ヒト皮膚内銀ナノ粒子物理化学特性評価のための新規分析システム

概要

化粧品中の銀ナノ粒子（nAg）安全使用確保のため、皮膚内nAg物理特性を明らかにする必要がある。これら特性は経皮吸収過程で変化する可能性があるためである。本研究では、単一粒子誘導結合プラズマ質量分析（sp-ICP-MS）ベースの分析システム確立を目指し、皮膚内nAg物理特性決定を行った。まず、皮膚試料溶解前処理法を最適化し、水酸化ナトリウム処理で大部分nAgが粒子形態維持しつつ回収されることを示した。表皮と真皮分離のため、マイクロ波照射条件を複数スクリーニング。sp-ICP-MS分析で、200 W 30秒照射が最適で、この条件で皮膚層完全分離が可能であり、大部分nAg物理特性を変化させないことが判明。最後に、マウス皮膚をnAgまたはAg⁺暴露後、表皮、真皮、末梢血中Ag量と物理特性を分析し、in vivo応用評価を行った。続くsp-ICP-MS分析で、nAgは電離形態で吸収・深層分布する一方、Ag⁺は物理特性変化なく吸収・分布することが示された。本研究は、皮膚nAg暴露後の応答を包括的に理解するには、nAgだけでなくnAgから皮膚内放出されるAg⁺の分布と粒子サイズも考慮必須であることを示唆する。

はじめに

ナノテクノロジー技術進歩により、100 nm未満粒子であるエンジニアードナノ粒子（ENPs）開発が加速している。マイクロ・より大粒子材料比で組織透過性向上、表面反応性向上など有益特性により、ENPsは化粧品、食品、医薬品など様々製品に広く用いられる[1-3]。例えば、銀ナノ粒子（nAg）は最も一般的ENPタイプの一つで、銀イオン（Ag⁺）持続放出による抗菌特性から化粧品に配合される[4, 5]。しかし、nAg小粒子サイズに関連する独自物理化学特性は危険性も孕んでいる。これら粒子は血液脳関門など通常迷入不可能バリアを破壊し、炎症誘発すること知られる[6]。また、ENPsが皮膚バリア透過可能との報告もある[7-9]。したがって、これら粒子継続使用安全性判断には、皮膚など組織内粒子動態調査によるENPs含有nAg毒性影響理解が重要である。

安全性確保には、ENPs使用可能リスク理解が不可欠で、「ハザード」（潜在毒性）と「暴露条件」の統合概念が関わる。ENPsハザードは世界中で分析されているが、ENPs暴露条件検討研究はわずか[10]。特に、nAgとAg⁺が体内で物理特性変化可能と報告されている。例えば、nAg電離でより小粒子nAg形成とAg⁺放出[11]。逆に、酢酸銀経口投与ラット腸上皮で小粒子nAg検出[12]。さらに、授乳マウス暴露実験で、より小さなnAgとAg⁺比較で、より大きなnAgが乳汁中により検出されやすいと最近報告[13]。したがって、nAgは体内で物理特性変化し、それが動態変化につながる。リスク理解には、これら粒子物理特性（粒子サイズ等）評価と、体内粒子とイオン区別が必要である。

この点で、単一粒子誘導結合プラズマ質量分析（sp-ICP-MS）を適用した。これはドウェルタイムあたり最大1粒子を分析器導入する手法で、ピーク強度解析で粒子サイズ決定、ピーク頻度で粒子濃度決定可能な効果的手法である[14]。ピークとバックグラウンド信号両方解析で粒子とイオン区別可能。我々は以前、生物試料sp-ICP-MS前処理法最適化し、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓など様々臓器ENPs物理特性半定量決定を行った[15]。

皮膚は角層（SC）含む表皮と、血管、リンパ管、神経含む真皮で構成[16]。したがって、ENPs各皮膚層侵入は様々程度毒性誘発可能。例えば、表皮角化細胞内二酸化チタンナノ粒子分布が反応性酸素種産生刺激[17]。また、無毛マウスで60日間二酸化チタンナノ粒子真皮暴露は、真皮局所毒性による真皮肥薄等病理変化のみならず、真皮血管経由全身毒性拡大で肝臓液化壊死等病理変化も誘発[18]。さらに、各層生物学的応答も粒子サイズ等物理特性と粒子-イオン差で変化可能[19]。nAg使用安全性理解には、皮膚暴露後nAg物理特性と生体分布理解が必要。

