自己分解性ナノ粒子に基づく正確なリソソームpH指示薬の確立と応用研究

はじめに

リソソームは高分子の最終的な目的地として機能し、これらの高分子は低pHで活性化される加水分解酵素によって分解されます[1]。細胞質からリソソーム内腔にプロトンを送り込む液胞型H + −ATPase（v-ATPase）[2]によって維持されるリソソームの酸性pHは、〜60種類の加水分解酵素の活性を維持することでした[3]。さらに、最近の文献報告では、リソソームの酸性pHはオートファジーと密接に関連していることが明らかになっています[4]。そのため、正確なリソソームpHの変化をよく知っていると、オートファジーのプロセスと状態に関する詳細情報が得られます。私たちの研究と文献レビューに基づくと、アミン陽性の荷電ナノ粒子エンドサイトーシスは、おそらく、第一級および第二級アミンPEGで装飾されたナノ粒子や粒子表面の親水性装飾などのエンド/リソソームのpH変化を増加させるでしょう[5、6]。

アミンナノ粒子のエンドサイトーシスによって誘発されるpHの上昇は、転写因子EB（TFEB）の核局在化を劇的に増加させ[7]、経路の転写アップレギュレーションを引き起こすだけでなく、リソソーム機能障害を引き起こし、最終的にオートファジーフラックスの遮断をもたらします[7]。 7,8,9]。 TFEBはオートファジーを調節し、その結果、その過剰発現は培養細胞でのオートファゴソーム産生の有意な増加につながります。

したがって、オートファジーのプロセスとオートファジーの詳細を予測するには、リソソームの正確なpHとその変化の測定が非常に重要です。これまで、文献レビューを示すエンド/リソソームのpH値[10]と、エンド/リソソームのpH値を検出するための市販製品から、比較的広い範囲のpH変化のみを示すことができ、正確なリソソームのpH検出は到達していません。 。したがって、オートファジーの洞察の詳細を知るためには、正確な管腔内pH変化検出法の確立が重要なアプローチです。

自己分解可能なSiO ₂ に関するこれまでの経験に基づく ナノ粒子は、この研究では、管腔のpH変化の検出を実現できる正確なpH指示薬を確立しました。 SiO ₂ ナノ粒子は、調整可能なサイズと生体適合性において優れた利点があります[11]。特定の合成パラメータを設定することにより、確立された自己分解性SiO ₂ pH指示薬は、リソソームのpH範囲であるpH 4.0〜4.8のペイロードメチレンブルー（MB）を高感度で放出する可能性があります。さらに、MBの放出は、pH値の変化と線形の相関関係を示しました（スキーム1）。次に、6つの異なる細胞株を導入することにより、細胞レベルでのpHインジケーターの実現可能性をテストし、ブラックメソポーラスシリコン（BPSi）NPエンドサイトーシス前後のリソソームの平均pH変化を決定し、BPSi後のオートファジー終了のメカニズムを明らかにしました。エンドサイトーシス。したがって、自己分解可能なナノ粒子ベースの管腔pH指示薬は、リソソームのpHをよりよく知るための新しい方法論と戦略を提供し、オートファジープロセスまたは代謝に関するその他の重要なシグナル伝達に関する詳細を示す可能性があります。

MB @ SiO ₂ の概略図 生細胞のリソソームpHの測定

材料と方法

マテリアルセクション

ケイ酸ナトリウム（NaSi）およびSiウェーハ（直径20 cm、p +（100）、0.01–0.02Ωcm）は、それぞれSiGNa ChemistryInc。およびOcmeticInc。から提供されました。臭化アンモニウム（NH ₄ Br、99％）、臭化ナトリウム（NaBr、99％）、トルエン（無水、99.8％）、塩酸（HCl、37％）、MB、およびテトラエチルオルトシリケート（TEOS）はSigma-Aldrichから購入しました。 0.5kDaのメトキシ-PEG-シランと2kDaのメトキシ-PEG-シランは、FluorochemLtd。とLaysanBioInc。から別々に購入しました。 RPMI 1640培地は、LifeTechnologiesから提供されました。ウシ胎児血清（FBS）は、TianHang生物学的技術から購入しました。重曹、硫酸ストレプトマイシン、ペニシリンG、HEPES、リゾチームソリューション、CellLight Early-endosomes-GFP、LysoTracker™Red DND-99、Pierce®BCAタンパク質アッセイキット、強化された化学発光、pHrodo™Redトランスフェリンコンジュゲート、生細胞イメージングソリューション、およびTrizol試薬はThermoFisherScientificから購入しました。エタノールとアンモニア-水はSinopharmから提供されました。 BioRT Master HiSensi cDNA First-StrandSynthesisキットはHangzhouBioer Technology Co.、Ltdから購入しました。RIPAライセートはHea​​rt Biological Technology Co.、Ltdから購入しました。P62、TFEB、およびβ-アクチン抗体はProteintechGroupから購入しました。 、Inc。LC3B抗体はAbcamから提供されました。 2-（4-ピリジル）-5-（（4-（2-ジメチルアミノエチル-ラミノカルバモイル）メトキシ）フェニル）オキサゾール（PDMPO）は、Yeasen Biotech Co.、Ltd。から提供されました。

