蛍光半導体ナノ粒子でコード化された高分子電解質マイクロカプセルに基づくバイオイメージングツール：蛍光特性の設計と特性評価

はじめに

薬物、タンパク質、および核酸分子の標的化送達のための担体として使用される蛍光ポリマーのマイクロおよびナノ粒子の開発は、バイオイメージングおよびセラノスティック剤の設計の分野で特に興味深い[1,2,3]。量子ドット（QD）は、物理的なサイズに応じて蛍光ピーク波長を持つ2〜10nmの半導体コロイド結晶です。広い吸収スペクトルと、ナノ粒子のサイズに応じた位置を持つ狭く対称的な蛍光スペクトルにより、単一の放射線源を使用して、多重検出に使用できるさまざまな蛍光バンドを持つ一連のQDで蛍光を励起できます。したがって、QDは非常に魅力的で有望な診断およびイメージング用の高度なフルオロフォアです[4]。

高分子電解質マイクロカプセルをさまざまな機能コンポーネントのキャリアとして使用すると、さまざまな物理的（超音波、磁場、レーザー、または光放射）または化学的（pH、微小環境のイオン強度、および溶媒の極性）に応答するシステムの開発が可能になります。刺激[5、6]。高分子電解質マイクロカプセルは、球形マトリックス上に反対に帯電した高分子高分子電解質を層ごとに堆積させることによって得られます。その後のマトリックスの溶解により、中空構造が生成され、その安定した高分子膜は高分子電解質の高分子複合体で構成されます[7、8、9]。高分子電解質の層ごとの吸着技術により、磁性、金属（金または銀）、または蛍光（QDなど）ナノ粒子を含むさまざまな機能成分を高分子膜に組み込み、膜の厚さを制御することができます形成される[10、11]。

蛍光標識されたマイクロカプセルは、invitroおよびinvivoでの輸送と送達を監視するために使用できる有望なバイオイメージング剤です[12、13]。マイクロカプセルの蛍光標識（光学的符号化）の利用可能な方法では、ポリマーは蛍光標識と結合または物理的に混合されます[14、15]。マイクロカプセルの光学的性質を決定する蛍光成分は、マトリックス微粒子、例えば炭酸カルシウムマイクロスフェロライトの調製中に蛍光色素で標識されたポリマーの共沈を介してそれらの内部に組み込むこともできる[16]。マトリックスが削除された後にカプセル化することもできます。この目的のために、高分子膜を介した低分子量および高分子量の化合物の拡散は、微小環境のイオン強度またはpHを増加させることによって保証されます。ただし、蛍光ナノ結晶を使用した高分子電解質マイクロカプセルの光学的符号化は、その独自の光学特性とバイオイメージングにおける有効性により、より有望です[17]。

高分子電解質マイクロカプセルの高分子膜にＱＤを組み込むことによってコード化する既知の方法は、低分子量リガンド、例えば、チオグリコール酸またはシステインで水溶化されたＱＤを使用する［１８、１９］。この研究の目的は、水溶性CdSe / ZnS（コア/シェル）QDで光学的にコード化された非常に安定した蛍光高分子電解質マイクロカプセルを開発することでした。得られた蛍光マイクロカプセルの蛍光および構造特性を推定します。

メソッド

調査の目的、設計、設定

QDでエンコードされた高分子電解質マイクロカプセルの製造

トリオクチルホスフィンオキシド（TOPO）でコーティングされた590nmで最大蛍光を発するCdSe / ZnS（コア/シェル）QDは、NRNU MEPhI（モスクワ、ロシア）のナノバイオエンジニアリング研究所のP.Samokhvalov博士によって合成されました。 QDの精製と可溶化は、前述のように実行されました[20、21]。 QDをクロロホルムに溶解し、続いてメタノールで沈殿させることにより、TOPOをQD表面から除去しました。手順を3回繰り返した。その後、QDを再びクロロホルムに溶解し、QDとシステインの質量比が1：0.13になるようにメタノール中のシステイン溶液で沈殿させました。 ＱＤ沈殿物をメタノールで過剰のシステインを洗浄し、真空濃縮器で乾燥させた。乾燥したQDを、0.1M水酸化ナトリウムを添加して水に再懸濁しました。その後、分散液を超音波浴を使用して超音波処理し、ろ過しました（孔径、0.22μm）。得られた分散液に、末端カルボキシル基を含むPEGのチオール誘導体を1：4.6の質量比で添加した。混合物を4°Cで一晩インキュベートし、PEG化QDをゲルろ過クロマトグラフィーを使用して精製しました。 得られたサンプルのQD含有量は、最初の励起子の波長で分光光度的に決定されました。可溶化された量子ドットは、動的光散乱とZetasizer Nano ZS（Malvern、UK）によるレーザードップラー微小電気泳動を使用した流体力学的直径とζ電位によって特徴づけられました。

