In VivoCTイメージングおよび腎クリアランス特性のための新しい生体適合性AuNanostars @PEGナノ粒子

背景

過去10年間で、ナノバイオテクノロジーにおけるナノ粒子の急速な発展は、その多様な構成材料と大きな表面積のために目撃されてきました[1、2]。これらのナノ粒子の中で、Auは生物医学分野での優れた生体適合性と親和性として広く利用されています[3、4]。近年、Auナノ粒子は、原子番号が大きく、貴金属、化学的不活性があり、体内反応でタンパク質が容易ではないため、CTイメージングで広く使用されています[5,6,7]。

CTイメージングは​​、X線発生器のさまざまな組織または臓器のさまざまな密度と厚さをさまざまな程度で減衰させ、グレースケール画像のコントラストのさまざまな組織または臓器の分布を形成する非侵襲的な臨床診断ツールです。病変、および形状のサイズが変化します[8、9、10、11]。現在、CT造影剤の臨床応用には、主に有機ヨウ素を含む小分子であるヨウ素化合物と、ジアトリゾエート（ジアトリゾ酸（DTA））やイオヘキソール（オムニパック）などの無機ヨウ素小分子化合物が含まれています[12]。しかし、ヨウ素含有化合物の効果を除去する小分子ヨウ素ベースの造影剤は、非常に短いイメージング時間しか必要とせず、腎臓毒性が低いわけではありません[13、14]。臨床診療では、腎機能の低下は、ヨウ素化造影剤の合併症の1つです[15]。したがって、ナノ材料の開発は、これらの問題を解決するための新しいアイデアと方法を提供します。最近の研究では、ナノ粒子ベースのCT造影剤は、イメージング時間を効果的に延長し、腎臓毒性を弱め、金ナノ粒子やナノ銀粒子などのヨウ素ベースの造影剤よりも優れたX線減衰を示すことが確認されています。 CT造影剤は研究​​者の注目を集めています[16、17、18]。デンドリマーナノプラットフォームは、ヨード造影剤の修飾小分子としてだけでなく、テンプレートパッケージとして、またさまざまな無機ナノ粒子の安定性として、造影剤の血液循環時間を改善し、CTイメージングに適しています[19]。

この研究では、PEGで機能化されたAuナノスターナノ粒子（AuNS @ PEG）を準備しました。同じサイズの通常のAuナノ粒子と比較して表面積が大きいため、AuナノスターはCTイメージングを大幅に向上させることができます。 PEGで機能化した後、Auナノスターナノ粒子はその生体適合性と腎クリアランス特性を改善する可能性があります。 TEM、EDX、XPS、MTT、フローサイトメトリーなどのさまざまな方法を使用して、AuNS @PEGナノ粒子の特性と生体適合性を決定しました。さらに、組織学的分析および血液学的研究が、インビボでのAuNS @ PEGナノ粒子の毒性に関する試験に使用されており、その結果は、AuNS @PEGナノ粒子の優れた生体適合性を確認した。さらに、invitroおよびinvivoのCTイメージング実験でも、AuNS @PEGナノ粒子の優れたCTイメージング機能が示されました。これらすべての結果から、合成された造影剤AuNS @ PEGナノ粒子は、CTイメージングに広く使用でき、良好な腎クリアランス特性を備えていることが明らかになりました。

メソッド

関連する詳細を含むすべての実験プロトコルは、中国遼寧省の錦州医科大学の地域倫理委員会によって承認されました。

材料と器具

すべての化学物質はSigma-Aldrich（ミズーリ州セントルイス）から購入し、特に記載がない限り直接使用しました。

合成されたナノ粒子は、透過型電子顕微鏡（TEM）および200 kV加速電圧（Tecnai G2 Twin、FEI、オレゴン州ヒルズボロ）を使用したエネルギー分散型X線（EDX）分析によって特徴づけられました。 TEMサンプルは、formvar /カーボンコーティングされた銅グリッド上で希釈されたナノ粒子溶液を乾燥させることによって準備されました。サンプルは、希釈したコロイド溶液をカーボングリッド上に滴下し、液体を室温で空気中で乾燥させることによって調製しました。島津UV-2450UV / Vis / NIR分光光度計でUV-vis吸着スペクトルを記録しました。動的光散乱（DLS）測定は、Malvern Zetasizer NANOZSで25°Cで実行されました。

