胃壁細胞および腸杯細胞分泌：中国のハーブを介して下痢で増強された新しい細胞媒介invivo金属ナノ粒子代謝経路

はじめに

ナノテクノロジーとその応用の急速な発展に伴い、多種多様な工学的ナノ構造材料が現在、医薬品、生物医学製品、およびその他の産業で使用されています。新たなナノテクノロジー製品は、将来の経済成長と発展に大きな可能性を秘めていますが、環境と人間の健康に対するナノテクノロジーのリスクはまだ完全には理解されていません。ナノ粒子が人体に与える影響、生物学的システムとの相互作用、および潜在的なリスク評価を調査するために、ナノ毒性学は1つの新しい学際的な主題と見なされ、政府や科学者の注目を集め、ナノ材料のバイオセーフティを鍵として確立しています。科学的な問題。現在まで、多くの報告がナノ粒子とヒト細胞間の相互作用と密接に関連しています。たとえば、グラフェンオキシド、ゴールドナノクラスター、カーボンドットなどの一部のナノ粒子は、細胞質または細胞核に侵入し、細胞周期の停止または細胞アポトーシス、肺肉芽腫の形成を誘発し、一部のサイトカインの免疫学的細胞分泌を刺激します[1,2、 3]。

新しい分子イメージング技術の開発に伴い、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、磁性ナノ粒子、量子ドットなどの金属ナノ粒子が多機能治療試薬として活発に研究されており、生体内標的イメージング、磁気誘導加熱、光熱または光力学療法、または他のアプリケーションの中でも、高効率の薬物送達システムとして。これらの金属ナノ粒子ベースの多機能ナノプローブは腫瘍部位に位置し、それらの一部は肝臓および脾臓組織にも位置し、腎臓、肺、および脳組織全体に分布する可能性があることが観察されています[4、5、6、 7,8,9,10]。腎臓は直径5nm未満のナノ粒子しか除去しないため、ほとんどのナノ粒子をこの方法で除去することは非常に困難です[11、12]。したがって、生体内の金属ナノ粒子をどのように洗浄するかは、1つの挑戦的な重要な科学的問題になっています。しかし、今日まで、人体から金属ナノ粒子を除去するための説得力のある代替経路や詳細なメカニズムはありません。したがって、生体内で金属ナノ粒子をどのように洗浄するかが私たちの関心事になっています。

現在まで、金属ナノ粒子は主に静脈内、経口、腹腔内経路などの3つの経路で生物に導入されましたが、全身に急速に分布するため、静脈内注射が最も一般的な方法です[4、13、14]。 。しかし、生物によるこれらのタイプのナノ粒子の金属コアの分解は、可能であれば非常に困難であり、主要な問題、つまり残留ナノ粒子の蓄積の影響につながります。インビボ金属ナノ粒子の品質は、ナノ粒子によって誘発される生物活性と望ましくない毒性との間のバランスによって決定されることに注意する必要があります。毒物学的観点から、十分な量のナノ粒子が標的部位にある場合にのみ毒性効果が引き起こされ、生物からの排泄は、細胞および組織にある過剰な量のナノ粒子の影響を止める最良の方法です。したがって、それらのクリアランス経路を適切に理解することは、あらゆる医療用途および包括的なリスク評価にとって非常に重要です。

腎臓、肝臓、肺などの生体内組織または臓器からのナノ粒子のクリアランスに関連するいくつかの研究があります[15、16、17]。しかし、これらの実験は、全身ではなく単一の臓器から粒子を除去するためのクリアランスメカニズムに関する情報を提供するだけです[18]。全身のinvivoクリアランスに関しては、静脈内注射されたナノ粒子の2つの主要な排泄経路、すなわち、肝胆道系（HBS）-いくつかのタイプの磁性ナノ粒子のように生物によって生分解されないより大きなナノ構造の糞便経路が報告されています[19、20]、および量子ドット、フラーレン、金ナノクラスター、および直径5nm未満の他のタイプの金ナノ粒子などの小さなサイズのナノ粒子の腎臓-尿経路[16、21、22]。ただし、これら2つの経路は、invivo金属ナノ粒子のクリアランス速度が限られていることを示しています。