調査の目的、設計、設定

この研究の目的は、（1）HepG2細胞のオートファジーに対するBPSiナノ粒子の影響を調査し、（2）オートファジーに影響を与えるリソソームpH値の変化のメカニズムを解明し、（3）測定できる正確なリソソームpHインジケーターを確立することです。リソソームのpHは正確に、そして最後に（4）オートファジーに対するpH変動の影響を示しています。上記の研究目的を実現するために、トランスクリプトームシーケンシング実験を使用して、BPSiナノ粒子を供給した後のHepG2細胞のトランスクリプトーム遺伝子の変化を調べ、RT-qPCRとウエスタン実験で検証しました。 PDMPOなどの蛍光色素を使用して、BPSiを供給した後のHepG2細胞のリソソームpHの変化を測定しました。リソソームのpHを正確に測定するために、MB @ SiO ₂ を開発しました。 10個のパラメーターを持つナノ粒子を使用し、DLSやHR-TEMなどの実験を通じてこれらの10種類のナノ粒子の特性をテストしました。 10シリーズの自己分解性ナノ粒子システムのMBローディング効率と放出動態の研究は、さまざまなpH溶液とHepG2セルでテストされました。細胞に入った後のナノ粒子の細胞内位置を確認するために、細胞TEM実験と生細胞共焦点顕微鏡法を行いました。最後に、BPSiを供給した後の6種類の細胞のリソソームpH変化を測定し、MB @ SiO ₂ の普遍性を検証しました。 リソソームのpH変化を測定するためのナノ粒子。

BPSiナノ粒子合成

BPSiナノ粒子は、以前の方法[12]で調製され、共同研究者（Wujun Xu、東フィンランド大学応用物理学部）から提供されました。 BPSi、NaSi、アンモニウム塩、およびNaBr（NaSi：NH ₄ Br：1：4：4のNaBr、w / w / w）をAr雰囲気のグローブボックスで粉砕しました。それらは、N ₂ の下でチューブオーブン内で反応させられた。 240°Cで5時間の雰囲気（式1）。得られた微粒子を周囲温度まで冷却した後、0.5 MHClおよび1.0MHF溶液で別々にすすぐことにより精製した。微粒子をエタノール中で1000rpmで15分間ボールミル粉砕し、遠心分離速度を調整することにより、目的の直径のBPSiナノ粒子を収集しました。

動的光散乱実験を通して、ナノ粒子の直径分布と表面電荷が研究されました。すべてのNPは、細胞に導入する直前に、わずかな超音波処理（5秒で溶液に均一に分散させるための超音波洗浄機SB-5200DT、Ningbo Scientz Biotechnology Co.、Ltd。）による滅菌後、培地に分散させました。

10シリーズ自己分解性ナノ粒子システムの確立

10シリーズの自己分解性ナノ粒子は、以前に報告した方法論[13,14,15,16]によって、パラメーターを変更して合成されました。通常の手順では、最初にエタノール（75 mL）とアンモニア水溶液（25％、3.4 mL）の混合物に一定量のMBを添加し、その後一定量のTEOSを添加しました。シリーズ自己分解型MB @ SiO ₂ NPは、24時間攪拌した後に得られ、乾燥する前に3回洗浄しました。プロトコルに追加されたMBとTEOSの量は、表1に記載されているとおりです。NPでの1.0 / 100の意味 _{1.0 / 100} ナノ粒子を合成したときのMBとTEOSの在庫を表し、1.0mgのMBと100μLのTEOSを使用しました。そして、NPにおける1.5 / 100の意味 _{1.5 / 100} その他は1.0 / 100と一致しています。

細胞培養

自己分解性ナノ粒子に基づくpH指示薬の効率と普遍性をテストするために、特定の腫瘍由来の癌細胞株でテストを試みました。そこで、肝がん、肺がん、結腸がん、メラノサイトーマ細胞株を研究対象として選択しました。ヒト結腸癌細胞HCT116、HCT8、およびHCT15の細胞株。ヒト肝がん細胞HepG-2;ヒト肺がん細胞A549;マウスメラノーマ細胞B16は、10％熱不活化FBS、2.0 g / L重曹、0.1 g / Lストレプトマイシン硫酸塩、0.06 g / LペニシリンG、および5.958 g / Lを添加したRPMI1640培地（Life Technologies）で維持されました。 HEPES。細胞は、標準的な細胞培養インキュベーター内で、37°C​​、5％CO ₂ の加湿雰囲気で維持されました。 。

10シリーズの自己分解性ナノ粒子システムの特性評価

すべてのシリーズナノ粒子の形態は、STEMモードのHR-TEMによって特徴づけられ、SiマッピングはEDS元素マッピングによって研究されました。ナノ粒子サイズ分布分析は、ランダムに選択されたSTEM画像のナノ粒子直径を計算することによりImageJソフトウェアによって実行されました。ナノ粒子のゼータ電位と多分散度指数（PDI）は、動的光散乱（DLS）研究によって、特定のpH値の直列バッファーで測定されています。データはSPSS15.0によって分析され、統計結果は平均値±標準偏差として表されました。

10シリーズ自己分解性ナノ粒子システムのMBローディング効率と放出速度論研究

MBの負荷効率と放出動態を研究するために、直列濃度でのMBの標準曲線を最初に確立しました。 MBの吸収は、λである660nmでの吸光度を持つUV-Visスペクトルによって実行されました。 モノマーMBの最大値。 MBの読み込み効率は、次の式で計算されました。MBの読み込み効率（％）=カプセル化されたMBの量/（MB入力の合計量）。

10シリーズのナノ粒子からのMB放出は、異なるpH値（pH 4.0、pH 6.86、およびpH 9.18）およびリゾチーム溶液（ThermoScientific™ ^＃ ）の純水およびpHバッファーで研究されました。 90082）。さらに、異なるpH緩衝液での特定の期間後のMB放出動態も調査されました。次に、660nmでのOD値と時間の関数としてのMB放出パーセンテージを調べました。