Au Nanostars / PEG（AuNS @ PEG）ナノ粒子の合成

Auナノスター（Au NS）は、以前のレポート[20,21,22]に従って、わずかな調整を加えて、シードを介した成長法によって合成されました。通常、直径10 nmで形成されたAuシードは、HAuCl ₄ の化学還元によって合成されました。 以前の報告によると[23]; 6 ml HAuCl ₄ 解決策（ w / v 1％）を140 mlの超純水に加え、攪拌しながら沸騰するまで加熱しました。次に、0.75 mlのオレイルアミンをすばやく注入し、得られた混合物をさらに2時間煮沸しました。 Auコロイドは自然に室温まで冷却されました。 60 mlのシクロヘキサンをコロイドに加え、溶液をさらに1時間磁気的に攪拌しました。続いて、1.5 mlのNaOH（4 M）を、さらに30分間激しく攪拌しながら混合物に注入しました。混合物は階層的であるままにされた。上層に含まれるAuナノシードをエタノールを加えて沈殿させた。沈殿物をもう一度エタノールと水で交互に精製し、水に分散させた。

直径約50nmのAuナノスターは、AgNO ₃ を迅速かつ同時に混合することにより、以前の研究に従って合成されました。 （1 ml、3 mM）およびアスコルビン酸（500 µl、0.1 M）と0.25 mM HAuCl ₄ を含む100mlの溶液 、1 mM HCl、および1.5mlの金ナノスフェアシード。次に、チオール化ポリエチレングリコール（PEG、6 kDa）ポリマーを大過剰に添加して、ナノ粒子表面を不動態化しました。混合溶液を24時間連続して攪拌した後、得られたAuNS @ PEGナノ粒子を、3サイクルの遠心分離/水中での再分散によって収集しました。形成されたAuNS @ PEGナノ粒子は、さらに使用するために水に再分散されました。

細胞培養とAuNS @ PEGナノ粒子曝露

グリア細胞はラット脊髄組織から収集されました。細胞は、10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（DMEM）で、37°C​​、5％CO <の加湿インキュベーターで培養しました。 sub> 2 。細胞を培養プレートに播種した後、特定の濃度（50、100、200、500、および1000 ppm）でAuNS @PEGナノ粒子に2時間曝露しました。 AuNS @PEGナノ粒子を含まないDMEMをコントロールグループとして使用しました。

動物と治療

この作業は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施されました。プロトコルは、中国の錦州医科大学（許可番号：LMU-2013-368）の動物実験倫理委員会によって承認されました。オスのSpragueDawleyラット（180〜200 g）は、遼寧医科大学の動物センターから購入しました（ライセンス番号：SCXK 2009-0004）。すべてのラットは、特定病原体除去実験室の温度管理された部屋（25.0±0.2°C）で、12時間/ 12時間の明/暗光周期、湿度50％で飼育されました。ラットは食物と水への自由なアクセスを許可されました。

人道的なエンドポイントは、エンドポイントとしての死を待つのではなく、安楽死を介して実験動物の痛みや苦痛を最小限に抑えるか、終わらせるために選択されます。この作業では、ラットを2つのグループに分けました。（1）コントロール：抱水クロラール溶液（10 wt％）の腹腔内注射によってラットに麻酔をかけた後、800μLのリン酸緩衝生理食塩水を尾静脈から注射しました。 （2）試験：抱水クロラール溶液（10 wt％）を腹腔内注射してラットに麻酔をかけた後、800μLのAuNS @ PEGナノ粒子溶液（200μg/ ml）を尾静脈から注射しました。 H＆E研究では、事前に麻酔をかけずに頸椎脱臼によりラットを犠牲にし、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、腸を直ちに解剖し、-80°Cで保存し、ドライアイス上でイソペンタン中でさらに凍結しました。処理済み。