Souris etal。シリカナノ粒子が高濃度で腸壁に蓄積し、肝臓にある50〜100nmのシリカナノ粒子の静脈内注射の濃度が腸壁および糞便の濃度よりもはるかに低いことを実証しました[20]。別の研究では、修飾に関係なく500 nmの大きさのナノ粒子を魚の体から除去でき、500 nmの粒子の除去速度は、50 nmの粒子よりも速く、効率的であることが示されました。 HBSの[23]。これらのデータは、HBS経路がin vivoナノ粒子の主要な排泄経路ではない可能性があり、invivoナノ粒子には他の排泄経路が存在する可能性があることを示しています。

腸杯細胞（GC）は、腸管全体に存在する高度に分極した排泄細胞です。これらの特殊な上皮細胞は、いくつかのメディエーターを合成して分泌することにより、腸内で重要な保護的役割を果たすと考えられています[24、25、26]。王ら。杯細胞（GC）がナノ粒子を取り込むことができると報告しました[27]、およびSun etal。静脈内注射されたナノ粒子が腸のGCに分布していることを発見しました[28]。それにもかかわらず、最新の状態では、ナノ粒子と腸のGCとの間の相互作用はまだ詳細に調査されていません。具体的には、これらのナノ粒子がどのようにGC細胞に入ることができるか、およびそれらのナノ粒子が腸組織全体のGCに分布するかどうかを完全に明らかにする報告はありません。金属ナノ粒子の腸組織への排泄経路を明らかにするには、このナノ粒子の新しい排泄経路において腸のGCがどのような役割を果たしているかを解明することが重要です。金属ナノ粒子はHBSを介して排泄され、腸に入る可能性があるため、HBSを介した排泄と腸のGCを介した排泄を区別することに重点を置いています（スキーム1）。

ナノ粒子の腸GC排泄経路

本研究では、磁性ナノ粒子、銀三角ナノ粒子、金ナノクラスター、金ナノロッドの4種類の一般的な金属ナノ粒子を研究対象として選択しました。金ナノロッドの特徴的な光学特性のおかげで、2光子励起によってナノ粒子の腸内分布を観察するツールとして機能しましたが、他の3種類の粒子は他のさまざまな金属ナノ材料の代表的な例として機能しました。マウスモデルは、HBSと腸管の間の接続を防ぐために総胆管の結紮で準備されました。金属ナノ粒子を尾静脈からマウスに注入した後、ヌードマウスを飼育し、糞便を7日間採取し、最終的に動物を犠牲にして、腸管組織と胃組織を採取し、スライスして準備し、最後に分析しました。高分解能透過検電器とICP-MSを使用して、腸組織内の金属ナノ粒子の分布を調査します。さらに、金属ナノ粒子の存在は、CBDライゲーションを行ったマウスの糞便で測定されました。さらに、この研究では、GCとPCのナノ粒子分泌メカニズムをさらに明らかにするために、中国のハーブを介して誘発された最近開発されたマウスの下痢モデルを使用しました。

材料と方法

三角形の銀ナノプレートの合成と特性評価

三角形の銀ナノプレートは、Mirkin [29]と同僚によって以前にいくつかの変更を加えて説明された手順[30]を介して合成されました。室温で空気を使った典型的な実験では、AgNO ₃ （0.1 mM、100 mL）、クエン酸三ナトリウム（30 mM、6 mL）、PVP（30 kDa分子量、0.7 mM、6 mL）、および240μLH ₂ O ₂ （30 wt％）を250mLフラスコに整然と加えました。フラスコ内で合わせた溶液を激しく振とうした後、0.1 M NaBH ₄ の新たに調製した溶液0.8mL 急速に注射されました。数秒以内に、溶液の色が黄色に変わり、銀ナノスフェアの生成を示しました。次の数時間で、溶液がそれ以上色を変えずに（最大5時間）青色に変わるまで、フラスコを日光または蛍光灯の下に置いた。そして、最終的な溶液は、さらに使用するために4°Cの冷蔵庫に保管されました。

調製した溶液の吸光度スペクトルを、1cmの光路キュベットを使用してUV-vis-NIR分光計（UV-3600、島津製作所、日本）で測定した。スペクトルは、2 nmのスリットを使用して200〜950nmの範囲で収集されました。透過型電子顕微鏡による分析は、JEM-200CX（JEOL、日本）で、1.5mLのマイクロ遠心チューブで合計10mLの溶液を遠心分離した後、1mLの脱イオン水中の収集ナノ粒子にカーボンコーティングされた銅TEMグリッドを浸すことによって実行されました。 6000rpmで30分、25°Cで。 TEM画像から合計200個の三角形の銀ナノプレートを選択して、それらのエッジサイズの分布を統計的に計算しました。