より詳細には、MBリリース研究は以下のプロトコルによって実行されました。 10シリーズのナノ粒子をそれぞれpH4.0、6.86、9.18の15mL標準緩衝液にリソソーム溶液で溶解しました。そして、37°C​​のHulaミキサーでMBリリースを実行しました。次の15日間で、各サンプル1 mLを収集し、12000rpmで10分間遠心分離しました。上澄みと沈殿物の吸収スペクトルを200〜800nmで測定しました。

さらに、4.1〜5.5のpH範囲のリゾチーム溶液を含む正確なpHバッファーでのMB放出も、上記と同じプロトコルで調査しました。特定の期間（6 h、12 h、および24 h）が観測時点として配置されました。 660nmでの吸収が各サンプルで記録されました。各pH溶液の吸収と残差平方和の線形関係は、それぞれ各時点でカウントされました。

細胞内のMB放出プロファイルを検出するために、HepG-2細胞を75 cm ² で培養しました。 培養フラスコを培養し、細胞が培養フラスコの70％まで増殖したときに、NP（300μg/ mL）を供給しました。 30分ごとに、細胞を収集しました。細胞を繰り返し凍結および解凍して、細胞内のMBを完全に放出した。細胞溶解物を12000r / minで10分間遠心分離しました。上清を取得し、660 nmでの吸光度を測定して、放出されたMBの総量を計算しました。この研究では、HepG2細胞が研究対象として選択されました。これは、細胞増殖が速く、テストした10グループすべての差異を最小限に抑えることができるためです。

10シリーズナノ粒子の細胞共局在と6つの異なる細胞株での放出性能

セルTEMを使用して、標準的なセルTEMプロトコルに従ってエンド/リソソーム内のナノ粒子の共局在を研究しました。細胞を1×10 ⁶ の強度で播種しました 細胞/フラスコと24時間インキュベートし、細胞接着を可能にします。同じ濃度（100μg/ mL）の培地中の10シリーズのナノ粒子を細胞とそれぞれさらに12時間および24時間インキュベートしました。次に、細胞をPBSで3回洗浄して過剰なナノ粒子を除去し、2.5％グルタルアルデヒド溶液で1日以上固定しました。次に、固定した細胞を洗浄し、四酸化オスミウム、脱イオン水中1％で1時間染色した後、PBSで3回、DI水で2回洗浄しました。次に、古典的なセルTEMプロトコル[17、18]を実行し、TEM観察のために厚さ90nmの切片を収集しました。 pH値の関数としてのMB放出は、両方のNPを持つ6つの細胞株で研究されました _6/100 およびNP _{7.5 / 80} 。また、データ分析のために、MBのリリースからのOD値とMBのリリース率が記録されました。

MB @ SiO ₂ の細胞内取り込みの調査 ナノ粒子

生細胞共焦点顕微鏡を使用して、MB @ SiO ₂ の細胞取り込みと細胞内運命を評価しました。 ナノ粒子。 HepG-2細胞の初期エンドソームを16時間染色しました（CellLight初期エンドソーム-GFP、BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586、励起/発光〜488 / 510 nm）。次に、細胞をNPとインキュベートしました _6/100 （MB励起/発光：640 / 650–700 nm）特定の時間間隔（2 h、2.5 h、3 h、5 h、および6 h）で100μg/ mLのナノ粒子濃度で。画像を撮影する前に、lysotrackerをLysoTracker™Red DND-99（Thermo Fisher Scientific L7528、励起/発光：577/590 nm）で40分間染色しました。その後、染色液を取り除き、細胞をPBSで2〜3回洗浄します。画像はNikonA1R共焦点顕微鏡を使用して撮影されました。

BPSi給餌後の遺伝子発現変化を評価するためのトランスクリプトームシーケンス

対照群とBPSi処理群のトータルRNA抽出は、標準的な操作手順に従ってTrizol試薬を使用して実行されました。シーケンシング実験の最初のトータルRNAサンプルの品質は、NanoDropND-2000分光光度計を使用して検出されました。品質管理に合格したトータルRNAは、その後のシーケンシング実験で使用されました。遺伝子発現の比較は、次世代シーケンシングによって実行されました。すべてのシーケンスプログラムは、BGISEQ-500プラットフォームを使用して、BGI-Shenzhen Corporation（中国、深セン）によって実行されました。シーケンシングによって得られた生データは、シーケンシングデータがその後の分析に適しているかどうかを判断するために品質管理が実行されます。合格した場合は、遺伝子発現レベルに基づいて遺伝子の定量分析を実行し、選択したサンプル間で差次的に発現する遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）機能の有意な濃縮分析を実行します。

TFEB-CLEAR遺伝子ネットワークの活性化を確認するための逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）アッセイ

対照群とBPSi処理群の培養HepG-2細胞からTrizol試薬を用いてトータルRNAを抽出し、BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis Kit（Hangzhou Bioer Technology Co.、Ltd）を用いてcDNAに逆転写しました。 。）ランダムプライマーを使用。参照対照としてアクチンを用いたAppliedBiosystems™7500リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems、Life Technologies、Carlsbad、CA）を用いた定量的PCRにより、cDNAを使用してTFEB-CLEAR遺伝子ネットワークを増幅しました。定量的RT-PCRに使用されるプライマーを表S4に示しました。

