしました -軸、PI発光信号は y にプロットされています -軸（図8）。壊死細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞、および生細胞の量は、アネキシンV ^- のパーセンテージによって決定されました。 / PI ⁺ （Q3）、アネキシンV ⁺ / PI ⁺ （Q2）、およびアネキシンV ^- / PI ⁻ （Q4）、それぞれ。対照群および単一のHA-Gd ₂の細胞のアポトーシス率 O ₃ NP（100μg/ mL）グループは5％未満であり、微妙な影響をもたらしました。単一放射線治療群（8.8％）と比較して、HA-Gd ₂の組み合わせのアポトーシス率 O ₃ NPと放射線は、濃度が50から200μg/ mLの範囲で増加するにつれて増加しました。特に、細胞の初期アポトーシス率は明らかに33.2％に増加し、濃度が200μg/ mLの場合、初期および後期アポトーシスは44.3％に達しました。一般的に、HA-Gd ₂の組み合わせ O ₃ NPとX線照射は、細胞コロニー形成、線量依存的に細胞生存率、および放射線増感増強効果に相乗効果をもたらしました。これらの結果に基づいて、HA-Gd ₂ O ₃ NPは、放射線療法の放射線増感を強化するための効率的な代替手段となる可能性があります。

結論

結論として、二機能性HA-Gd ₂を開発しました O ₃ ワンポット水熱プロセスにおける腫瘍の効果的なMRイメージングと放射線増感のためのNP。 HAでコーティングした後、合成されたままのHA-Gd ₂ O ₃ NPは、水中での良好な分散性、優れた生体適合性を示しました。結果として得られるHA-Gd ₂ O ₃ Gd原子をカプセル化するNPは、高い縦緩和能（ r ）を効果的に示しただけではありません。 ₁ ） T としてのMRIの場合 ₁ 造影剤だけでなく、細胞アポトーシスを誘導し、放射線増感剤として細胞周期を遮断することにより、腫瘍の放射線感受性を増強しました。したがって、新規のHA-Gd ₂ O ₃ NPは、腫瘍の診断と放射線療法に有望な可能性を示しています。

材料と方法

資料

フルオレセインジアセテート（FDA）とヨウ化プロピジウム（PI）は、Sigma（New York、NY、USA）から購入しました。 GdCl ₃ ・6H ₂ O、エチレングリコール（99％）は、Hengrui Pharmaceutical Co.、Ltd。（Lianyungang、Jiangsu、People’s Republic ofChina）から購入しました。 Cell Counting Kit-8（CCK-8）は、同仁堂（熊本県）から購入しました。 NaH ₂ PO ₄ 、Na ₂ HPO ₄ 、およびH ₂ SO ₄ 光復ファインケミカル研究所（南開、天津、中華人民共和国）から入手しました。ウシ胎児血清およびダルベッコの最小必須培地（DMEM）は、Invitrogen China Limited（上海、中華人民共和国）から購入しました。すべての化学物質は分析グレードであり、さらに精製することなく使用されました。

HA-Gd ₂の合成 O ₃ NP

HA-Gd ₂ O ₃ NPは、次のようにワンポット熱水アプローチを使用して調製しました。まず、0.1gのHAを20mLの水に溶解し、周囲温度で一晩激しく攪拌しました。続いて、0.1gのGdCl ₃ ・6H ₂ Oおよび0.5mLのNaOH（1 M）をそれぞれ添加しました。次に、混合物をさらに5分間撹拌して均一な透明な溶液を形成し、50 mLオートクレーブに移して密封し、120℃で6時間水熱処理しました。自然に室温まで冷却した後、透明な懸濁液を0.22μmの膜で濾過して、大きなサイズの凝集物をすべて除去した。次に、調製した溶液を、分子量カットオフが14kDaの透析バッグ内で水に対して3日間透析しました。透析溶液を収集し、真空凍結乾燥機を使用して凍結乾燥させた。 HA-Gd ₂ O ₃ このようにして、NP粉末が得られ、さらなる特性評価のために保存されました。

