革新的メトトレキサート-葉酸ナノ粒子療法：レーザー支援光熱アプローチで乳がん治療を強化

概要

低出力レーザー療法（LLLT）は腫瘍組織/細胞を標的とする安全な光療法として知られる。また、標的ナノ粒子使用はがん治療成功率を高める。本研究は、葉酸（FA）/メトトレキサート（MTX）担持シリカ被覆金（Au@SiO₂）ナノ粒子（NPs）とLLLTの併用効果を乳がん治療で検証することを目的とした。

NPsを合成し、FTIR、TEM、DLS-ゼータで特性評価。NPsは球状形態、平均直径約25nm、正電荷（+13.3mV）を示し、FAとMTX共役後は正味電荷約-19.7mVに低下。

細胞取り込み研究で、FAとMTX担持NPsで両乳がん細胞株、特にMDA-MB-231（葉酸受容体高発現）への細胞取り込み増強が明確に示された。MTT法（p<0.05）、DAPI染色、細胞周期解析で、LLLT単独では両細胞株に増殖効果あったが、設計乳がん標的ナノ粒子存在下で化学-光熱併用療法効果が有意に増強された。MTX-FA担持Au@SiO₂ NPとLLLT併用曝露群で、DAPI染色と細胞周期（subG0/G1期停止増加）で最高アポトーシス効果観察。総合すると、化学療法とLLLT併用が最小副作用で乳がん治療可能性を向上させる。

はじめに

乳がん（BC）は女性で最も頻度高いがん、最近世界で170万新規症例報告[1]。複雑な病因と治療反応不良により、女性がん関連死の中心的原因とされる[2-5]。2014年米国で約40,000女性がBCで死亡予測[2, 6, 7]「(www.cancer.org)」。全体で522,000死亡、がん死因第5位、発展途上国約800,000症例、先進国も同程度頻度[1]。アジア諸国では発症ピークが40-50歳代、欧米では60-70歳代[8]。主要リスク因子：女性、家族歴、年齢、初産30歳以上、早発月経・晩発閉経、未産[9]。

がん闘争の主目標は、低毒性・高特異性で腫瘍（主に転移）排除、再発予防の効果的治療計画開発。しかし現在用いられる手術、化学療法、放射線療法は様々な副作用[10-12]あり、目標達成できず[13, 14]。

過去数十年、がん治療で大きな進歩[15, 16]。現在の人気治療法中、熱療法が有望治療法として台頭[17]。最近、光熱療法（PTT）が潜在的効果的・非侵襲的がん療法として注目[18, 19]。光吸収ナノ構造ベースPTTは一般的手法と異なるアプローチ[20, 21]。典型PTTでは、PTT剤を用い、レーザー照射（近赤外（NIR）光、700-1100nm）下で十分高熱（42℃）取得し腫瘍破壊、高精度・最小侵襲がん治療法として研究[22-28]。

多数ナノ粒子がイメージング造影剤、薬物送達キャリア、レーザー・電波・超音波などエネルギー様式を熱現象に変換するトランスデューサーとして広く研究[29-39]。

金ナノ粒子は高い局在表面プラズモン共鳴（LSPR）と生体分子との容易な表面共役により過去10年で大きな注目[40]。NIR領域で高性能光熱変換能示し[41-43]、生物系で有害副作用なし[44]。

金ナノ粒子は有望光熱変換剤と認識されるが、反復NIR照射で光熱安定性低く、徐々に光熱変換能喪失、臨床応用限定[45, 46]。また、薬物担持容量低く制御放出プロファイル不良で良い薬物キャリアでもない[45, 46]。一方、メソポーラスシリカナノ粒子（MSN）は高薬物担持能力、分解生成物無毒性で適切な薬物・DNA・蛋白質キャリア[47]。大きな表面積、制御可能サイズ、高利用可能細孔体積、修飾適した表面特徴有す。

ナノ粒子を化学療法薬とがん標的リガンドに共役させると、非特異的送達、低水溶性、低治療指数など日常化学療法欠点克服可能[48, 49]。

ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ドセタキセルなど化学療法薬剤単独または併用で主軸治療、またはPTTなど他治療補助。大半がん患者が化学療法薬副作用経験、非精密分布で全臓器影響。速やかに増殖する正常細胞（血球、内臓粘膜細胞、毛包）損傷[50-53]。

