新規の均一磁場を使用したMG-63骨芽細胞への磁性ポリエチレンイミンナノ粒子の磁気感染の改善

要約

この研究は、新しい均一磁場の使用を低分子量ポリエチレンイミン修飾超常磁性酸化鉄ナノ粒子（PEI-SPIO-NP）と統合することにより、MG-63骨芽細胞の磁気感染を改善することを目的とした。サイズ、ゼータ電位、pDNA結合、保護能力などのPEI-SPIO-NPの優れた特性は、遺伝子送達に適していると判断されました。新しい均一磁場により、ポリエチレンイミンで修飾された超常磁性酸化鉄ナノ粒子/ pDNA複合体（PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体）がMG-63細胞の表面に迅速かつ均一に分布し、局所的なトランスフェクションを回避し、膜の破壊を低減します。正に帯電したPEI-SPIO-NPを一元化することにより、トランスフェクション中の磁性遺伝子キャリアの有効範囲を拡大し、磁気感染効率を向上させます。この革新的な均一磁場を使用して、PEI-SPIO-NPとpDNAの間の最適な量を決定したり、均一な条件下での磁性遺伝子キャリアの最適な製剤設計をスクリーニングしたりできます。最も重要なことは、新しい均一磁場がPEI-SPIO-NPs / pDNAの骨芽細胞へのトランスフェクションを促進し、それによって骨肉腫組織への治療遺伝子の標的送達のための新しいアプローチと、他の腫瘍の治療のための参照を提供することです。 / P>

背景

骨肉腫は、主に小児および青年に発症する最も一般的な悪性骨腫瘍です。従来の治療法は限られた改善しか提供しないため、その治療のための新しい戦略が不可欠です[1,2,3]。遺伝子治療の出現により、研究者は骨肉腫への応用を評価するようになりました[4,5,6]。安全で効果的な遺伝子送達システムは、遺伝子治療にとって非常に重要です。遺伝子送達システムは、ウイルス遺伝子送達システムと非ウイルス遺伝子送達システムに分けることができます。ウイルス遺伝子デリバリーシステムは、さまざまな初代細胞および細胞株で高いトランスフェクション効率を示すことが示されています。ウイルス遺伝子送達システムは、炎症反応や遺伝子変異の誘発などの安全性の問題と強く関連しており[7]、研究者は研究を非ウイルス遺伝子送達システムに転用するよう促されています。しかし、ほとんどの非ウイルス遺伝子トランスフェクション技術は、骨肉腫細胞株のトランスフェクションに特に効果的ではありませんでした[8、9]。

過去10年間、遺伝子銃[10]、超音波[11]、エレクトロポレーション[12]などのさまざまな物理的手法がトランスフェクションの改善に効率的に使用されてきました。しかし、これらの物理的方法は細胞損傷も引き起こします[13]。磁場は一般に細胞の損傷を引き起こさないため、磁気支援トランスフェクションの技術は研究者の注目を集めています。 Mah etal。緑色蛍光タンパク質（GFP）を運ぶ組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）を磁性ナノ粒子に結合させて、遺伝子トランスフェクション実験に磁性ナノ粒子を導入し、invitroおよびinvivoの両方で標的特異的な強化されたトランスフェクションを実現しました。純粋なアデノウイルスと比較して、磁性アデノウイルスナノ粒子は、同じトランスフェクション率の条件下で、GFPを運ぶrAAVの投与量を1％に減らすことができます[14]。 Scherer etal。磁性粒子を使用した磁石を介したトランスフェクションを表すために「マグネトフェクション」という用語を作り出しました[15]。続いて、Plank等。非ウイルスベクターを使用した磁気トランスフェクションの技術を説明しました[16]。非ウイルスベクターの磁気感染効率をさらに改善するために、Fouriki etal。振動磁場の周波数と振幅を調整して、磁性ナノ粒子に動的な機械的刺激効果を誘発し、それによって標的細胞と接触する可能性を高めました[17]。 Oral etal。磁石の六角形のシャフトを逆回転させて磁場の速度と方向を制御することにより、トランスフェクション効率がさらに向上し、遺伝子キャリアの細胞毒性が低下しました[18]。別の研究では、Vainauska等。磁性遺伝子キャリアの送達を標的とするために、円筒形の永久磁石を回転させることによって生成された動的勾配磁場を使用しました[19]。