計装と特性評価

HA-Gd ₂の形態 O ₃ NPは、200 kVの加速電圧下でJEM-2100顕微鏡（JEOL、東京、日本）の高分解能透過型電子顕微鏡によって検査されました。 HA-Gd ₂の元素組成 O ₃ NPは、X線源としてAl-Ka（1486.6 eV）およびフーリエ変換赤外（FTIR）分光計（Nicolet Nexus 470、GMI、ミネソタ州ラムジー、米国）を使用したMKII光電子分光計でのXPS測定によって決定されました。 HA-Gd ₂の結晶構造 O ₃ NPは、CuKα（λ）を備えたRigaku-D / MAX2500回折計（Rigaku、日本）でのX線回折（XRD）パターンによって特徴付けられました。 =0.15405 nm）5〜80°の範囲で4°/分のスキャン速度での放射線。

細胞生存率アッセイ

HA-Gd ₂の影響 O ₃ 細胞生存率に関するNPは、Cell Counting Kit CCK-8アッセイ（CCK-8アッセイ）を介して研究されました。 HepG2（ヒト肝細胞癌、ATCC番号：HB-8065）およびVSMC（血管平滑筋細胞）を96ウェルプレートに3×10 ³ の密度で播種しました。細胞/ウェルおよび5％CO ₂で37°Cで培養インキュベーターで24時間培養した後、さまざまな濃度のHA-Gd ₂を含むDMEMを使用します。 O ₃ 増殖培地を置き換えるNP（0μg/ mL、25μg/ mL、50μg/ mL、100μg/ mL、および200μg/ mL）。さらに4時間インキュベートした後、各ウェルに10μLのCCK-8溶液を加え、細胞を暗所で4時間インキュベートしました。 Synergy HTマルチモードマイクロプレートリーダー（Bio Tek、Winooski、VT、USA）を使用して、490nmで吸光度を測定しました。未処理の細胞（DMEM）をコントロールとして使用し、相対的な細胞生存率（平均SD、 n =5）Abssample / Abscontrol×100％として表されました。

溶血アッセイ

簡単に説明すると、19〜21 g、6週齢の雌のBALB / cマウスは、中華人民共和国保健省の動物管理規則によって親切に準備されました。眼球を取り除くことで、ヘパリンナトリウムで安定した3ミリリットルの血液が得られました。次に、文献に従って、1200rpm、15分で上澄みを除去するために遠心分離した。その後、沈殿物をPBSで5回洗浄してマウス赤血球（MRBC）を取得し、次に眼球を除去して約3 mLの血液を採取し、ヘパリンナトリウムで安定させ、遠心分離（1、200 rpm、15分）します。文献[27]に従って上清を除去し、PBSで5回洗浄して、マウス赤血球（MRBC）を得た。 PBSで10倍に希釈し、0.1mLのMRBCをさまざまな粒子濃度（50〜200μg / mL）のHA-Gd ₂を含む0.9mLのPBSをあらかじめ充填した1.5mLのチューブに移しました。 O ₃ NP、0.9 mLの水（ポジティブコントロールとして）、および0.9 mLのPBS（ネガティブコントロールとして）。穏やかに振とうした後、混合物を室温で2時間インキュベートし、次に12,000rpmで1分間遠心分離した。最後に、すべてのサンプルの写真を撮り、上澄み（ヘモグロビン）の吸光度をUV-2450UV-Vis分光光度計で測定しました。さまざまなサンプルの溶血率は、サンプル間の吸光度の差、541nmでのポジティブコントロールとネガティブコントロールを割ることによって計算されました。

invitroおよびinvivoでのMRファントム研究

In vitro and in vivo MR images were acquired on 3 Tesla MRI scanner (Magnetom Trio Tim, Siemens, Germany). To study the T ₁ phantom images in vitro, the solution of HA-Gd₂ O ₃ NPs with different concentrations ranging from 0 to 16 mM was added to a 96-well culture plate, using the Magnevist (commercial MR contrast agent, Gd-DTPA) as control. For MR imaging in vivo, we chose the normal BALB/c mice as the model (n =4）。 Animal experiments were strictly conformed to the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. Ten milligrams per kilogram of HA-Gd₂ O ₃ NPs filtering through sterilized membrane filters (pore size 0.22 μm) were intravenously injected into the animals, then immediately investigated with a MRI scanner. These samples for MR imaging in vitro and animals in vivo were imaged with the following parameters:TR/TE =300/10 ms, 256 × 256 matrices, slices =5, thickness =2 mm, averages =2, FOV =80 × 80.