BPSi供給後にオートファジーが活性化されていることを確認するためのウエスタンブロットアッセイ

対照群および異なる濃度のBPSi処理群の細胞タンパク質をRIPA溶解物（Heart Biological Technology Co.、Ltd。）によって抽出した。プロテアーゼ阻害剤をRIPAライセートに添加し、氷上で予冷しました。予冷したPBSで細胞を3回洗浄した。液体を完全に捨て、皿を氷に2分間入れました。 400マイクロリットルのRIPAライセートをディッシュ全体の表面に加え、ピペットで数回ピペッティングし、氷上で30分間インキュベートし、その間にディッシュを数回振とうして細胞を完全に溶解しました。溶解した細胞液を1mlのEppendorfチューブに移し、13,000rpmで10分間、4℃で遠心分離しました。得られた上清を水中で10分間煮沸し、後で使用するために–20℃に置きました。タンパク質濃度は、Pierce®BCAタンパク質アッセイキット（Thermoscientific）を使用して定量化されました。

25μgの総タンパク質を含む細胞抽出物を直接SDS-PAGEにかけ、移しました。メンブレンを5％スキムミルクでブロックし、P62を認識する一次抗体でプローブしました（Proteintech ^＃ 18420–1-AP）、TFEB（Proteintech＃13372–1-AP）、LC 3B（Abcam ^＃ ab192890）、およびβ-アクチン（Proteintech ^＃ 20536–1-AP）。二次抗体は、一次抗体の起源の種に従って選択され、増強された化学発光（Pierce）またはBio-Rad ChemiDoc XRS + Gel Imaging System（Bio-Rad、USA）を使用して検出されました。 β-アクチンに対するP62、TFEB、およびLC 3Bの正規化されたバンド強度は、BPSiグループのImageJソフトウェアを使用したデンシトメトリーによって定量化され、データは平均±標準偏差です。 3つの独立した実験から。

PDMPOによる細胞pHの測定と共焦点顕微鏡によるpHrodo™レッドトランスフェリンコンジュゲート

PDMPO調査

1×10 ⁵ HepG-2細胞を滅菌共焦点プレート上で一晩培養し、BPSiナノ粒子に100μg/ mLの濃度で供給しました。翌日、免疫蛍光染色の前に、スライドを0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4で3回洗浄し、1μMPDMPO色素（Ex / Em =329/440）を添加しました。 PBSで3回洗浄した後、細胞を新鮮なRPMI-1640培地でインキュベートし、CCDカメラを備えた蛍光顕微鏡（Nikon A1R、日本）で観察し、5分以内に青と緑の蛍光強度の比率で写真を撮りました。次に、リゾソーム中の濃度を、Chenらの手順に従って計算した。 [19]。

pHrodo™レッドトランスフェリンコンジュゲート研究

HepG-2細胞を同じ方法で共焦点プレートに播種し、細胞を24時間付着させた後、プレートを氷上に10分間保持しました。 20 mMグルコースと1％BSAを含む冷生細胞イメージング溶液で細胞を洗浄しました。 pHrodo™RedTransferrinコンジュゲート（Ex / Em =560/585 nm）を25μg/ mLでLiveCell Imaging Solutionに添加し、37°C​​で20分間インキュベートした後、Live Cell ImagingSolutionで細胞を洗浄しました。観察は共焦点顕微鏡によっても行われた。顕微鏡画像の強度の定量分析は、ImageJソフトウェアによって実行されました。

細胞リソソームpHの検出

細胞A549、HepG-2、HCT8、HCT15、HCT116、およびB16を75 cm ² で培養しました。 培養フラスコを培養し、細胞が培養フラスコの70％まで増殖したときにNPを供給し、6時間後に細胞を回収しました。細胞を繰り返し凍結および解凍して、細胞内のMBを完全に放出した。細胞溶解物を12000r / minで10分間遠心分離しました。上清を取得し、660 nmでの吸光度を測定して、放出されたMBの総量を計算しました。 NPの吸光度 _{6.0 / 100} 標準pHで比較して、各セルのpH値を取得しました。

統計分析

統計分析は、SPSS15.0ソフトウェアを使用して、独立したグループに対して二元配置分散分析（ANOVA）を使用し、多重比較検定にテューキーHSD法を使用して行われました。統計的有意性は、 P の値に基づいていました <0.05。

結果と考察

デュアルPEG機能性黒色多孔質シリカナノ粒子（BPSi NP）を供給した細胞で最初に差次的遺伝子発現を検出しました（共同研究室によって提供されました[12]）。ゼータ電位が-18.5から+2.8 mVに変化したことも、表面のデュアルPEG化が成功したことを示しています（図S1a）。 BPSiナノ粒子の平均直径は156nmでした（図S1b）。差次的遺伝子発現のクラスターヒートマップ（図S2）に基づいて、さらに調査するために2倍以上の差次的遺伝子発現を選択しました。 Go and KEGGは、差次的遺伝子を分析するために導入されました。 Go濃縮バブルマップ（図1a）から、ファゴリソソームアセンブリ、食作用、生体異物代謝プロセスなどの代謝およびリソソーム関連遺伝子をさらに分析するために選択しました。特に、TFEB-CLEAR [17]関連の遺伝子発現は有意に増加しました。 RT-PCRの結果（図1b）は、遺伝子シーケンシングの結果、TFEB上の遺伝子（調整されたリソソーム発現、およびCTSD、CTSF、TFEB、MFN1、LAMP2、TPP1などの調節（CLEAR）経路の大幅な増加）も検証しました。 。これらの遺伝子は、図S3に示すように、リソソーム経路上にマークされています。それらの発現は対照群の発現よりも高く、統計的有意性があります（ P _{BPSiVSコントロール} <0.05）。また、TFEBはリソソーム遺伝子の発現を積極的に調節し、リソソーム集団を制御し、リソソーム基質の細胞分解を促進します。