磁場が静的で単一から動的で洗練されたものへと進化するにつれて、磁気フェクションの効率は大幅に向上しました。ただし、磁場の均一性と有効範囲に焦点を当てた研究は限られています。私たちの知る限りでは、ほとんどの磁石デバイスは特定の3次元空間で均一な磁場を形成できないため、磁性ナノ粒子の不均一な分布をもたらし、磁場の局所的なトランスフェクション効果のみを達成し、結果として生じる細胞毒性に対処できません。不均一な磁場はまた、磁気トランスフェクション試薬の比較を妨げるだけでなく、トランスフェクション効率を低下させます。

これらの問題を解決するために、重慶大学の電気工学部と共同で私たちの研究グループは新しい磁場発生器を開発しました[20、21]。磁場発生器は、特定の高さで均一な磁場を形成することができ、追加された磁性ナノ粒子は、培養プレートの底に迅速かつ均一に分布します。均一磁場は、さまざまなトランスフェクション試薬の用量とトランスフェクション効率の関係を比較研究するのに便利なだけでなく、磁性ナノ粒子の細胞への取り込みを評価する際にも利用できます。

現在の設計では、骨肉腫細胞株で高い磁気感染効率を備えた信頼性の高い非ウイルス遺伝子デリバリーシステムを確立することを目指しました。磁性ナノ粒子の調製には、線形Mw20000ポリエチレンイミン（PEI-20000）が選択されました。これは、以前のいくつかの研究で、線形PEI送達システムのトランスフェクション効率が分岐PEI送達システムよりも優れていることが確認されているためです[22、23]。ポリエチレンイミン修飾超常磁性酸化鉄ナノ粒子（PEI-SPIO-NPs）の特性を評価しました。均一な磁場を形成するために新しい磁場発生器が開発され、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体をMG-63骨肉腫細胞株にトランスフェクトするために使用されました。マグネトフェクションに対するさまざまな磁場の影響を体系的に調査しました。

メソッド

材料と試薬

超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPIO-NP）、ポリエチレンイミン塩酸塩（PEI）、およびHoechst-33,324は、Sigma-Aldrich Co.（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 PolyMag-200（市販のマグネトフェクション試薬）は、Beijing Chief-East Tech Co.、Ltd。（Qwbio）（Beijing、China）から入手しました。 1-エチル-3- [3-（ジメチルアミノ）プロピル]カルボジイミド（EDC）および N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）は、Chengdu Xiya Reagent Co.（Sichuan、China）から購入しました。 PolyMag-200および96ウェル細胞培養磁気プレートは、Chemicell GmbH（ベルリン、ドイツ）から購入しました。ダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）とペニシリン-ストレプトマイシンおよびウシ胎児血清（FBS）は、Invitrogen-Gibco（CA、USA）から入手しました。ローダミンBイソチオシアネートは、Aladdin Ind。、Co。（Shanghai、China）から入手しました。 LysoTracker Green DND-26は、Shanghai Wei Jin Biological Technology Co.、Ltd。（Shanghai、China）から入手しました。ＣＣＫ－８試験キットはセブンシーズバイオロジカルテクノロジー株式会社（上海、中国）から入手し、エンドフリープラスミドマキシキット－２５はオメガ（ジョージア州、米国）から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）およびその他の試薬は当研究室で調製しました。すべての溶媒と化学物質は分析グレードでした。

PEI-SPIO-NPの合成

PEI-SPIO-NPは、以前に説明されているように準備されました[24]。簡単に説明すると、0.1gのEDCと0.5gのNHSを15mLのカルボキシル修飾SPIO-NPs水溶液（5 mg / mL、pHを5に調整）に加え、溶液を室温で4〜6時間撹拌して、酸化鉄ナノ粒子のカルボキシル。次に、同量のポリエチレンイミン塩酸塩水溶液（20 mg / mL）を加え、数時間反応させました。得られたコンジュゲートPEI-SPIO-NPs溶液を、蒸留水に2日間浸した透析膜（MWCO 20,000）を使用して透析し、コンジュゲートしていないPEI分子と中間体をすべて除去しました。ナノ粒子溶液のアリコートを凍結乾燥して保存しました。

PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の合成と特性評価

PEI-SPIO-NPの合成は上記のとおりで、PEI-SPIO-NPとプラスミドDNA（pDNA）を37°Cで10分間別々に予熱し、異なるN / P比で混合して調製しました。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の形態は透過型電子顕微鏡（TEM、CM100、フィリップス、オランダ）で測定し、流体力学的直径は動的光散乱（DLS、Nicomp 380、PSS、FL、米国）で測定しました。。 SPIONおよびPEI-SPIO-NPの磁気特性は、EV-11振動試料型磁力計（PPMS-9、Quantum Design、米国カリフォルニア州サンカルロス）を使用して300 Kで調べました。測定値は、各サンプル、および測定値は、誘導結合プラズマ発光分光計（ICP-OES）によって検証されました。

表面電荷は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH =7.4）中で動的光散乱装置（Malvern、サウスボロー、マサチューセッツ州、米国）を使用してゼータ電位を測定することによって測定されました。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体は、PEI-SPIO-NPs溶液をpDNA溶液に添加することにより、2.5〜25の範囲のさまざまなN / Pモル比で調製し、最終的なpDNA濃度を30μg/ mLに調整しました。

PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の成分は、原子間力顕微鏡（IPC-208B、重慶大学、重慶、中国）を使用して検出されました。観察用の担体として使用された小さな薄片状の金属をアセトンで洗浄し、乾燥させた。次に、アンチセンスプローブサンプルを数滴金属上に置き、風乾した。サンプルの表面形態は、700nm×700nmおよび1000×1000ピクセルの大規模なスキャン領域で観察されました。サンプルの分子構造と微細構造は、9nm×9nmと800×800ピクセルの小規模なスキャン領域で観察されました。元の画像データはコンピュータに送信され、G2DRソフトウェアを使用して3D再構成が実行されました[25]。各グループで3回測定を繰り返しました。

PEI-SPIO-NPと結合した後のpDNAの移動度をゲル電気泳動で分析しました。 PEI-SPIO-NPs / pDNAのN / P比は、1 / 5、1、5、10、15、20、25、および30であり、DNAの含有量は3μgに保たれていました。 37°Cで15分間インキュベートした後、10μLの混合溶液を1％アガロースゲル電気泳動（90 V、30分）で分析しました。裸のpDNAをコントロールとして使用しました。

DNaseIに対するpDNAの保護に対するPEI-SPIO-NPの効果を評価しました。さまざまなN / P比のPEI-SPIO-NPs / pDNA複合体と裸のpDNA（3μg）を5％CO ₂で37°Cでインキュベートしました。 DNase / Mg ²⁺ 中のDNaseI（4 U）を使用した30分間の亜湿潤環境 50 mM Tris-HCl（pH =7.6）と10 mM MgCl ₂で構成される消化バッファー。次に、最終濃度が2.5 mMになるまでEDTA溶液（pH =8.0）を添加して、DNaseIを不活化しました。次に、サンプルを65°Cで15分間インキュベートし、10μLの1 mg / mLヘパリンナトリウムを添加して、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体からpDNAを放出しました[26]。 pDNAの完全性は、1％アガロースゲル電気泳動（90 V、30分）によって評価されました。

磁場

新しい磁場発生器（図4）は、重慶大学の電気工学部と共同で私たちのグループによって開発されました[20、21]。 3D CAD画像を使用して、均一な磁場の磁石の配置を示しました。関心領域の磁場のXOY平面分布と3D分布が表示されました。異なる磁場でのPEI-SPION-NPの分布が観察され、不均一な磁場（96ウェルNd-Fe-B永久プレート）がコントロールとして使用されました。

細胞培養

ヒト骨肉腫細胞株MG-63（元々はアメリカンタイプカルチャーコレクションから）は、幹細胞治療の重慶工学研究センター（中国、重慶）から入手しました。細胞は、10％FBS、100 U / mLペニシリン、および100 mg / mLストレプトマイシンを添加したDMEMで維持し、5％CO ₂とともに37°Cで培養しました。相対湿度95％。