この特定課題解決には、回収損失やENPs物理特性変化なしに皮膚前処理・層分離可能なアプローチ必要。しかし、皮膚向け最適アプローチ未考案。

本研究では、モデルENPであるnAg物理特性を皮膚各層でsp-ICP-MSにより半定量決定する前処理アプローチ最適化し、その後in vivo有効性評価を行った。

方法

マウス

Slc:ICRマウス（雌、8週齢）を日本エスエルシー（静岡）から購入。飼育室明暗サイクル：午前8時点灯、午後8時消灯。餌と水はケージ上部配置ペレット餌と給水システムで自由摂取。全実験プロトコルは大阪大学動物実験委員会承認条件下実施。

nAgとAg⁺

クエン酸配位子キャップnAg（直径100 nm、nAg100）懸濁液をnanoComposix（サンディエゴ、米国）からストック分散液（1 mg/mL）形で購入。硝酸銀（AgNO₃）を和光純薬工業（大阪）からストック分散液（1 mg/mL）形で購入。輸送効率計算標準RM8013を米国国立標準技術研究所（ガイサーズバーグ）から購入。各ナノ粒子種を使用前10分間超音波処理。ナノ粒子とイオンも使用前10秒ボルテックス撹拌。

試薬

水酸化ナトリウム（NaOH、0.1 mol/L）を中部試薬（大阪）から、硝酸（HNO₃、70%）を関東化学工業（東京）から購入。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7を調製。

前処理法最適化

各マウス表皮と真皮を分離、PBS（w/v比1:10）混合しホモジナイズ。ホモジネートに100 ng/mL nAg100溶液混合。混合物を以下試薬でv/v比1:1処理：0.1 mol/L NaOH、70% HNO₃、PBS。37°Cで3時間インキュベート後sp-ICP-MS測定。

マイクロ波照射による皮膚層分離

各マウスをイソフルラン（和光）で安楽死後、手術用ハサミとピンセットで2 cm²（2 cm × 1 cm）背部皮膚試料切除。切除手順で組織損傷防止に細心注意。マイクロ波オーブン（RE-SW-20-H、シャープ、日本）で2450 MHz周波数照射。皮膚試料をプレート載せマイクロ波オーブン中央配置。試験要件に従い、200, 600, 900 Wでそれぞれ10, 30, 60秒照射。照射後速やかに取り出し、手術用ピンセットで優しく掻き取り表皮と真皮迅速分離。200 W 30秒照射後、100 ng/mL nAg100溶液で回収率とnAg平均径分析。

nAg100とAg⁺経皮投与

9週齢雌Slc:ICRマウスを体重基準で6群、群3匹に分群。イソフルラン麻酔。背部毛をヘアクリッパー（パナソニック、大阪）と手動剃刀（ジレット、ドイツ）で剃毛。nAg100とAg⁺（20 μg/cm²）を背部皮膚1.5 cm × 1.5 cm（2.25 cm²）面積に直接塗布、非吸収性プラスチックフィルムで密閉被覆。同サイズガーゼをプラスチックフィルム上配置。自己粘着性伸縮包帯で皮膚巻き付けガーゼ覆い、5日間被覆維持。

皮膚試料と血液前処理

処理5日後、眼窩静脈叢末梢血と背部皮膚採取し解析。手術用ハサミとピンセットで1.5 cm × 1.5 cm（2.25 cm²）背部皮膚試料切除。切除時組織損傷防止に細心注意。粘着テープ（スコッチ、3M）2 cm片で順次角層除去、テープを処理部位押し当て10秒加圧。マウス1匹あたり20枚テープで角層全除去。次に、マイクロ波照射で真皮と表皮分離、PBS（w/v比1:10）ホモジナイズ。採取血液、真皮と表皮ホモジネートを0.1 mol/L NaOHでv/v比1:1処理、37°Cで3時間別々インキュベート。インキュベート後、血液、表皮、真皮混合物総銀質量を誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）分析。nAgとAg⁺定量と物理特性評価をsp-ICP-MSで実施。