QDエンコーディングは、前述のように得られた炭酸カルシウム微粒子の表面に、反対に帯電したポリカチオンおよびポリアニオンポリマー、ならびにPEGのカルボキシル化チオール誘導体で官能化された水溶性QDの層ごとの堆積の修正された技術を使用して実行されました。 [22]。高分子高分子電解質層は、ポリカチオンポリ（アリルアミン塩酸塩）（PAH）とポリアニオンポリ（4-スチレンスルホン酸ナトリウム）（PSS）またはポリアクリル酸（PAA）から形成されました。フルオロフォアは水溶性のPEG化CdSe / ZnS QDであり、波長590 nm、ゼータ電位-26.7±0.8 mV、流体力学的直径18.7〜23.3nmに蛍光ピークがあります。 QDでエンコードされたマイクロカプセルの間に、各層の堆積後の製造プロセスは、レーザードップラー微小電気泳動を使用して微粒子の表面電荷（ζ電位）を制御しました。

炭酸カルシウム微粒子を超純水に再懸濁し、0.5 MNaCl中の2mg / mLPAH溶液0.5mLを添加しました。懸濁液を超音波浴で超音波処理し、室温で攪拌しながら20分間インキュベートしました。その後、遠心分離、続いてMilliQ水に再懸濁することにより、過剰なポリマーを洗い流した。高分子ポリアニオンからなる次の層を適用するために、マイクロビーズを0.5 mLの超純水に再懸濁し、懸濁液を0.5 MNaCl中の2mg / mLPSS溶液0.5mLと混合し、超音波浴で超音波処理しました。 60秒間、室温で攪拌しながら20分間インキュベートし、上記のように過剰なポリマーを洗い流します。高分子電解質塗布の各段階後の微粒子の洗浄を3回繰り返した。符号化の前に、5つの高分子電解質層が炭酸カルシウム微粒子に適用され、5番目の層はポリカチオンで構成されていました。その後、可溶化したQDを添加し、80分間恒久的に攪拌しながら混合物をインキュベートしました。次に、反対に帯電したポリマーの6つの連続した層が適用され、6番目の層はポリアニオンPSSまたはPAAで構成されています。 QDでエンコードされた中空高分子電解質マイクロカプセルは、得られた殻付きマイクロビーズの炭酸カルシウムコアを0.2 Mエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）（pH 6.5）で洗浄して溶解することで得られました。その後、マイクロカプセルの表面をウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma-Aldrich、USA）でさらに修飾し、微粒子を1％のBSAを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.4）に分散させ、その後4°Cでインキュベートしました。暗闇の中で12時間。使用直前に、中空マイクロカプセルの懸濁液を50 mMリン酸緩衝液（pH 7.4）で5回過剰なBSAで洗浄しました。得られた高分子電解質マイクロカプセルは、暗所で4℃で保存しました。

QDでエンコードされた高分子電解質マイクロカプセルの光学および蛍光顕微鏡

微粒子の形態およびサイズ分布は、光学および蛍光顕微鏡を使用して分析された。微粒子のサイズ分布を推定するために、5 µLの微粒子懸濁液を10 µLの50％グリセロールでスライドに固定しました。サンプルは、ライトフィールドにLD A-Plan 40x / 0.55M27レンズを備えたAxioObserver 3顕微鏡（Carl Zeiss、ドイツ）を使用して検査しました。蛍光画像は、HBO 100水銀イルミネーター（Burner Mercury）とXF115-2 FITCロングパスフィルターセット（505DRLPダイクロイックフィルター、475AF40励起フィルター、510ALP発光フィルター（Omega Optical、USA）、EC Planを含む）を使用して取得しました。 -Neofluar 100x / 1.30オイルアイリスM27レンズ（WD =0.20 mm）、開口数は0.7から1.3まで調整可能、Immersol 518Fイマージョンオイル（Carl Zeiss、ドイツ）。

得られたマイクロカプセルの形態学的特徴を、エポキシ包埋媒体に固定されたBSAフリー表面を有する光学的にコード化された高分子電解質マイクロカプセルの切片で研究した。この目的のために、マイクロカプセル懸濁液を30、50、70、および95％エタノール水溶液で順次脱水し、次に無水エタノール（Acros Organics、USA）で3回処理して、完全に脱水させました。脱水の各段階は15分間続きました。マイクロカプセルの脱水サンプルを1：1エポキシ-エタノール混合物に12時間移し、次に3：1エポキシ-エタノール混合物に3時間移しました。次に、サンプルをきれいな埋め込みエポキシ媒体に移し、エポキシブロックを45°Cで12時間、60°Cで72時間重合させました。次に、幅2.0mmのUltraAFM35ダイヤモンドナイフ（Diatome、スイス）を備えたLeica EM UC6ウルトラミクロトーム（Leica Microsystems、オーストリア）を使用して、蛍光QDでエンコードされた高分子電解質マイクロカプセルを含むこれらのブロックから150nmの切片を切り出しました。切片をスライドに移し、励起用のHBO 100水銀イルミネーター（Burner Mercury）と45 HQ TexasRed蛍光フィルターセット（ d =25シフトフリー（E）、560/40励起BP、FT 585ビームスプリッター、および630/75発光BP）（Carl Zeiss、ドイツ）。蛍光画像は、Carl Zeiss EC Plan-Neofluar100x /1.30オイルPh3レンズとImmersol518F浸漬オイル（Carl Zeiss、ドイツ）を使用して取得しました。画像は、Zen（Carl Zeiss、ドイツ）およびImage J 1.48 v（米国）ソフトウェアを使用して分析および処理されました。