インビトロ細胞毒性

MG-63骨肉腫細胞に対するpDNAの有無にかかわらず異なるナノ粒子および磁化または非磁化ナノ粒子のinvitro細胞毒性効果は、CCK-8テストキットを使用して決定されました。細胞を96ウェル培養プレートに4×10 ³ の密度で播種しました。ウェルあたりの細胞数、およびさまざまなナノ粒子を追加し、24、48、72、および96時間インキュベートしました。あらかじめ設定した時点でCCK-8溶液（培地の10％容量）を各ウェルに添加し、細胞をさらに2時間培養しました。細胞の光学密度は、450 nmの波長で蛍光マイクロプレートリーダーを使用して評価され、吸光度の値は高い細胞生存率を反映しています。高い生存率の観察は、ナノ粒子が低い細胞毒性効果を誘発することを示しています。 PolyMag-200 / pDNAおよびPolyMag-200をポジティブコントロールとして使用しました。細胞に対するさまざまな磁場の毒性効果を研究するために、遺伝子ベクターとしてPEI-SPIO-NP（pDNAなし）を選択し、さまざまな時点でさまざまな磁場に介入した細胞の光学密度を調査しました。

共焦点顕微鏡分析

PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体またはポリエチレンイミンナノ粒子（PEI-NPs）の取り込みは、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察されました。 MG-63骨肉腫細胞を24mmガラス皿に3×10 ⁵ の密度で播種しました。ウェルあたり。ローダミンBイソチオシアネート（RBITC）で標識されたPEI-SPIO-NPs / pDNA（3μg）複合体を細胞に添加し、均一磁場または不均一磁場の作用下で30分間インキュベートしました。 RBITC標識PEI-NPs / pDNA複合体は、磁場の介入なしに細胞に追加されました。次に、細胞をすぐにPBS（0.01 M）で2回洗浄して、遊離のRBITC標識PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体またはRBITC標識PEI-NPs / pDNA複合体を除去し、処理した細胞を6〜24時間インキュベートしました。。トランスフェクションの6、12、24時間後に培地を除去し、細胞核をHoechst33342で5分間染色しました。 Hoechst 33342残留物を除去した後、細胞を0.5 mM LysoTracker Green DND-26を含む予熱した培地で1時間インキュベートし、予熱したPBSで2回洗浄しました。細胞は、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 700、Carl Zeiss、Oberkochen、ドイツ）で、次の励起（Ex）および発光（Em）波長[GFP（Ex：488 nm; Em：530 nm）、Hoechst（Ex：350 nm; Em：460 nm）、LysoTracker Green（Ex：443 nm; Em：505 nm）、およびRBITC（Ex：554 nm; Em：576 nm）] [27 ]。

フローサイトメトリー分析

MG-63細胞を12ウェルプレートに播種しました（1×10 ⁵ ウェルあたりの細胞数）24時間、その後、PBSで2回リンスし、トランスフェクション前に37°Cで0.8 mLOpti-MEM培地で1時間プレインキュベートしました。 3μgのpDNAを含むPEI-SPIO-NPs / pDNA複合体（N / P =10）またはPEI-NPs / pDNA複合体（N / P =10）を各ウェルに添加し、細胞培養プレートを均一に配置しました。または20分間の不均一な磁場。 PolyMag-200 / pDNAをポジティブコントロールとして使用しました。 4時間後、細胞を1 mL PBS（0.01 M）で3回リンスして、遊離のPEI-SPIO-NPs / pDNA複合体またはPEI-NPs / pDNA複合体をすべて除去し、細胞をさらに24時間培養しました。インキュベーション後、細胞を収集し、フローサイトメトリー（BD FACS Canto II、BD Biosciences、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）によってトランスフェクション効率を評価し、実験のこの部分を3回繰り返しました。

統計分析

定量的データは3回取得されました（ n =5）そして平均±標準偏差として表されます。統計分析は、多重比較のための一元配置分散分析と学生の t を使用して実行されました。グループ間比較のテスト。 P 値<0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

マグネトフェクションの原理

マグネトフェクションは、超常磁性ナノ粒子に関連し、磁場の適用によって標的細胞に蓄積するベクトルとして定義されます[15]。図1は、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の構成要素と形態、およびマグネトフェクションの主要な原理を示しています。標的組織におけるベクターの蓄積が遅く、その結果としてベクター濃度が低いことは、効果的な遺伝子送達に対する単純であるが強力な障壁として特定されています[28]。マグネトフェクションの主な有効性を高めるメカニズムは、標的細胞への完全なベクター用量の急速な沈降であるように思われ、これらの細胞の最大100％が数分以内にそれらの表面にベクター粒子を結合させます。したがって、マグネトフェクションは、遅いベクター蓄積の強い障壁を克服し、その結果、標的組織での低いベクター濃度を克服するための適切なツールです。 PEI-SPIO-NPs / pDNAはランダムに複合体を形成し、磁場がない状態で標的細胞に沈着するのに限られた時間しかかかりません。それでも、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体は、磁場の存在下で比較的短時間で標的細胞に広く均一に接触する可能性があります。これにより、細胞の単位面積にエンドサイトーシスが取り込まれる可能性が高くなります。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の利用率を改善し、トランスフェクション効率を高めます。

PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の特性評価

図2aは、PEI-SPIO-NPがほぼ球形であり、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体が凝集しているように見え、どちらも良好な分散性を示し、正電荷と負電荷の間の引力によりPEI-SPIO-NPs / pDNA複合体が獲得できることを示しています。小さいサイズ。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体のヒステリシスループを図2bに示します。原子吸光分析装置で測定されたPEI-SPION-NPの酸化鉄の重量パーセントは20.33（±2.87）％です。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の飽和磁化は21.5（±1.6）emu / g鉄でした。未修飾の超常磁性酸化鉄ナノ粒子と比較して磁気特性が低下しているにもかかわらず、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体は、高効率の磁気フェクションに必要な優れた磁気応答性を示しました。

流体力学的直径とゼータ電位は、遺伝子キャリアの不可欠なパラメーターと見なされていました。図2cは、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の流体力学的直径が200（±21.7）nmであり、N / P比（NH ₂）であることを示しています。 -PEI / PO ₄のグループ —pDNAのグループ）は2.5、N / P比が5の場合は175（±16.4）nmであり、電位が負から正に遷移する間にサイズが急速に変化したことを示しています。その後、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体間の反発力は、N / P比が高くなるにつれて増加し、ナノ粒子のサイズが増加したことを示しています。

原子の配置に応じて化学結合の種類を分析し、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の分子構造についてさらに推測しました。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の分子構造は、原子間力顕微鏡（AFM、図2d）によって間接的に開示され、超常磁性酸化鉄ナノ粒子のカルボキシル基がアミド結合によってPEIの第一級アミンと結合することが示されました。さらに、pDNAはヌクレオチド鎖のリン酸基とPEIのアミン基の間の静電結合を介してPEI分子鎖に包まれ、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体を形成しました。 AFMグレースケール画像では、赤い点は鉄原子の位置を表し、緑の点は窒素原子を示し、黄色の点は炭素原子を示し、リン原子は黒い点のある白い円で表されます。

図2eに示すように、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の電位は、動的光散乱装置を使用して検出されました。 pH =7では、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPIO-NP）の電位は-6.6（±1.1）mVであり、表面にカルボキシル基が存在することを示しています。 PEI-SPIO-NPの電位は+18.2（±1.5）mVでした。 SPIO-NPで修飾されたPEIの可能性は、正に帯電した表面に変換され、負に帯電したpDNAと結合する遺伝子キャリアとして使用できます。異なるN / P比でのPEI-SPIO-NPs / pDNA複合体の表面電荷の変化を評価しました。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体は、2.5の低いN / P比でも負の表面電荷を示し、N / P比が5に増加すると、徐々に正の表面電荷に変換されました。このN / P比の増加PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体では、ポリプレックスの正の表面電荷が増加しました。 N / P比が10の場合、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体（N / P =10）の電位は+ 11.9（±1.2）mVであり、表面電荷はプラトーに達しました。正に帯電した複合体は負に帯電した細胞膜と接触し、複合体を形成したナノ粒子の細胞への取り込みを可能にしました[29]。 PEI-SPIO-NPは、負に帯電したpDNAの遺伝子キャリアとして使用できるだけでなく、標的化ドラッグデリバリーに一定レベルの磁性をもたらし、磁気共鳴画像法（MRI）造影剤に使用される造影剤になります[30、31]。。

遺伝子キャリアの基本的な要件は、トランスフェクションキャリアが核酸と安定した複合体を効率的に形成する必要があることです。その結合能力を評価するために、同様の量のPEI-SPIO-NPs溶液とpDNA溶液を異なるN / P比で混合し、ボルテックスしました。次に、混合物の10μLアリコートをアガロースゲル電気泳動で分析しました（図3a）。裸のpDNAとは対照的に、プラスミドの移動はN / P比5で完全にブロックされ、PEI-SPIO-NPがpDNAを完全に濃縮したことを示しています[32]。