オートファジーは、BPSiを供給した後、HepG-2細胞で活性化されます。 a トランスクリプトームシーケンシングによって検出された、発現差のある遺伝子のGO濃縮バブルマップ。 b RT-qPCT実験によるBPSi処理後のTFEB-CLEAR遺伝子ネットワークにおける遺伝子変化の検証。 c BPSi処理後のP62、TFEB、LC3B II / Iタンパク質の発現。 d 対照群によるBPSi治療群のP62、TFEB、LC3B II / Iタンパク質の正規化されたバンドグレー強度。データは平均±標準偏差として表されました。

さらに、TFEBはオートファジーを調節し、その過剰発現は、TFEB遺伝子の主な機能がリソソームの生合成を誘導し、オートファジーの発生を促進することであるため、培養細胞でのオートファゴソーム産生の有意な増加につながります[20]。ウエスタンブロット分析はまた、細胞がBPSiNPを与えられたときにオートファジーが起こったかどうかを証明するために採用されました。ウエスタンテストの目的は、TFEBの発現が増加し、BPSi給餌後の細胞オートファジーの発生をさらに確認することでした。 LC3BおよびP62タンパク質は両方ともオートファジーマーカーです。オートファジーが発生すると、微小管関連タンパク質1A / 1B-軽鎖3B（LC3B）II / Iの発現が増加します。 p62は、オートファジーによって分解される小胞の受容体であり、ユビキチン化されたタンパク質凝集体が除去される受容体でもあり、オートファジーが発生するとその発現が低下します。そこで、西洋の実験でこれらのタンパク質の発現を測定します。

図1c、d、TFEB（ P ）に示されているウエスタンブロットの結果から _{80μg/ mlVSコントロール} =0.000008）、LC3B II / I（ P _{80μg/ mlVSコントロール} =0.000297）、およびp62（ P _{80μg/ mlVSコントロール} =0.000016）タンパク質はすべて大幅にアップレギュレーションされています。オートファジーの活性化を示すTFEBおよびLC3BII / Iタンパク質のアップレギュレーション[18]として、BPSiエンドサイトーシスがオートファジーの発生を促進すると考えられました。ただし、p62タンパク質は、エンドソームをリソソームに移動させ、最終的に分解するキャリアタンパク質の性質により、オートファジープロセス中にダウンレギュレーションされると考えられています。私たちの研究では、p62の有意なアップレギュレーションは、おそらくエンドリソソーム小胞のpH上昇によって引き起こされた、エンドリソソーム融合プロセス中の分解の終了を示しました[21]。したがって、BPSiエンドサイトーシスは、最初にオートファジーの発生を誘発し、次にそのアミドアルカリ性のためにエンド/リソソームのpH値を上げることによってオートファジープロセスを阻害する可能性があります。

BPSiエンドサイトーシスによるエンド/リソソームのpH上昇特性を証明するために、2つの市販のpH蛍光プローブであるpHrodo™レッドトランスフェリンコンジュゲート（Thermo Fisher ^＃ ）を使用しました。 P35376）、およびRatioWorks™PDMPO。

市販の細胞内pH指示薬としてのpHrodo™Redは、通常、中性pHでは弱い蛍光を示しますが、pHが低下すると蛍光が増加します。細胞質ゾルのpHを9〜4の範囲で定量化し、pKaは〜6.5、励起/発光は560 / 585nmであると想定されていました。 BPSi NPのエンドサイトーシスは、赤色蛍光シグナルが弱くなるため、エンド/リソソームのpH値を上昇させる能力があるという、6つの細胞株測定から定性分析の結論を得ることができました（図S4およびS5）。ただし、製品の操作プロトコルに従って実験を数回繰り返した後、強度と確立されたpH値の間に相関関係がないため、BPSiNPを供給する前後に異なる細胞株間で低下した正確なpH値を定量的に分析することはほとんどできませんでした。

その後、PDMPOは、BPSiエンドサイトーシス後のpH値の変化を示すためのより良いソリューションとして採用されました。これにより、pH定量測定にレシオイメージング技術が導入されます。 PDMPO [2-（4-ピリジル）-5-（（4-（2-ジメチルアミノエチル-ラミノカルバモイル）メトキシ）フェニル）オキサゾール]は、アシドトロピック二重励起および二重発光pHプローブとして特徴付けられます。それはより低いpHで強い緑色の蛍光を発し、より高いpHで強い青色の蛍光を発します。このユニークなpH依存性蛍光により、PDMPOはpKa =4.47の酸性オルガネラの理想的なpHプローブになります。 PDMPOは、生細胞の酸性オルガネラ（リソソームなど）を選択的に標識し、2つの異なる発光ピークを使用して、比率測定で生細胞のpH変動を監視できます。ただし、BPSi供給の前後の6つの細胞株のpH値の測定にはまだ失敗しました。図S6に示すように、BPSi給餌の前後で6つの細胞株すべてに有意差は観察されませんでした。青/緑比とpH値の間には相関関係が確立されていますが（図S7）、pH 4〜5からの非線形相関により、BPSi供給前後のエンド/リソソームの定量分析でPDMPO法が失敗します。