総銀質量測定

血液、角層、表皮、真皮試料総銀濃度測定にAgilent 7700x ICP-MSシステム（Agilent Technologies、サンタクララ、米国）使用。分析条件：RF電力1550 W、キャリアガス1.05 L/min Ar、ドウェルタイム100 ms。MSモードで3回繰返し測定。ロジウムをAg内部標準用いた。ICP-MS分析対象元素は¹⁰³Rhと¹⁰⁷Ag。Agとロジウム標準液は和光製。

sp-ICP-MS分析と計算

sp-ICP-MS分析にAgilent 7700x ICP-MS（Agilent Technologies）使用。分析条件：RF電力1550 W、キャリアガス1.05 L/min Ar、ドウェルタイム10 ms、分析時間30 s。単一粒子計算ツール-RIKILT（ワゲニンゲン大学食品安全研究、ワゲニンゲン、オランダ）公表版で粒子サイズ計算[20]。

統計解析

全統計解析をGraphPad Prismソフトウェアバージョン5.0（GraphPad Software、ラホヤ、米国）Macintosh版で実施。統計的有意水準P < 0.05。

結果と考察

各皮膚層nAg量と物理特性決定法構築戦略

各皮膚層nAg量と物理特性決定には、皮膚試料完全溶解とsp-ICP-MS解析適試料調製必要。また、回収損失やnAg物理特性変化なしに表皮と真皮分離必須。非経皮吸収nAgはテープストリッピングSC除去時に除去されることある[21]ため。

皮膚試料溶解について、以前NaOH前処理が肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓など動物組織nAg定量と物理特性解析に最適と報告[16]。したがって本研究皮膚試料にNaOH前処理適用。

水熱処理はコラーゲン線維軟化と酵素消化促進で表皮-真皮接合部（EDJ）分離促進し、皮膚表皮層と真皮層分離に広く用いられる[22]。これら処理は効率的層分離可能だが、水溶液中nAgが電離し物理特性変化懸念。短パルスマイクロ波照射で発熱によりEDJ破壊し、皮膚表皮層と真皮層分離可能と報告[23, 24]。したがって、溶液インキュベーションなし短時間マイクロ波照射適用。

以上より、図1示す戦略提案し、各皮膚層nAg回収率と物理特性変化分析で検証した。

表皮と真皮nAg100検出前処理法最適化

前研究参照し皮膚試料溶解前処理法最適化。Ishizakaら[15]はNaOHやHNO₃など様々溶解試薬中、NaOH前処理最適と報告。したがって酸性溶解試薬HNO₃とアルカリ性NaOHをスクリーニング。マウス皮膚試料分離表皮と真皮ホモジネートをnAg100混合、最終Ag濃度100 ng/mLとし、各溶解試薬で37°C処理。まず、これら試薬処理後Ag回収率評価。ICP-MS分析でNaOHとHNO₃処理のみほぼ100%回収率達成（図2a）。次に、各処理物理特性変化評価のため、各粒子とイオン回収濃度分析。sp-ICP-MS分析でnAg100がHNO₃でほぼ完全電離。HNO₃が酸性試薬として粒子溶解しイオン化変換すること示唆、先行研究でも報告[15]。対照的に、NaOH処理nAg100大部分は粒子形態残存、イオン化せず（図2b）。したがってNaOHで大部分nAg100粒子形態維持可能。最後に、粒子径分布評価し物理特性詳細分析。HNO₃処理で平均粒子径100 nmから40 nm変化、nAg100電離に対応。一方、NaOH処理後平均粒子径約100 nm、初期粒子サイズ対応（図2c）。NaOH前処理がマウス皮膚nAg100検出最適手法示唆。