超常磁性マグネタイト（Fe ₃ O ₄ ）ナノ粒子、金ナノクラスター、および金ナノロッドは、以前のレポート[31、32、33]に従って合成および特性評価され、室温で保存されました。

総胆管の結紮を伴う動物モデルの準備

健康な雌のウィスターラット（180–220 g）と雌の失礼なマウス（20–22 g）は、Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd.（上海、中国）から入手しました。すべての動物実験は、関連する法律および制度上のガイドラインに従って実施されました。すべての動物実験は、上海交通大学の施設内動物管理使用委員会（NO.SYXK2007-0025）によって承認されました。総胆管は、Leeによって最初に記述された方法にいくつかの変更を加えて結紮されました[34]。簡単に説明すると、これらのマウスをペントバルビタール（25 mg / kg）で麻酔し、木製の手術用シートに固定しました。腹部中央部を切開し、腹部組織を注意深く分離して、CBDを明確に露出させました。直径0.2mmの2本の滅菌ナイロン製医療用外科用縫合糸（Shanghai Jinhuan Industry CO。、Ltd.、Shanghai、China）をCBDの下に通し、CBDのセグメントの両端に3つのノードを作成しました（図。 1b、c）。最後に、CBDは両端の間で切断され、腹部が最後に閉じられました。総胆管結紮後14日目に、主要な肝機能をテストするために各マウスから血液サンプルを採取しました。

三角形の銀ナノプレートの特性評価。 a 調製した溶液のUV-visスペクトル。 b 遠心分離後に集められた銀ナノ粒子のTEM画像。 c 選択した三角形の銀ナノプレートのサイズ分布（TEM画像から200ナノ粒子）

マウスへのナノ粒子の注入

CBDライゲーションを終了した後、12匹のマウスをランダムに4つのグループに分けました：コントロールグループ1、銀ナノプレートテストグループ、磁性ナノ粒子テストグループ、および金ナノクラスターテストグループ。追加の対照群は、CBDライゲーションのない5匹のマウスで構成されていました。対照群のマウスは0.9％NaCl水溶液の静脈内注射で治療され、試験群は三角形の銀ナノプレート、磁性ナノ粒子、金ナノロッド、金ナノクラスターなどのナノ粒子懸濁液を150μLの用量で注射されました（ 550μg/ mL）。ナノ粒子の4つの懸濁液はすべて、使用前に1分間の超音波処理によって新たに分散させました。筋緊張が弛緩するまで5％イソフルランを吸入してマウスを麻酔した後、1mLの注射器を使用して4種類のナノ粒子懸濁液をそれぞれ静脈内注射しました。

組織内のナノ粒子の分布

金属ナノ粒子懸濁液の注射後7日目に、マウスに麻酔をかけ、腸組織を取り出し、10％ホルムアルデヒドで24時間固定し、パラフィン包埋しました。ライカRM2135ロータリーミクロトームを使用して、固定サンプルの厚さ5μmの切片を作成しました。最後に、切片をアルコールで脱水し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。サンプルの切片を位相差顕微鏡（オリンパス、RX-71、日本）で観察しました。

金属ナノ粒子懸濁液の注射後7日目に、マウスを怖がらせた直後に腸組織および胃組織を収集し、2.5％グルタルアルデヒド溶液で固定した。固定されたサンプルはエタノール中で連続的に脱水素化され、エポキシ樹脂で埋め込まれました。その後、極薄の腸標本を作成し、高分解能TEM（FEI、Tecnai G2 Spirit Biotwin、米国）で観察しました。

その同じ日に、犠牲の直後にそれらの腸組織を収集し、低温電荷結合装置（CCD）カメラおよび赤色蛍光タンパク質と組み合わせたインビボ画像化システム（IVIS-100画像化システム、キャリパー）を使用して画像化した。 （DsRed）フィルター（Caliper LifeSciences）。蛍光シグナルの画像と測定値は、Living Image 3.2ソフトウェア（Caliper Life Sciences）によって取得および分析されました。