潜在的な遺伝子キャリアとしてのPEI-SPIO-NPの別の特徴は、ヌクレアーゼによる分解からpDNAを保護し、それによってトランスフェクションを促進できることです。図3bは、裸のpDNAがDNase-Iによって大幅に分解されることを示しています。 N / Pモル比<5のPEI-SPIO-NPs / pDNA複合体は完全に消化されましたが、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体（N / P =5：1）から放出されたpDNAは無傷のままでした。これらのDNase-I保護アッセイの結果は、PEI-SPIO-NPがpDNAをDNase-I消化から効果的に保護することを示しており、遺伝子治療への応用の可能性を示唆しています。

上に示したように、N / Pが<5の場合、PEI-SPIO-NPはpDNAをヌクレアーゼ分解から保護できませんでした。 N / Pが> 10の場合、PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体のサイズが増加し、ベクター輸送には不適切でした[33、34]。 PEI-SPIO-NPs / pDNA複合体のサイズは最小であり、N / P =5で安定性を示しました。さらに、PEI-SPIO-NPsのゼータ電位はN / P> 10の場合に有意に増加しませんでした。 PEI-SPIO-NPs / pDNAの安定性を確保するために、後続の実験ではN / P比を10に選択しました。

磁場の生成

新しいハルバッハ磁場発生器（図4a、b）は、重慶大学の電気工学部と共同で私たちのグループによって開発されました[20、21]。新しい磁場発生器は、9つの同一の直方体永久磁石モジュールと2つのパッシブシミングシート（図4c）で構成されており、水平面に非常に均一な磁場を生成します。

最適化された磁石構造により、YOZ平面の50mm×50mmの領域の水平方向に平坦に分布する磁場を生成できます。勾配は、2 mT / mmの勾配で垂直方向に分布します。磁場は50mm×50mmのXOY領域に均一に分布し、1.3×10 ^-3 の均一性があります。磁場が0.0739Tの場合、細胞培養プレートが配置された冠状面と矢状面の磁気強度は、それぞれ0.0632Tと0.07Tです。96ウェル細胞培養磁気プレートの各ウェルの均一性の差は約80％（図4d、e）。ただし、新しいハルバッハ磁場の各ウェルの均一性の差は2‰未満であるため、2つの磁場の均一性の差は> 100倍になります（図4f）。この場合、96ウェル細胞培養磁場を不均一磁場として設定しました。新しいハルバッハ磁場は比較的均一な磁場であり、その後の研究の実験ツールとして使用されました。

PEI-SPIO-NPの分布は、磁場の影響を大きく受けました。 PEI-SPIO-NPは重力のために徐々に沈み、磁場がない場合はランダムに分布しました。磁場をかけると、PEI-SPIO-NPはプレートの底に急速に沈みました。さらに、分布はまた、異なる磁場で大幅に変化する可能性があります。従来の不均一磁場（96ウェル細胞培養磁界）では、PEI-SPIO-NPが塊または帯状に集められ、磁力線に沿って分布していました（図4g）。ただし、PEI-SPIO-NPは、新しい磁場発生器によって誘導された均一な磁場に均一に分布していました（図4h）。磁場のXOY平面分布と3D分布からわかるように（図4i、j）、図の赤い領域は比較的均一な磁場であり、約2000分の1（ Z = 10 mm), and it can be seen that the gradient of the magnetic field in the target region is about 1.3 t/m (130 G/cm). The magnetic field generated in the designated area could obtain a good flat property in the horizontal direction by adjusting the arrangement of the magnet module and changing the magnetization direction of the magnet module.

Assessment of In Vitro Cytotoxicity

We used CCK-8 kits to evaluate the effects of magnetization, magnetic field, and pDNA on the cytotoxicity of nanoparticles. Figure 5a shows that with the prolongation of culture time, the absorbance values increased in all the groups except for the PolyMag-200/pDNA groups. The absorbance values of PEI-SPIO-NPs/pDNA group were higher than that of PEI-NPs/pDNA group and PolyMag-200/pDNA group (P < 0.05) and lower than that of the control group (P > 0.05), suggesting that the cytotoxicity of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes is lower than unmagnetized PEI-NPs/pDNA complexes and PolyMag-200/pDNA complexes. Figure 5b shows the negative effects on the absorbance values caused by the uniform and non-uniform magnetic fields. The negative effect caused by the uniform magnetic field was smaller than that caused by the non-uniform magnetic field (P <0.05）。 As shown in Fig. 5c, the absorbance values of nanoparticles without pDNA is significantly lower than that of nanoparticles with pDNA (P < 0.05), which meant nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts.