マイクロ波照射による皮膚試料表皮・真皮分離とnAg回収率・物理特性変化評価

皮膚試料表皮・真皮層分離のため、本研究関連で先行報告成功条件[24]マイクロ波照射条件適用し、皮膚分離性と物理特性変化比較検討。200 W 10秒、600 W 30秒、600 W 60秒、950 W 30秒、950 W 60秒条件では皮膚表皮・真皮層分離失敗（図3a）。また、200 W 60秒、600 W 10秒、950 W 10秒では部分分離のみ。対照的に、200 W 30秒照射でのみ完全分離達成。これら結果は200 W 30秒照射が皮膚層分離最適条件示す。

200 W 30秒マイクロ波照射がnAg100物理特性影響するか検証のため、表皮・真皮層Ag物理特性決定。各100 ng/mL nAg100混合表皮・真皮ホモジネートをNaOH溶解し200 W 30秒照射。sp-ICP-MS分析で、マイクロ波照射処理nAg100大部分が粒子形態残存、非処理群も同様（図3b）。詳細物理特性分析のため粒子径分布も評価。平均粒子径ほぼ100 nm、初期粒子サイズ対応（図3c）。これら所見は、200 W 30秒皮膚試料マイクロ波照射が、nAg100物理特性変化なしに皮膚表皮・真皮層効率的分離有望アプローチであること示唆。

総括すると、sp-ICP-MSで各皮膚層nAg100物理特性半定量決定システム開発成功。具体的には：（i）テープストリッピング法[21]でSC除去し非経皮吸収nAg100除去；（ii）マイクロ波照射で皮膚表皮・真皮層分離；（iii）NaOH処理で表皮・真皮溶解；（iv）sp-ICP-MSで各皮膚層Ag物理特性半定量決定。

マウス皮膚層in vivoでのnAg100とAg⁺量・物理特性決定による実用評価

本アプローチ実用応用評価のため、マウス皮膚nAg100とAg⁺暴露後、表皮・真皮および末梢血中Ag量と物理特性分析。暴露5日後、マイクロ波照射最適条件で皮膚表皮・真皮分離、前節記載NaOH溶解。ICP-MS分析で全群全組織（表皮、真皮、血液）Ag存在確認。真皮と血液でAg⁺暴露群Ag傾向増加、nAg100暴露群比（図4a）。データはイオンと粒子両形態が経皮吸収・分布することを示唆[8, 9]、イオン形態が粒子形態より深層組織浸透容易示唆。

次に、各試料nAgとAg⁺比評価。Ag⁺暴露群では表皮、真皮、血液ほぼ全Agがイオン形態検出、Ag⁺が物理特性変化なしに経皮吸収・分布。一方、nAg100暴露群では表皮・真皮Ag約70%粒子形態、残り電離。さらに末梢血Agほぼ完全電離、粒子形態ほぼ検出せず（図4b）。最後に、主に粒子形態検出された表皮・真皮層粒子サイズ評価。sp-ICP-MS分析で両層検出粒子サイズ約70-80 nm、nAg100電離率対応（図4c）。これらデータは皮膚nAg100暴露時、電離しながら吸収・分布可能示唆。

先行報告でナノ粒子表面配位子が皮膚吸収影響[25, 26]。例えば、アミノ基修飾金ナノ粒子がカルボキシル基修飾よりマウス・ヒト皮膚吸収大[25]。分子動力学解析で皮膚透過能が中性疎水性→陽イオン性→陰イオン性金ナノ粒子順で減少[26]。本研究ではnAg100クエン酸修飾で負電荷帯びるため、表皮初期バリア角層透過しにくいと推測。真皮・血液粒子観察理由は、毛孔透過と表皮透過両方可能性。

また、細胞透過ペプチド（Tat、R7等）修飾で金ナノ粒子透過性向上報告[25]。将来、nAg類似修飾で深層送達検討可能。さらに、nAgサイズ縮小必要かも。表面修飾効果は比表面積大でより大きいため。

結論

本研究では、sp-ICP-MSで各皮膚層nAg100物理特性半定量決定前処理アプローチ開発。このアプローチで、皮膚nAg100暴露がnAg100電離、吸収、深層分布結果となること示した。したがって、皮膚nAg100暴露関連生物学的応答や毒性理解には、nAg100分布と粒子サイズのみでなく、皮膚組織溶融するnAg100由来Ag⁺分布も考慮必要。したがって、このアプローチはリスク分析基礎技術として有望。