細胞生存率アッセイ

対数期の神経膠細胞を96ウェルプレートに1×10 ⁴ で播種しました 100μlの細胞懸濁液でウェルあたりの細胞数。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を周囲のウェルに加えた。プレートを37°C、5％CO ₂ でインキュベートしました。 細胞を接着させるために24時間。次に、細胞を4つのグループに割り当てました。コントロールグループの細胞は、10％ウシ胎児血清を含むDMEMで培養しました。 AuNS @ PEGナノ粒子グループでは、0、25、50、100、200、500、または1000ppmのAuNS @ PEGナノ粒子が培地に添加されました。細胞は、24時間後に逆位相差顕微鏡（ライカ、ハイデルベルク、ドイツ）で観察されました。続いて、20μlのMTT（Sigma、St。Louis、MO、USA）を各ウェルに4時間添加しました。培地を除去し、細胞を150μlのジメチルスルホキシドとともに37℃で10分間インキュベートしました。光学密度（OD）値は、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して490nmで測定されました。

フローサイトメトリー

細胞を6ウェルプレートで24時間インキュベートした後、上記のようにグループ化して処理しました。トリプシンを使用して単細胞懸濁液を作成し、300 g で遠心分離しました。 3分間。上清を除去した後、細胞を予冷したPBSで2回洗浄し、1 mlのアネキシンV（Tianjin Sungene Biotech Co、Ltd.、Tianjin、China）で10分間遠心分離しました。セルを10 ⁵ に調整しました / ml。細胞懸濁液を遠心分離し、PBSで3回洗浄した。サンプル（100μl）を5μlのアネキシンV-APC（Tianjin Sungene Biotech Co.、Ltd。）および7-AAD（Tianjin Sungene Biotech Co.、Ltd。）とともにEppendorfチューブに添加して混合しました。 PBSで容量を500μlにし、チューブを室温で15分間暗所でインキュベートしました。アポトーシスは、フローサイトメトリー（BD FACSCanto II、BD Becton Dickinson、米国カリフォルニア州サンノゼ）によって定量化されました。細胞アポトーシス率は次のように計算されました：アポトーシス細胞の数/細胞の総数×100％。

CTイメージング

CTイメージングは​​、General Electric Company（GE）が製造した128列64スライススパイラルCTを使用して取得しました。イメージングパラメータは次のとおりです。スライスの厚さは0.625です。培地はヌードマウスです。チューブエネルギーkvpは120μAおよび100mAです。 CTDIVOLは6.53mGyです。半径は4.8cmです。すべての動物は、胸の下部から骨盤まで頭蓋から尾の方向にスキャンされました。 CTデータは画像と後処理によって分析されました。

組織学的分析

臓器を取り出して4％パラホルムアルデヒドで固定し、次に30％パラホルムアルデヒドスクロース溶液で2日ごとに1回切片化し、標準的な手法を使用した組織学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色しました。切片を逆位相差顕微鏡で調べた。

腎機能の評価

生化学分析装置（遼寧医科大学）を使用して、BUN、クレア、β ₂ を評価しました。 -MG、およびCO ₂ 血の中で。腎機能は、BUN、クレア、β ₂ の血清レベルの変化によって評価されました。 -MG、およびCO ₂ ラットへのAuNS @ PEGナノ粒子の注射の前後。

統計分析

データは平均±SDとして表され、GraphPad Prism 5.0ソフトウェア（GraphPad Software、Inc.、La Jolla、CA、USA）とSPSSを使用して分析されました。一元配置分散分析と最小有意差検定を使用して、グループを比較しました。 P <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

AuNS @PEGナノ粒子の合成と特性評価

ナノマテリアルは人体に入り、検出の役割を果たします。ナノ粒子の物理的および化学的特性は、循環系に入る前に最初に考慮されます[24、25]。ご存知のように、生体内CTイメージングと腎クリアランス特性のための高性能ナノプローブの開発には2つの重要な要素があります。 1つはさらなる表面機能化です。もう1つはサイズコントロールです。

大規模な透過型電子顕微鏡（TEM）画像（図1a）を使用して、AuNS @ PEGナノ粒子の構造を確認しました。これは、星型構造のAuNS @ PEGナノ粒子が調製されたことを示しており、これらのナノ粒子の理想的なサイズは均一性の高い50nm。次に、AuNS @ PEGナノ粒子のエネルギー分散型X線（EDX）スペクトルに見られるAuの元素も、Auナノスターの調製を証明します（図1c）。さらに、AuNS @ PEGナノ粒子の表面の組成は、XPSスペクトルによってさらに特徴づけられ、AuナノスターとPEGに由来するAu4f、C1s、およびO1sが図1bに明確に示され、AuNSの形成も確認されました。 @PEGナノ粒子。