糞便の金属含有量

さらに、注射後7日以内にすべてのマウスの糞便を採取し、その糞便の重さを量り、加熱しながら王水で消化しました。最後に、溶液中の金属の精神的含有量はICP-MS（Agilent 7500a、米国）によって決定されました。

中国のハーブ抽出物の調製

センナの葉10g、ルバーブ2 g、果物大麻抽出物1gを100mLの水に加え、100°Cで10分間加熱した後、2層のガーゼでろ過しました[35]。最後に、ろ液を回収し、減圧下で0.3 g / mLに濃縮しました。センナの葉の抽出物は以下のように調製され、試験が行われる前に4℃で保存されました。

杯細胞分析

まず、6匹の雄の昆明マウスをランダムに2つのグループに分けました。対照グループと下痢グループです。両方とも、生理食塩水と中国のハーブ抽出物で、それぞれ強制経口投与（0.1 mL）を介して7日間毎日処理されました。強制経口投与の7日後、マウスを犠牲にし、腸組織を収集し、腸および胃の組織をTissue Tek OCTで凍結し、Leica CM 1510 Sクリオスタット（Sakura Funetek、USA）で切片化しました。 8μmの切片をアルシアンブルー（3％氷酢酸中の1％アルカインブルー8GX）で5分間染色し、最後に蒸留水ですすいだ。このサンプルは、洗浄前に1％過ヨウ素酸で酸化され、シフ試薬で15分間処理されました。組織切片の画像は、倒立顕微鏡を使用して記録されました。胃組織は、2光子発光イメージングのために正に帯電したスライド上に収集されました。

腸の組織と糞便の金の含有量

簡単に説明すると、9匹の雄昆明マウスを異なる治療法に従って3つのグループのそれぞれに分けました：対照群、結紮群、および結紮+下痢群。次に、これらのマウスに100μLのGNR（1 mg / mL）を静脈内注射しました。尾静脈注射の2日後、対照群と結紮群を生理食塩水で処理し、同時に結紮+下痢群を中国のハーブ抽出物で処理しました。治療の用量は一定に保たれ、経口強制経口投与（0.1 mL）を介して次の7日間毎日提供されました。 7日目にマウスを犠牲にし、腸組織をTissue Tek OCTで凍結し、Leica CM 1510 Sクリオスタット（Sakura Funetek、USA）で切片化しました。切片（8μm）は、2光子発光イメージングのために正に帯電したスライド上に収集されました。注射後、すべてのマウスの糞便を収集した。糞便の重さを量り、加熱しながら王水で消化した。最後に、ソリューションのゴールドメンタルコンテンツはICP-MS（Agilent 7500a、米国）によって決定されました。

統計分析

各実験を3回繰り返した。結果は平均±SDとして表されました。 t を使用して統計的差異を評価しました P でテストおよび検討 <0.05。

結果と考察

ナノ粒子の合成と特性評価

三角形の銀ナノプレートは、迅速な熱合成法によって合成され、良好な水溶性を示しました。さらに重要なことに、これらのナノ粒子の特定の三角形の形状により、電子顕微鏡による識別が容易になります。図1に示すように、UV-visスペクトルでは、調製された銀ナノ粒子は、面内双極子表面プラズモンバンドに対応する648.5 nmで強いピークを示し、面内（482 nm）および面外（333 nm）四重極共鳴は、三角形構造の形成を示します[36]。これは、遠心分離後に収集された銀ナノ粒子のTEM画像によってさらに検証されます。 TEM画像（図1b）は、準備されたバッチに銀ナノスフェアのサブポピュレーションが含まれていることを示しており、389nmでのSPRピークに寄与している可能性があります[36]。集められた三角形の銀ナノプレートのエッジの長さは44.3nmで、単分散の分布が良好でした。

直径20nmの磁性ナノ粒子と直径5nmのAuナノクラスターを準備しました。それらの特性は、それぞれ追加ファイル1：図S1とS2に示されています。 AuナノロッドのTEM画像とUV / visスペクトルは、追加ファイル1：図S3に示されています。