メトトレキサート（MTX）は関節リウマチと皮膚、肺、頭頸部、乳がんなど複数腫瘍で最頻用薬剤[54, 55]。ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）阻害、テトラヒドロ葉酸と副産物生成関与酵素、チミジレートとプリン合成必要、両者細胞増殖・成長必須。DHFR阻害でMTXはDNA、RNA、チミジレート、タンパク質4基本巨大分子合成阻害[56]。

残念ながら、大半従来PTT剤同様、全身投与後標的組織へのGNPs選択的蓄積達成が主課題[57-59]。標的がん療法で化学療法薬を特定がん細胞に送達し正常健康細胞曝露減少。より高用量薬物をがん細胞に送達、全身毒性低減可能。リガンド標的ナノ粒子はがん細胞表面高発現マーカー精密同定[40]。

葉酸（フォレート、ビタミンB9）は細胞増殖・代謝重要物質。葉酸受容体タンパク質への高親和性によりがん標的要素として利用。葉酸受容体は腫瘍バイオマーカー、乳がん、卵巣、肺、腎、脳、大腸がんなど特定悪性細胞で過剰発現[60]。葉酸共役薬物送達システムはエンドサイトーシス経由で薬物細胞取り込み増強[61]。

材料と方法

試薬と材料

二重蒸留水（Ghazi Company、イランタブリーズ）と分析グレード化学試薬使用。多数試薬をSigma-Aldrichから購入：テトラエチルオルトシリケート（TEOS、98%）、(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン（MPTES、95%純度）、葉酸、ローダミンB。材料群をMerck Coから購入：塩酸（HCl、37%）、アンモニア水（25%）、トルエン、水酸化ナトリウム（NaOH、98%）、その他溶媒。MTXはZahravi Farma Company（イランタブリーズ）購入。

機器

粒子サイズと形態分析に透過型電子顕微鏡（TEM、LEO 906、ドイツ）使用。約100μLナノ粒子水懸濁液を室温調製。カーボン膜コート銅グリッド（TEM用）に移し凍結乾燥、80kV観察。粒子サイズ決定に動的光散乱（DLS）測定、25℃、Zetasizer Nano ZS90、Malvern Instruments、英国。調製NPsゼータ電位測定を光子相関分光法（Zetasizer-ZS、Malvern Instrument、英国）で実施。二重ビームUV-Vis分光光度計（UV-1601 PC、SHIMADZU、日本）で吸光度測定、700μL石英セル、光路長10mm。フーリエ変換赤外（FTIR）分光法、Bruker Tensor 27分光計（ドイツ）でKBrペレット法実施。pH測定にMetrohm 713 pHメーター（スイスヘリザウ）。機械攪拌にHeidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer（ドイツシュヴァーバッハ）使用。FAとMTX封入効率をHPLCシステムで算出：Waters 2690分離モジュール、UV-vis検出器Waters 2500 Pump 1000検出器（Waters、米国ミルフォード）。クロマトグラフィー分離を室温、C18 Bondapak（250mm×4.6mm、10μm、125Å、Waters、アイルランド）カラムで実施。

Au@SiO₂ナノ粒子調製

SiO₂ NPsを先行報告ゾルゲル法[62, 63]で合成。次にチオール機能性シリカ被覆ナノ粒子（TFSNPs）を先行研究法[64]で調製。Auナノ粒子をクエン酸還元法（Turkevich法）[65]で生成。最終的にTFSNPs表面をAuNPsで被覆。最初TFSNPsを水に分散（バスソニケーター≥1時間）、AuNPs溶液添加しさらに30分超音波。反応を暗所、25℃、動的攪拌下で2日間実施。紫色外観Au@SiO₂ナノ粒子を遠心分離（10,000rpm、10分）回収、真空オーブン乾燥。