Radiosensitization Effect In Vitro

CCK-8 assay was used to evaluate radiosensitizing activity of HA-Gd₂ O ₃ NPs in vitro. Cells were seeded in five 96-well plates at a density of 3 × 10³ cells/well, and each plate was treated at the same condition:cultured at 37 °C in 5% CO₂ incubator for 24 h, then using DMEM containing different concentrations of HA-Gd₂ O ₃ NPs (0 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, and 200 μg/mL) replacing the growth medium. After incubation for 4 h, five plates were irradiated at different X-ray doses (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, and 9 Gy), 300 cGy/min, respectively. After radiation, all the plates were incubated for 4 h, then measuring the absorbance under the same parameters.

Clonogenic survival assay was also conducted to study the radiosensitization effect in vitro. HepG2 cells were seeded in six-well plates at 4.0 × 10⁴ cells/well and allowed to grow for 16 h. The cells were incubated with HA-Gd₂ O ₃ NPs diluted in cell culture medium for 6 h. The cells were then irradiated at 6 Gy using a clinical linear accelerator (Oncor, Siemens, Germany) with 6 MeV irradiation using a 10 cm × 10 cm radiation field at a source-to-skin distance (SSD) of 100 cm to cover the entire cells. Then, these irradiated cells were allowed to grow for 14 days, fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 40 min, stained with a 1% crystal violet after washing the cells.

Live-Dead Staining Assay and Flow Cytometry

To study the radiosensitization effect of HA-Gd₂ O ₃ NPs, HepG2 cells were seeded in six-well plates at a density of 4.0 × 10⁴ cells/well and allowed to grow for 12 h and set six groups (control, HA-Gd₂ O ₃ NPs, radiation, radiation + 50 μg/mL HA-Gd₂ O ₃ NPs, radiation + 100 μg/mL HA-Gd₂ O ₃ NPs and radiation + 200 μg/mL HA-Gd₂ O ₃ NPs). When cells were grown to 80% in plates, the first group had no treatment, the second group was incubated with 100 μg/mL HA-Gd₂ O ₃ NPs for 24 h, the third group was just irradiated, and the fourth group to the sixth group were irradiated and incubated with different concentrations of HA-Gd₂ O ₃ NPs (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h, respectively. After that, FDA and PI working buffer were added for cell staining. The fluorescence of stained cells was observed under a fluorescence microscope (×20), and live cells showed green color and dead ones exhibited red color. Furthermore, cells by different treatments were washed three times with PBS, digested, collected, and centrifuged at a speed of 2000 rpm for 5 min, then fixed with 70% ethanol at − 20 °C overnight followed by PI staining. DNA fragmentation was quantified by the fluorescence intensity of PI on a flow cytometer (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analyzed by software (FLOWJO 7. 6. 2) to make clear the cell cycle distribution.

Radiosensitization Effect In Vivo

Female BALB/c mice with body weights of 19–21 g and ages of 6 weeks were obtained from the Yangzhou University Laboratory Animal Center under the standard conditions. Animal experiments were compliant with the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. A subcutaneous tumor model was established as the following procedures:First, 1 × 10 ⁶ HepS cells were inoculated into mice intraperitoneal, and the ascites were collected after 5 days. Then, these ascites were injected into subcutaneous. When the tumor sizes reached approximately 100 mm³ , subcutaneous tumors models were established and applied to the following experiments.

Eight mice bearing subcutaneous tumors per group were treated with radiation at 3 Gy per fraction to a total dose of 9 Gy within 7 days. The radiotherapy was conducted after 3 h intravenous injection of HA-Gd₂ O ₃ NPs (10 mg/Kg), on a Siemens Primus clinical linear accelerator (6 MeV) using a self-made device to cover the entire tumor. These mice were anesthetized by 1% pentobarbital (50 mg/kg) to assure immobility during irradiation. The volume was measured and recorded every day, determined from caliper measurement, and calculated by the formulae:V =0.5 × a × b ² , where V (mm³ ) is the volume of the tumor, and a (mm) and b (mm) are the tumor length and tumor width, respectively. Relative tumor volumes were normalized to their initial sizes. Each group was conducted on eight mice, wherein statistical analysis was performed using Student’s two-tailed t test (*p <0.05, **p <0.001).