Although PEI is an efficient transfection reagent, its cytotoxicity is strongly and positively correlated with its transfection efficiency and the mechanism of cytotoxicity caused by PEI is not very clear [35]. The present study found that during transfection, PEI increases the permeability of the cell membrane and damages the integrity of the mitochondrial and nuclear membranes [36, 37].ソナワネ他[38] reported that PEI25K promotes the release of mitochondrial protons and inhibits the electron transport chain in a dose- and time-dependent manner, indicating that PEI induces cell apoptosis. Another study showed that PEI induces cell autophagy, which is closely related to cytotoxicity [39]. The cytotoxicity of magnetized PEI decreased, and this might be attributable to the surface carboxyl groups of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are negatively charged, thus partly neutralizing the positive charge of the PEIs and decreasing the chances of incurring irreversible damage. The non-uniform magnetic field induced PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes to gather into masses or bands, and be distributed along with the lines of magnetic force (Fig. 4b), thereby causing severe damage to parts of the cell membrane and even cell death due to the excessively high number of positive charges [40]. In contrast, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes were uniformly distributed across the uniform magnetic field, thereby decreasing the accumulation of positive charges and reducing the cytotoxicity.

Nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts than nanoparticles without pDNA; this may be attributed to the negatively charged pDNA partially neutralize the surface positive potential of the cationic nanoparticles at the beginning of magnetofection progress. Moghimi SM et al. concluded that PEI-induced cellular toxicity could been defined as a two-stage process, with the first stage taking place within 30 min of PEI uptake [41]. Stage-one toxicity has been defined as necrosis that is based on compromise of cell membrane integrity mediated by PEI binding to negatively charged plasma membrane proteoglycans, with highly cationic NPs being extremely cytotoxic [42]. After internalized by MG-63 osteoblast, different nanoparticles exhibits similar cytotoxic mechanisms, internalization leads to proton buffering, osmotic pressure, and eventual lysis of lysosomal membranes, releasing hydrolytic enzymes and other lysosomal constituents into the cytoplasm [43].

Cellular Uptake of PEI-SPIO-NPs/pDNA Complexes

To better understand the intracellular distribution of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes or PEI-NPs/pDNA complexes and the relationship between intracellular uptake of complexes and transfection efficiency, a laser scanning confocal microscope was used to trace the magnetized RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes and non-magnetized RBITC-PEI-NPs/pDNA complexes during transfection of MG-63 cells. LysoTracker Green D26 is a specific marker for lysosomes, and Hoechst 33342 specifically stains nuclei. Overlapping green and red fluorescence, which yields yellow fluorescence, represents colocalization and indicates entrapment of polyplexes in lysosome.

Figure 6 shows that extensive co-localization was observed at 6 h post-transfection, which indicates that most of the complexes were entrapped in endosomes. The RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed a higher frequency of co-localization than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group (arrow). At 12 h post-transfection, most of the red fluorescence had already translocated from the green fluorescence of lysosomes to the surrounding blue fluorescence of nuclei, and some green fluorescence of gene expression was visible in the cytoplasm, which indicated that most complexes escaped the endosomes via the proton sponge effect [44, 45] (arrow). The fluorescent signals of the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group were more distinct than those of the RBITC-SPIO-PEI-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group. It was interesting that the cytoplasm emitted green fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, which indicated expression of GFP, thereby illustrating the proton sponge effect that facilitates gene expression. At 12 h post-transfection, some nuclei emitted red fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, indicating that complexes had been transported into nuclei, which may be attributable to the mechanical effect of magnetofection (arrow). At 24 h post-transfection, the green fluorescence in the cytoplasm showed maximal levels, the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed more intense green fluorescence than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field and the PBITC-PEI-NPs group (arrow). The affiliated magnetic field enabled the magnetic nanoparticles to attach rapidly to the cell membrane and accelerate intracellular uptake of magnetic nanoparticles. By contrast, up to 100% of these cells will have vector particles bound to their surfaces within a few minutes in the presence of the novel uniform magnetic field; more vectors adherence leads to a greater probability of cellular uptake, and transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [46].