MTXとFA担持

MTXとFAをAu@SiO₂ナノキャリアに担持：MTX（10mg）をPBS（5mg/mL、pH 7.4）中よく分散したナノキャリア懸濁液10mLに添加、室温暗所で1日間適度攪拌。MTX担持Au@SiO₂ナノキャリアを遠心分離回収。上清回収し未担持MTX測定。MTX担持Au@SiO₂ナノキャリアをPBS（5mg/mL、pH 7.4）分散、FA（10mg）添加し室温暗所でさらに1日間攪拌。FA-MTX担持Au@SiO₂ナノキャリアを遠心分離回収、上清分離し最終段階未結合FA算出。FA-MTX担持Au@SiO₂ナノキャリアを凍結乾燥し次実験用保存。未担持MTXとFA量を先行プロトコル[66]HPLC法で算出。葉酸を水酸化アンモニウム（10wt%）溶解し移動相で希釈。MTXと葉酸保持時間それぞれ10.5、5.95分。三重試験実施。薬物担持効率（DLE）を以下式で計算：

$$ ee(\%)=\frac{(初期総薬物量- 未吸着薬物量)}{初期総薬物量}\times 100 \quad (1) $$

細胞株選択と培養

報告済み葉酸受容体（FR）表面発現レベル[67]を持つ2乳がん細胞株MCF-7とMDA-MB-231を選択、パスツール細胞バンク（イランテヘラン）購入、細胞毒性調査用。選択細胞株を完全培地（RPMI1640（Thermoscientific）、10%胎児牛血清（FBS）、1%ペンストレップ（Thermoscientific））で37℃、5% CO₂、95%湿度条件下培養。

細胞細胞毒性アッセイ

レーザー照射なしで異なるNPs処理後細胞増殖測定のため細胞生存率アッセイ実施。簡潔：MCF-7またはMDA-MB-231細胞を96マイクロプレートに細胞密度1.5×10⁴で24時間播種、MTX、Au@SiO₂、FA-MTX担持Au@SiO₂ NPs処理。無処理細胞を対照。次にテトラゾリウム染料MTT（Sigma）最終濃度5μg/ml添加、37℃4時間培養。MTT溶液除去、沈殿フォルマザン結晶をジメチルスルホキシド（DMSO、BioIdea、イラン）で穏やか攪拌10分溶解。最終的にELISAリーダーで570nm吸光度測定。細胞生存率を対照細胞で正規化、ブランク測定減算で背景除去。

In vitroレーザー療法

低出力レーザー療法（LLLT）に810nm波長NIRレーザー（ダイオードレーザーMustang 2000、ロシア）、出力185mW使用、がん細胞破壊用。まずMCF-7とMDA-MB-231細胞（細胞密度1.5×10⁴）をAu@SiO₂とFA-MTX担持Au@SiO₂ NPs処理、異なるレーザー線量（30、60、75、90、105 J/cm²）照射、固定曝露時間（139秒）。NPsなしレーザーのみ曝露細胞と、NPs・レーザー両方なし細胞をそれぞれ陽性・陰性対照。レーザー照射24時間後MTT法で細胞生存率測定[64]。

ナノ粒子細胞取り込みアッセイ

表面修飾ナノキャリアの各細胞株特異的効果確認のため、NPs細胞内部化詳細確認必須。本研究でフローサイトメトリー（定量）と蛍光顕微鏡（定性）両方でMCF-7とMDA-MB-231細胞株NP取り込み確認。

NPs懸濁用にローダミンB（RhoD）PBS溶液添加、暗室（褪色防止）で室温24時間攪拌。RhoD担持NPsをAmiconフィルター（公称分子量制限NMWL 30kDa）分離、5000rpm 15分遠心、PBSバッファー洗浄で未結合RhoD除去。細胞をプレートに密度5×10⁵/ウェル播種、コンフルエンス到達待機。細胞をローダミンB標識NPsで30、90、180分処理、非処理細胞を対照。その後トリプシン化、PBS洗浄、フローサイトメトリー分析（BD Biosciences FCASCalibur、BD Biosciences、米国サンノゼ）で蛍光定量。ローダミンB標識NPまたはNPD細胞内取り込みを蛍光顕微鏡でさらに確認。MCF-7とMDA-MB-231細胞をカバースリップ上培養、24時間後フリーAu@SiO₂ NPsとMTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理。30、90、180分インキュベーション後、PBS洗浄、ローダミンB標識ナノキャリア取り込みを蛍光顕微鏡（Olympus Bh2-FCA、日本）観察。