AuNS @ PEGナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真（ a ）、XPS（ b ）、およびEDX（ c ）AuNS @PEGナノ粒子の

上記の特性は、AuNS @PEGナノ粒子の合成が成功したことを示しています。

CT AuNS @PEGナノ粒子の価値

Auナノ粒子は、従来のヨウ素ベースの小分子CT造影剤よりも優れたX線減衰特性があるため、CT造影剤として広く使用されています。ヨウ素（ Z =53）は歴史的にCTイメージング分野で最初に選択された原子でした。 X線コンピューター断層撮影イメージングのためのAuNS @ PEGナノ粒子の実現可能性を評価するために、CT値（ハウンズフィールド単位、HU）を測定しました。図2aは、AuNS @ PEGナノ粒子が、同じ濃度のヨウ素およびDI水と比較して高いCT値を持っていることを示しています。 AuNS @ PEGナノ粒子の濃度が増加すると、CT画像の強度も連続的に増加し、画像が明るくなります。濃度の関数としてAuNS @ PEGのCT値（HU）をプロットすると（図2b）、さまざまな濃度のAuNS @PEGナノ粒子のCT値の線形減衰を確認できます。これらの結果は、AuNS @PEGナノ粒子がポジティブCTイメージングナノプローブの理想的な候補であることを示しています。

Au濃度の関数としてのAuNS @ PEGナノ粒子のX線減衰強度（ a ）およびさまざまな濃度（ヨードヒドリン、1000、500、250、125、62.5、31.75、15.625、および7.8125 ppm）でのAuNS @ PEGナノ粒子のCT画像（ b ）

細胞毒性アッセイ

造影剤としてinvivoでCTイメージングに使用する前に、invitroでAuNS @PEGナノ粒子の生体適合性を調査することが重要でした。 MTTアッセイは、神経膠細胞に対する細胞毒性を評価するために実施されました。さまざまな濃度（それぞれ25、50、100、200、500、および1000 ppm）のAuNS @ PEGナノ粒子と24時間インキュベートした後、神経膠細胞のMTT生存率アッセイを実施しました。調査した濃度範囲でAuNS @ PEGナノ粒子で処理した後の細胞の生存率は、コントロールと非常に類似していることがわかりました。これは、形成されたAuNS @PEGナノ粒子が200ppmまでの濃度で良好な細胞適合性を持っていることを明確に示しています。 。ナノ粒子の比較的高用量（1000 ppm）でも、細胞生存率は90％を超えたままでした（図3a）。

さまざまな濃度のAuNS @ PEGナノ粒子と24時間インキュベートした神経膠細胞の細胞生存率（ a ）; AuNS @ PEGナノ粒子によって誘導される細胞のアポトーシスは、フローサイトメトリーによって示されます：コントロール（ bi ）、25 ppm（ ii ）、50 ppm（ iii ）、100 ppm（ iv ）、200 ppm（ v ）、500 ppm（ vi ）、および1000 ppm（ vii ）

AuNS @ PEGナノ粒子の細胞適合性は、さまざまな濃度のAuNS @PEGナノ粒子で2時間処理した細胞のフローサイトメトリー分析によってさらに確認されました。フローサイトメトリー分析では、PBSおよびAuNS @ PEGナノ粒子で処理した後、細胞をアネキシンV-APCおよび7-AADで染色しました。染色せずにPBSで処理した神経膠細胞をコントロールとして使用しました（図3bi）。それぞれ25、50、100、200、500、および1000ppmの濃度のAuNS @ PEGナノ粒子で処理された細胞が見られました（図3bi–vii）。 MTTアッセイの結果と合わせて、AuNS @ PEGナノ粒子は細胞適合性が良好であり、AuNS @ PEGナノ粒子で処理した後、MTTデータと一致する明らかな細胞形態変化はなかったことを示しました。