In Vitro Transfection

Because PEI-SPIO-NPs are endowed with promising attributes such as pDNA condensation ability and high cell viability, we next used it as a gene carrier to determine the role of novel uniform and non-uniform magnetic fields on transfection efficiency. To evaluate the effectiveness of magnetofection, we selected the MG-63 osteosarcoma cell line as target cells and used GFP-pDNA as the reporter gene.

GFP expression was observed by inverted fluorescence microscopy at 24 h post-transfection. Figure 7a shows that the PEI-SPIO-NPs/pDNA group yielded significantly higher transfection efficiencies than the PEI-NPs/pDNA group in the presence of the uniform or non-uniform magnetic field, which is obvious in the uniform magnetic field group (P < 0.05), the transfection efficiency of the uniform magnetic field group was 42.1%, which is roughly two times higher than that of the non-uniform magnetic field group. Although PolyMag-200/pDNA showed high transfection efficiency and has been confirmed to transfect most adherent cell lines, it is also highly cytotoxic. The cells were collected for flow cytometry at 48 h post-transfection (Fig. 7b), and the statistical analysis results were in agreement with the findings from fluorescence microscopy (Fig. 7c).

The mechanism underlying the increase in transfection efficiency by magnetofection is currently unclear. Previous studies have demonstrated that magnetofection does not involve magnetic nanoparticles being pulled directly into the cells by the magnetic field, magnetic nanoparticles enter cells via endocytosis and remain intact upon cellular uptake [47]. The observed significant increase in transfection efficiency may be due to the synergistic effect of accelerated sedimentation and fast internalization [48, 49]. The number of magnetic complexes that enter each cell apparently influences pDNA content. Although genes must still escape endosomes before transcription, transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [50], branched PEIs showed a higher uptake rate. However, once inside the cell, lysosomal escape becomes the key to transfection, especially with higher N/P ratios, and linear PEIs showed higher rates of lysosomal escape [51,52,53]. Because of the magnetic force, PEI-SPIO-NPs can quickly come in close contact with cell membranes, which to some extent, increases the uptake capability of complexes. Once the complexes are inside the cell, PEIs provide a structural advantage and facilitate timely release of pDNA, which is eventually expressed by the cells.

結論

The novel magnetic field generator has been developed to induced a uniform magnetic field, in which the PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes are rapidly and uniformly distributed on the surface of MG-63 osteoblasts, thereby averting local transfection and decreasing disruption of the membrane caused by centralization of positively charged PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, ultimately resulting in an increase in the effective coverage of the magnetic gene carriers during transfection, and improving magnetofection efficiency. This innovative uniform magnetic field could be used to determine the optimal amount of PEI-SPIO-NPs and pDNA, and screen for the optimal formulation design of a magnetic gene carrier under homogeneous conditions. Most importantly, the novel uniform magnetic field facilitates the transfection of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes into osteoblasts, which provides a novel approach for the targeted delivery of therapeutic genes to osteosarcoma tissues and serves as a reference for the treatment of other tumors. However, a series of comprehensive studies are warranted to establish the therapeutic potential of PEI-SPIO-NPs that are integrated into a novel uniform magnetic field in combating osteosarcoma.

略語

AFM：: 原子間力顕微鏡
CLSM:: Confocal laser scanning microscopy
DLS：: 動的光散乱
DMEM：: ダルベッコの改良イーグル培地
EDC：: 1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide
FBS：: ウシ胎児血清
GFP：: Green fluorescent protein
ICP-OES：: Inductively coupled plasma optical emission spectrometer
MF:: Magnetic field
MG-63:: Human osteoblasts
MRI：: 磁気共鳴画像法
MWCO:: Molecular weight cut off
NHS:: N -hydroxy succinimide
PBS：: リン酸緩衝生理食塩水
pDNA:: Plasmid DNA
PEI：: ポリエチレンイミン
PEI-NPs:: Polyethylenimine nanoparticles
PEI-SPIO-NPs:: Polyethylenimine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles
RBITC:: ローダミンBイソチオシアネート
SPIO-NPs:: Superparamagnetic iron oxide nanoparticles
TEM：: 透過型電子顕微鏡
VSM：: 振動試料型磁力計

静電容量が強化されたスーパーキャパシタ電極用の原子層堆積によって製造されたTiO2ナノメンブレン触媒作用およびSERS用途のための大規模樹枝状銀ナノ構造の形態制御された製造

ナノマテリアル