蛍光顕微鏡によるアポトーシス研究

アポトーシス核質的研究法として、DNA結合蛍光染料DAPIを適切顕微鏡で検出。先行報告プロトコル[68]使用、簡潔：MCF-7またはMDA-MB-231細胞を6ウェル容器に密度5×10⁵播種、24時間付着・増殖待機。MTX、Au@SiO₂ NPs、MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理後、レーザー処理あり/なしでPBS（Sigma）洗浄、10%ホルマリン（Merck）固定、トリトンX-100（Sigma）15分透過化。適切洗浄後、DAPI（Sigma）5分染色。最終的にアポトーシス核（断片化・皺状）を蛍光顕微鏡（Olympus）可視化。無処理細胞を陰性対照、レーザーのみ照射細胞を陽性対照。

細胞周期攪乱調査

MCF-7とMDA-MB-231細胞周期分布をフローサイトメトリー解析で決定。細胞を初期個体数5×10⁵播種、80%コンフルエンス到達待機。MTX、Au@SiO₂ NPs、MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理、レーザー照射あり/なし実施。無処理細胞を陰性対照、レーザーのみ照射細胞を陽性対照。トリプシン化回収、適切PBS洗浄。エタノール（Merck）48時間固定。固定細胞洗浄、リボヌクレアーゼA（Cinaclone）処理、暗所でヨウ化プロピジウム（PI、Sigma）添加。蛍光信号をBeckton Dickinson Company FACSセット検出。

統計解析

各ステップ実験3反復実施、結果を平均±SD報告。群間有意差比較にANOVA使用。SPSSソフトで確率値<0.05計算で有意差反映。

結果と考察

合成NPs特性評価

Au@SiO₂ NPsは4ステップ生成：1-SiO₂ナノ粒子合成、2-SiO₂ NPsチオール含有リンカー添加、3-金ナノ粒子合成、4-金ナノ粒子SiO₂-リンカー複合体表面付着（図1）。Au@SiO₂合成成功をFTIR確認（図2a）。Si-O-Siピーク約1088cm⁻¹出現。3000-3700と803cm⁻¹広いピークはフリーシラノールO-H基伸縮と面外曲げ振動。脂肪族C-H伸縮振動が2950cm⁻¹強ピーク。3メトキシシラン基C-Oが1191cm⁻¹ピーク示す。

動的光散乱（DLS）測定でFA-MTX共役Au@SiO₂ NPsサイズはナノメートル範囲（105±2.3nm）、狭いサイズ分布（図2b）。

ゼータ電位はナノ懸濁液安定性に影響する重要物理化学パラメータ。極端に正/負ゼータ電位は大きな斥力原因。一方、粒子高電荷（正/負問わず）は肝臓食細胞吸収・体外排出原因。静電的・立体的安定化組合せでは最小±20mVゼータ電位望ましい[69-71]。pH=7.4、T=25℃でMTX-FA担持前後NPゼータ電位比較（図2c）。Au@SiO₂ NPs取得ゼータ電位+13.3mV、二重薬物担持後-19.7mVに低下、望ましい範囲内。MTXとFAはpH 7.4（pKa 3.8、4.8、3.5、4.3以上）で2カルボキシル基脱プロトン化により負正味電荷[72]、https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.。したがってMTXとFA同時担持で正味電荷負化、Au@SiO₂ NPsへの成功共役示唆。

TEM解析で明確個別粒子サイズ取得。Auナノ粒子が灰色ベッド層SiO₂ NPs上に暗い球体として分散観察。TEM画像でAu@SiO₂ NPsが均質球状形状合成、粒子平均サイズ約25nm確認（図3）。

薬物担持

葉酸は葉酸受容体過剰発現特定がん細胞タイプへGNPs取り込み増加媒介、受容体媒介エンドサイトーシスでGNPs内部化低効率克服、葉酸受容体を腫瘍マーカー、葉酸を腫瘍標的に増加利用[67, 73]。