上記の2つの市販のpH指示薬のデータから、最初に、PEG鎖にアミドを含むPEGで装飾されたナノ粒子が、アミドのアルカリ性のためにエンド/リソソームのpHを上昇させる可能性があることを示しました。ただし、正確なpH変化（0.1 pH範囲）の定量分析がなければ、オートファジーの状態とエンド/リソソームのpH値との相関関係を確立できないため、オートファジーの予測に失敗しました。

自己分解性ナノ粒子に関する以前の研究[13、14] [15、22]に基づいて、75％エタノール中の水酸化アンモニウムの濃度を同じに保ちましたが、MBとTEOSの濃度を調整しました。シェルの厚さと細孔径を変えるために、2つのシリーズのTEOS量を100μLと80μLに設定しました。さまざまなサイズの中央中空構造とMB負荷効率を得るために、10シリーズのMB量が設定されています。

プロトコルに追加されたMBおよびTEOSの量は、以下の表1に記載されているとおりです。

図2a、bに示すように、ナノ粒子のサイズは、両方のTEOS濃度（100μLと80μL）で、MB量の増加とともに増加しました。同じMB濃度では、TEOS量の増加に伴って粒子サイズが増加しました。さらに、TEOS量の増加に伴い、シェルの厚さが増加しました。これは、元素マッピングによって証明されています（図2cを参照）。ナノ粒子の多分散度指数（PDI）と表面電荷を図S8と表S1に示します。形態研究では、MB量を増やすと負荷効率が上がり、放出プロファイルが速くなり、TEOS量を増やすと放出が遅くなると予測されました。そして、最適化されたナノ粒子システムを得ることができる適切なMBおよびTEOS濃度を見つける必要があります。これにより、MB放出プロファイルをpH変化と線形相関させることができる可能性があります。

特定のMBまたはTEOS量の10種類の自己分解性ナノ粒子の形態特性評価。 a STEMの数値。 b ナノ粒子サイズ分布分析。 c 10個の自己分解性ナノ粒子のSiマッピング。すべての図のスケールバーは100nmです。サイズ分布分析は、STEM図からランダムに選択された100個のナノ粒子によって実行され、ImageJソフトウェアによって測定されました。データは平均±S.D。

として表されました。

MBのローディング効率は、UV-Visスペクトルによって決定されました。 MBの標準曲線（図S9）は、最初に一連の濃度のMB溶液（6.25から46.88μg/ mL）を使用して、 y の式で作成されました。 =67.63 x + 0.10919、 R ² =0.9987。上記の式で計算すると、特定のパラメーターを使用して10個の自己分解性ナノ粒子のMB負荷効率が得られます。詳細なデータは、図S10に示されています。

さまざまなpH溶液でのMB放出プロファイルを研究する前に、純水中での放出プロファイルを研究しました。図S11および図S12に示すように、TEOS量が80μLのすべてのナノ粒子は、持続時間の増加とともにMB放出の増加を示しました。これは、UV-Vis吸収に反映されています。さらに、MBカプセル化量の増加に伴い、MBリリースの増加傾向がより顕著になります。また、リリース速度が速くなります。ただし、TEOS量が100μLに増加すると、粒子表面はより緻密になり、MB量が3.0mg未満になると放出が遅くなります。放出から14日間の水中でのMB放出には、ほとんど増加傾向は見られなかった。 MB量が4.0mgを超えるまで増加する限り、MB放出の明らかな増加傾向が観察されます。注意すべき点の1つは、両方のNPのナノ粒子パラメーター _{7.5 / 80} およびNP _{6.0 / 100} 時間が長くなるにつれて堅実な成長を示し、最初の7日間はほぼ直線的な増加傾向を示し、その後プラットフォームに到達しました。

次に、さまざまなpHバッファーでのMB放出挙動に焦点を当て、特定のパラメーターを持つ自己分解性ナノ粒子が線形のpH依存性MB放出を持つ可能性があるかどうかを調べました。

まず、pH4.0の緩衝液でMB放出実験を行いました。図S13から、100μLの同じTEOS量で、80μLのTEOSの5つのナノ粒子システムで同様の傾向が観察されたMB放出速度（図S14）、中央が正であるという結論に簡単に到達できます。 MBカプセル化量との相関。

濃縮されたMBは、濃度差による拡散を介して周囲の溶液に拡散します。濃度勾配が大きいほど、MBの放出が速くなります。純水中のMB放出と比較して、酸性環境がMBの放出を加速することがわかり（図S11およびS12と比較した図S13およびS14）、MB放出は拡散によってのみ駆動されるのではないことを示しています。ただし、酸性溶液では、MBの正電荷の性質により、静電反発力も重要な駆動力です。次に、MBローディング効率、MB標準曲線、および測定時の希釈率に従って、各ナノ粒子パラメーターの放出パーセンテージを計算しました。放出パーセンテージは、pH 4.0酸性溶液中のMBの放出速度を反映しており、結果（図3）は、NPの放出パーセンテージのみが _{7.5 / 80} であることを示しました。 pH4.0溶液で線形放出を示した。特定のMBおよびTEOSパラメータを持つ他のナノ粒子システムは同様の放出傾向を示し、放出パーセンテージは直線的な成長を示しませんでした。 1つの例外は、NP _6/100 です。 、MBリリースはわずか72時間でプラットフォームに到達しました。したがって、この段階では、MBリリースがその期間の前に直線的に増加する可能性があるかどうかを判断するのは困難でした。

pH4.0バッファーでの特定の期間後の10シリーズの自己分解性ナノ粒子のMB放​​出パーセンテージ。すべての実験は3回繰り返され、データは平均値±標準偏差として示されました。