In VivoCTイメージングと生体内分布

invitro実験での高いCT造影性能に後押しされて、invivoでのCT造影剤としてのAuNS @PEGナノ粒子の実現可能性をさらに確認しました。 AuNS @ PEGナノ粒子（200 ppm）をラットの尾静脈に静脈内注射しました。このような用量のAuNS @ PEGナノ粒子は、MTTおよびフローサイトメトリーの毒性とアポトーシスの割合が低く、CTの感度が高いという結果から選択されました。重要な臓器領域のCTイ​​メージングは​​、尾静脈注射前と尾静脈注射後のさまざまな時点で記録されました（図4）。私たちの研究は、CTイメージングと腎クリアランスの能力をテストすることを目的としています。そのため、CTイメージングでは腎臓と膀胱の臓器の変化を強調します。図4aは、注射前のラット腎臓のCT画像です。注射前と比較して、腎臓の画像は0.5時間から2時間に大幅に強化されています（図4b–d）。ラットにおけるAuNS @ PEGナノ粒子の時間依存分布も、静脈内注射後のCT信号値によって追跡されました。腎臓と膀胱のイメージングは​​0.5時間から2時間に大幅に強化され、それらのHU値は95から464および105から664に上昇しました。注射後6時間後、ラットの腎臓のCTコントラスト強度は時間の経過とともに明らかに減少します（図4e）。注射後24時間後、膀胱臓器のCTイメージングは​​完全に鮮明になり、AuNS @ PEGナノ粒子の優れた腎クリアランス特性を示しています（図4f）。それらの最適な粒子サイズと表面機能化のために、循環中の血液からのAuNS @PEGナノ粒子の除去は非常に遅くなる可能性があります。したがって、これらの結果は、調製されたままのAuNS @ PEGナノ粒子が、invivoでリアルタイムCTイメージングを提供するためのユニークで有望なナノプローブである可能性があることを示しています。造影剤は病院の患者に投与できるため、これは将来の臨床応用に有益です。

注射前のラットのCT画像（ a ）およびさまざまな時点（0.5、1、2、6、および24時間）（ b – f ）AuNS @ PEGナノ粒子（200 ppm）の静脈内注射後

H＆E染色

AuNS @ PEGナノ粒子の注射後24時間後にマウスの臓器の組織学的変化が行われ、その結果が図5に示されました。主要な臓器の組織学的変化は、明らかに観察されなかったことがわかります。そして最も重要なのは、これらの臓器にAuNS @PEGナノ粒子が残っていないことです。上記の結果に基づいて、AuNS @ PEGナノ粒子は、良好な生体適合性を示し、明らかなin vivo毒性はなく、生物医学アプリケーション用の新しいCTイメージング造影剤として期待されています。

H＆Eで染色された組織切片： a ハート、 b 肝臓、 c 脾臓、 d 肺、 e 腎臓、および f 腸。スケールバーは100mmを表します

AuNS @PEGナノ粒子の腎機能研究

AuNS @ PEGナノ粒子の生体内毒性をさらに評価するために、BUN、Crea、β ₂ のパラメーター -MG、およびCO ₂ 腎機能の研究のために測定されました。血清を分析しました。これらの値は、ラットの腎機能が良好かどうかを評価することができます。 BUNの値は、ラットの泌尿器機能を評価することができます。クレアの値の変化は、ラットの体のさまざまな病気を表しています。 β ₂ -MG濃度は、主に尿細管機能に関連しています。そして、CO ₂ の値 尿細管の酸性化機能を評価することができます。ラットには、200ppmの濃度でAuNS @ PEGナノ粒子を投与しました。これらの結果のレベルは、注射の24時間後に調べられ、ラットにAuNS @ PEGナノ粒子を注射する前後で違いはありませんでした（表1）。

結論

要約すると、CTイメージングでのアプリケーション向けに簡単なAuNS @PEGナノ粒子を開発しました。形成されたAuNS @ PEGナノ粒子は、超小型サイズ、低毒性、良好な水分散性、血液適合性、および所定の濃度範囲での細胞適合性を備えています。 CT値は、AuNS @PEGナノ粒子が良好な明るいイメージングを持っていることを示しています。インビトロイメージングの結果は、AuNS @ PEGナノ粒子が、CTイメージングアプリケーションの新しい造影剤として強力なX線減衰特性を持っていることを示しています。これは、インビボでのラット腎臓のCTイメージングによっても実証されました。さらに、生物学的研究の分布とin vivo毒性の調査は、AuNS @ PEGナノ粒子が代謝され、高い生物学的適合性を持つことができることを示しています。したがって、AuNS @PEGナノ粒子は医療用途の有望な候補となる可能性があります。