MTXとFA分子Au@SiO₂ NPs共役後、ゼータ電位+13.3から-19.7mV変化。MTX 2カルボキシル基推定pKa 3.8、4.8、FA 3.5、4.3[72]、https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.。pH 7.4がpKa以上のためMTXとFA 2カルボキシル基脱プロトン化、正味電荷負化、MTXとFA Au@SiO₂ NPs成功共役示唆。De Ying Tianら報告：Auナノ粒子18、30mm径MTX担持各15±0.4%、10±1.0%[74]。本研究FAとMTXをAu@SiO₂ NPsに担持、封入効率各22.6%、77.5%。同時MTXとFA評価ピーククロマトグラム図2d。

細胞取り込み

細胞内光熱剤が光熱がん療法効率改善[75]ため、光熱材料細胞内部化必要と考えられる。ヒト乳がんMDA-MB-231細胞（葉酸受容体高過剰発現知る[40]）でin vitro細胞取り込み試験実施。FA標的剤役割と表面コーティング効率がAu@SiO₂ NPs標的細胞取り込みに及ぼす影響研究のため、MCF-7とMDA-MB-231細胞をAu@SiO₂ NPsとMTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理。平均蛍光強度結果を図4示す。結果：Au@SiO₂ NPs取り込みが全サンプルで両細胞株培養時間経過とともに増加（図4、5）。また、Au@SiO₂ NPsをMTXとFAで表面装飾後、葉酸受容体発現細胞として両MCF-7とMDA-MB-231で細胞取り込み有意増加。MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs MDA-MB-231細胞取り込みMCF-7より大。MDA-MB-231細胞表面葉酸受容体高発現ため、葉酸受容体標的NPs大部分受容体媒介エンドサイトーシス機構で内部化、細胞取り込み増加結果。別研究で葉酸共役NPs細胞内部化増加はaHFR過剰発現がん細胞のみ、aHFR低発現正常細胞では起こらない[40]。Au@SiO₂ NPsをFA共役化でNPsとメトトレキサート細胞取り込み促進、MDA-MB-231細胞へ毒性増強[76]。

細胞毒性アッセイ

フリーMTX、ブランクAu@SiO₂ NPs、MTX-FA共役Au@SiO₂ NPsのin vitro細胞細胞毒性をMTTアッセイで24、48、72時間評価（図6）。MTT結果：Au@SiO₂ NPsがMCF-7とMDA-MB-231細胞株に細胞毒性なし。さらに、フリーMTXとMTX-FA共役Au@SiO₂ NPs細胞毒性効果比較のため、同濃度MTX（25、50、100、200μg/mL）全処理時間使用。細胞毒性結果：フリーMTXまたはMTX-FA共役Au@SiO₂ NPsが両細胞株24時間後約10-25%死亡率示す。先行研究で金ナノ粒子がマウス骨芽細胞MC3T3-E1細胞とヒト歯周靭帯幹細胞でin vitro条件下増殖効果報告。本結果これら研究と一致、図6a、bにフリーAu@SiO₂ NPs増殖効果示す。したがってMTXとFA-MTX担持Au@SiO₂ナノ粒子（NPD）同等細胞毒性効果はこの現象起因可能性[77, 78]。

レーザー照射

本研究で、Au@SiO₂ NPsとMTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理MCF-7とMDA-MB-231細胞、30-105 J/cm²線量範囲レーザー照射後細胞生存率をMTTアッセイ調査。MTX濃度100μg/mL条件でMTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理MCF-7とMDA-MB-231細胞、LLLT 75 J/cm²線量後死亡率約39%、45.5%。同条件でAu@SiO₂ NPs+レーザー照射またはレーザー単独では明らかな細胞死観察せず。レーザー線量105 J/cm²増加で両細胞株死亡率60-75%増加、同照射線量でAu@SiO₂ NPs+レーザーまたはレーザー単独では細胞毒性なし。MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs（MTX用量100μg/mL）とLLLT併用療法IC50値、MCF-7とMDA-MB-231細胞それぞれ90、75 J/cm²で取得。一方、レーザー照射なしMTXとMTX-FA担持Au@SiO₂ NPs、MTX用量100μg/mL（レーザー療法研究選択用量）で両細胞株死亡率15-25%。これら結果、MTX-FA担持Au@SiO₂ NPsとレーザー療法併用が両細胞株で相乗効果示し、レーザーのみ照射細胞と比較し細胞生存率有意低下（p<0.001）示す。NPs治療、特に標的戦略が乳がん細胞破壊レーザー療法効能改善示唆（図7）。