一方、中性に近い緩衝液とアルカリ緩衝液（pH6.86およびpH9.18）でMB放出プロファイルをテストしました。図S15、S16、図S17、およびS18の両方の結果は、溶液のpHが6.86に上昇すると、MBの放出が遅くなることを示しています。さらに、中央のMB濃度が増加すると、MB放出率は減少しました。 pH 9.18では、10個の特定のパラメーターを持つすべてのナノ粒子が非常に遅いMB放出を示しました（図S19およびS20）。 UV-Vis吸収または放出パーセンテージに関係なく、傾向はpH 6.86バッファーの場合と同様でしたが、放出パーセンテージはさらに低くなりました。したがって、自己分解性ナノ粒子は、酸性溶液中でMB放出線形成長のみを示すことは明らかでした。エンド/リソソームのpHを4から5に戻しました。これは、特定のMB / TEOSパラメーターでの時間の関数としてのMB線形成長のpH範囲です。したがって、自己分解可能なナノ粒子システムは、エンド/リソソームの平均pHを定量的に決定するための正確な測定ツールである可能性があり、オートファジー状態の正確なpH値に関する証拠を提供することができます。

特定の自己分解性ナノ粒子をエンド/リソソームpH指示薬として使用するための前提条件は、ナノ粒子が測定プロセス全体を通してエンド/リソソーム内で安定していることです。第二に、エンド/リソソームでのMB放出は、測定が実行されたときにスムーズに発生するはずです。

細胞TEM研究によるエンド/リソソームにおけるナノ粒子の共局在化および6つの異なる細胞株におけるMB放出が研究された。細胞TEMの結果から、HepG-2細胞との24時間のインキュベーション後、10シリーズのナノ粒子はすべて逃げることなくエンド/リソソームにとどまりました（図4）。図4で使用されているHepG2セルの直径は約10〜20μmであり、MB @ SiO ₂ の直径であるため ナノ粒子は75〜200 nmであるため、低倍率の画像を使用してナノ粒子の形態を明らかにすることは非常に困難です（図S21を参照）。また、他の5つの細胞株におけるナノ粒子の細胞内位置を調査し、4つのナノ粒子をランダムに選択して、ナノ粒子がエンド/リソソームにトラップされたことを示しました（図S22）。すべてのパラメーターを持つナノ粒子は、24時間のインキュベーション後、他のすべての5つの細胞株で中央の中空構造を示し、MBの放出を示しています。さらに、より正確な観察の下で、中空サイズが異なるためにMB放出が異なる可能性があることに気付きました。これは、（1）異なる細胞のエンド/リソソームpHが異なり、（2）ナノ粒子からのMB放出が異なることを示しています。特にNP _6/100 の場合、エンド/リソソームのpHに非常に敏感です。 およびNP _{7.5 / 80} 。図S23から、ナノ粒子はすでにエンドサイトーシスを実現しており、ナノ粒子の供給から2時間後に小胞に留まり、その後ナノ粒子は徐々にリソソームに蓄積していることがわかります。

10シリーズナノ粒子との12時間および24時間のインキュベーション後の細胞TEM研究によるエンド/リソソーム内のナノ粒子の共局在。 TEM画像のスケールバーは200nmです

次に、pH値とpH 4.0〜4.8のOD値の相関関係を評価しました。図5と図S24の結果から、NP _6/100 およびNP _{7.5 / 80} ナノ粒子システムでは、MB放出は4.0から4.8のpH範囲でpHの関数として直線的な減少を示しました。

特定の潜伏期間、6時間、12時間、および24時間後のNPs6 / 100およびNPs7.5 / 80のpH値の関数としてのMB放出。線形相関式は、pH値の関数としてNPs6 / 100とNPs7.5 / 80の両方からのMB放出について6hと12hについても計算されました。すべての実験は3回実施され、データは平均値±標準偏差として示されました。

次に、MBの負荷効率と供給量に応じて、OD値をMB放出率に変換しました。図S25に示すように、最初の6時間でのNPのMB放出率 _6/100 およびNP _{7.5 / 80} ナノ粒子システムもpH値の関数として表されます。次に、残差平方和とピアソンの関連係数をそれぞれ6hと12hのリリース期間で計算しました。残差平方和は線形フィッティングの近さと負の相関を示し、ピアソンの関連係数の絶対値は1、より線形です。表S2およびS3に示すように、最高の直線性はNP _{6.0 / 100} のフィッティングです。 ナノ粒子システム、続いてNPの1つ _{7.5 / 80} 6時間のリリース時。

それまでは、特に0.1 pH値間隔以下の精度で、pH値を正確に監視する方法が確立されたという結果に非常に興奮していました。つまり、エンド/リソソームのpH値とオートファジーの状態との相関関係を理解する大きな可能性があります。これは、オートファジーのメカニズムをよりよく研究し、オートファジーのプロセスを予測するために非常に重要です。図S26からわかるように、HepG-2細胞でのMB放出は、4時間のインキュベーション後にすでにプラトーに達しています。したがって、観測時点として6hを選択しました。

次に、NPのMBリリースを注意深く調査しました _{6.0 / 100} 肝癌HepG-2細胞株、結腸癌HCT8、HCT 15、およびHCT 116細胞株、肺癌A549細胞株、筋メラニン細胞癌B16細胞株を含む、6時間のナノ粒子細胞相互作用持続時間の6細胞株で。