DAPIによるアポトーシス研究

MCF-7とMDA-MB-231細胞で、Au@SiO₂ NPs、MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理、レーザーあり/なし後アポトーシス研究、レーザー治療化学療法効能増強可能か検証。結果図8要約：無処理正常MCF-7とMDA-MB-231細胞対照、レーザー単独またはフリーAu@SiO₂ NPsレーザーなし処理細胞は典型的核、アポトーシスなし。しかし、フリーMTX、レーザー照射Au@SiO₂ NPs、レーザーなしMTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理細胞は部分的アポトーシス核示す（図8）。MTX-FA担持Au@SiO₂ NPsとレーザー照射併用（810nm、75 J/cm²、139秒）処理細胞でMCF-7とMDA-MB-231細胞個体数大幅減少。したがってMTX/FA担持Au@SiO₂ NPs取り込み後レーザー照射効能増強。新規開発MTX-FA担持Au@SiO₂ NPsが高度断片化核、細胞損失急増、細胞完全破壊で光熱効果増強能力有す。

細胞周期

MTX、Au@SiO₂ NPs、MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs処理、LLLT（75 J/cm²）併用あり/なし後、MCF-7とMDA-MB-231両細胞株でフローサイトメトリーとPI DNA染色で細胞周期分布研究。非処理細胞（対照群）が活発にS期（図9a、b）。75 J/cm²レーザー治療でS期細胞割合非有意減少。一方、NP・薬物処理なしLLLT単独照射細胞でG0/G1期細胞個体数有意増加、LLLT単独安全性示唆。NPs処理も両細胞株細胞周期攪乱なし。フリーMTX処理、レーザーあり/なしでS期細胞減少含む細胞周期攪乱示す。NPD単独でS期細胞減少。興味深く、MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs（NPD）でsub G0/G1期細胞割合増強、アポトーシス兆候[72]。MDA-MB-231細胞sub G0/G1期割合（約18%）がMCF-7細胞（12%）より有意高い、MDA-MB-231細胞NP取り込み高いため。

Ramosら報告：腫瘍細胞でLLLTがS期とG2/M期細胞割合増加、増殖減少と老化増強検出[79]。LLLT（15 J/cm²）後細胞周期研究でG1期停止示し、照射TK6細胞増殖停止と一致[80]。別グループ報告：PTT主にS期細胞攪乱、G2/M期細胞個体数増加と停止[81]。結果PTTが細胞周期攪乱で細胞放射線感受性誘導可能[82]。これら結果本研究と一致、細胞周期攪乱とS期細胞減少示す。本研究も化学-光熱併用療法後アポトーシス細胞個体数（sub G0/G1）増加示す。したがって、LLLTと乳がん標的ナノ粒子MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs（NPD）併用適用で乳がん治療効能増強可能。

結論

本研究でMTX-FA担持Au@SiO₂ NPsを非侵襲的、FDA承認レーザー療法LLLT併用標的乳がん療法向け設計。球状形態、平均直径25nm、表面電荷-19.7mV MTX-FA担持Au@SiO₂ NPs取得。このサイズと表面電荷はNP生体分布増加適正範囲。新規開発NPs成功標的戦略、異なる葉酸受容体発現2乳がん細胞株でMDA-MB-231細胞取り込み率MCF-7より高いことで承認。MTTアッセイ、DAPI染色、細胞周期研究結果、化学-光熱併用療法相乗効果示し、両乳がん細胞株特にMDA-MB-231細胞で細胞毒性とアポトーシス効果有意増加（p<0.001）。Au@SiO₂ナノ粒子またはLLLT単独細胞毒性なしため、治療設計が標的部位で相乗効果有すと結論。本研究知見、バイオ化学療法と低出力レーザー併用による将来がん治療プログラム設計に有用。