表2に示すように、6つの癌細胞株のエンド/リソソームを0.01 pH値での精度で明確に区別します。これは、市販の眼内pH指示薬キットでは不可能です。

さらに、BPSiナノ粒子で培養する前後のHepG2細胞のエンド/リソソームのpH値を再評価しました。 BPSiの取り込みにより、エンド/リソソームのpH値が4.70±0.09から5.59±0.05に大幅に増加するという結論に達しました。これは、BPsiの取り込みが最初にオートファジーを誘発し、その後オートファジーフラックスを停止した理由を完全に示しています。 BPSiの細胞内取り込みにより、エンド/リソソームの量が増加します。これは、オートファジー関連遺伝子（TFEB-CLEAR）が活性化された遺伝子シーケンシングの結果と一致していました。一方、エンド/リソソームのpH値の上昇によるオートファジーの終了は、ウエスタンブロット研究におけるp62タンパク質のアップレギュレーションの結果とも一致します。

ディスカッション

ナノ粒子は一般に細胞内でオートファジーを引き起こす可能性があり[23]、中性または陰イオン性の表面を示すナノ粒子に対するオートファジー応答には、オートファジーカーゴのクリアランスの強化が含まれることが研究によって示されています。一方、カチオン性表面を提示するナノ粒子への細胞曝露は、TFEB経路の転写アップレギュレーションをもたらしますが、リソソーム機能障害を引き起こし、最終的にはオートファジーフラックスの遮断をもたらします[7]。そして、私たちの結果は、これらの以前の結論と一致しています。私たちの研究では、HepG2細胞におけるオートファジー関連の遺伝子とタンパク質の発現が、トランスクリプトームシーケンシング、RT-qPCR、およびウエスタン実験を通じてBPSiナノ粒子を供給した後に増加していることを発見しました。ただし、オートファジーが活性化されても、オートファジー関連のP62タンパク質の発現レベルは低下しません。 BPSiナノ粒子の表面にあるPEG-アミンがリソソームのpH値を上昇させ、P62の分解を阻害すると考えられます。既存のリソソームpH指示薬は、私たちの推測を検証できません。生細胞のリソソームpHを正確に測定するために、自己分解性ナノ粒子システムに基づくエンド/リソソームpH定性測定の新しい方法を確立しました。最適化されたpH感受性応答測定法を得るために、特定のMB / TEOSパラメーターを備えた10個のナノ粒子システムが採用されました。内側から外側への放射状のMB濃度勾配は、MB放出の主要な推進力として機能しました。薬物放出は、拡散律速メカニズムによって駆動されるキャリア分解と同時に進行しました。さらに、pH値が低下すると、水素イオン濃度が上昇し、静電相互作用の強化により、中性溶液よりも内部MBの放出が速くなります[24]。最適化された中央中空ナノ粒子システムは、正確にリソソームのpHであるpH 4.0〜4.8の範囲の正確なpH値の一次関数として中央濃縮MBを放出する可能性があります。最後に、自己分解性ナノ粒子に基づくこの定性的pH指示薬により、6つの細胞株におけるリソソームの平均pH値の検出に成功しました。さらに、このシステムにより、HepG-2細胞によるBPSiナノ粒子エンドサイトーシス前後のリソソームのpH変化を定性的に区別し、オートファジー発生とBPSiエンドサイトーシス後の終結のメカニズムを明らかにすることができます。自己分解性ナノ粒子システムは、管腔のpH値を研究するためのまったく新しい方法を提供し、細胞のシグナル伝達と代謝をよりよく知るための新しいツールを提供し、癌の治療のための新しい方法と方法を提供します[25、26]。 / P>

結論

この研究では、BPSiがトランスクリプトームシーケンシングを通じて細胞のオートファジーを促進できることを発見しましたが、ナノ粒子の表面のアミノ基はリソソームのpHを上昇させ、オートファジーの流れの劣化を抑制します。したがって、リソソームのpHはオートファジーの段階に大きく影響します。そして、リソソームのpHの情報を正確に取得することで、オートファジーの認識が促進されます。ただし、既存の蛍光リソソームpH指示薬は、広範囲のリソソームpHしか決定できませんでした。したがって、自己解離システムに基づいて正確なリソソームpH指示薬を確立しました。 MB @ SiO ₂ の合成パラメータを調整する 、ナノ粒子にロードされたMBの放出は、pHと直線的かつ負の相関がありました。そして、ナノ粒子は主に細胞に入った後、リソソームにとどまります。細胞内に放出されたMBの量を測定することにより、リソソームのpH値を線形関数に従って正確に計算できます。確立された正確なpH指示薬は、リソソームのpH値を正確に研究し、オートファジーに関するより多くの情報を取得するためのまったく新しいツールと方法論を提供しました。

データと資料の可用性

この調査中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された記事とその補足情報ファイルに含まれています。

略語

BPSi：

黒のメソポーラスシリコン

FBS：

ウシ胎児血清

GO：

遺伝子オントロジー

HCl：

塩酸

KEGG：

京都遺伝子ゲノム百科事典

MB：

メチレンブルー

NaBr：

臭化ナトリウム

NaSi：

ケイ化ナトリウム

NH4Br：

臭化アンモニウム

NP：

ナノ粒子

OD：

光学密度

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

PDMPO：

2-（4-ピリジル）-5-（（4-（2-ジメチルアミノエチル-アミノカルバモイル）メトキシ）フェニル）オキサゾール

RT-qPCR：

逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応

TEOS：

オルトケイ酸テトラエチル