CBDライゲーションマウスモデルの準備

総胆管（CBD）結紮は、肝胆汁うっ滞性線維症を誘発するために使用されるよく知られた実験モデルです[37、38]。ここでは、HBSと腸管の間の接続を完全にブロックするために、CBDライゲーションを使用したマウスで実験を行い（図2a、b）、静脈内注射後に金属ナノプレートが血流によってのみ腸組織に輸送されることを確認しました。正常な対照と比較して、治療群は、胆汁うっ滞のために、CBD結紮の14日後に総胆管壁の直径と厚さの強い増加を示しました（図2d）。さらに、図2eに示すように、ライゲーショングループのTBILとASTのレベルは、コントラストグループよりも有意に高かった。これらの結果は、CBD結紮マウスモデルの構築に成功した後、総胆管が完全に遮断され、HBSと腸管の間の接続が完全に切断され、胆汁うっ滞と肝胆汁うっ滞性線維症を誘発したことを示唆しました[39]。

a HBSと腸管との関係の概略図。 b、c CBDのライゲーション（白い矢印）。 d CBDライゲーション後14日目のCBD腫れ（白い矢印）。 e 主要な肝機能の検査。 * P <0.05

4種類のナノ粒子が腸組織に及ぼす影響

通常、腸上皮は半透性のバリアを提供し、能動的および受動的メカニズムの両方によって、異なるサイズおよび特性の少量の分子が無傷の上皮を通過できるようにします。一般に、分子が大きいほど、この障壁を越える可能性は低くなります。しかし、腸の内壁が炎症を起こしたり損傷したりすると、細胞間のスペースが開くため、腸上皮が異物や大きな粒子を防ぐことがより困難になります[40、41]。ナノ粒子が腸組織の病理学的変化の原因であり、その結果、ナノ粒子が腸壁を通過する腸壁の透過性が増加する可能性があることを考慮して、ナノ粒子に曝露した後の腸組織の組織病理学的検査を実施しました。 4つの異なるタイプのナノ粒子：磁性ナノ粒子、銀三角形ナノ粒子、金ナノロッド、および金ナノクラスター。図3に示すように、対照群と試験群の間に有意差は観察されず、炎症性浸潤などの他の組織学的変化もありませんでした[42]。結果は、これらの金属ナノ粒子が腸組織の病理学的変化を引き起こさなかったことを示しており、したがって、ナノ粒子が細胞間の空間から漏れる可能性を排除しています。

CBDライゲーションを行ったマウスのさまざまな腸組織サンプルの組織病理学的マイクロセクション。 a 対照群：尾静脈を介した生理食塩水注射で治療されたマウス（上のパネル）。 b テストグループ：尾静脈から注射された三角形の銀ナノプレート懸濁液で治療されたマウス（下のパネル）

腸のGCにおける金属ナノ粒子の分布

GCは、腸管全体に存在する4つの主要な細胞タイプの1つであり、腸内容物の除去を促進するムチンと呼ばれる高分子糖タンパク質を合成および分泌することにより、保護粘液ブランケットの生成と保存を担っています。摂取した食物、微生物、および微生物産物によって引き起こされる物理的および化学的損傷に対する最初の防衛線を提供します[43、44]。 GCは、粘液含有量が多いため、簡単に識別できました。図6に示すように、三角形の銀ナノプレートは腸管全体の腸GC内に配置されており、GCからの分泌のさまざまな段階を取得できました。図4dは、いくつかの三角形の銀ナノプレートがGCによってどのように腸に分泌されたかを示しています。図4eは、腸のGCの粘液内容物にカプセル化されたいくつかの三角形の銀ナノプレートが分泌される準備ができていることを示しています。図4fには、一部の三角形の銀ナノプレートがGCから排出され、他のプレートはまだその中にあることが示されています。 TEM画像から、いくつかの三角形の銀ナノプレートが凝集モード（図4（a2、d、e）、緑色の矢印）で示され、他の三角形の銀ナノプレートは分散モード（図4（a1、b1））で示されていることがわかりました。 b2、c1、c2およびf）、白い矢印）。凝集はナノ粒子の一般的な現象であり、細胞内でそれらの濃度が大幅に増加したときに一般的に観察されます[45]。逆に、ナノ粒子の濃度を下げると、ナノ粒子の凝集が妨げられます。

CBDライゲーションを行ったマウスの腸GCにおける三角形の銀ナノプレートの分布。 CBD結紮マウスグループは、結紮の7日後に尾静脈から注射された三角形の銀ナノプレートで治療されました。さまざまな腸組織の腸GC。 A 十二指腸の三角形の銀ナノプレートは凝集モード（緑色の矢印）で示され、一部の三角形のスライバーナノプレートは分散モード（白い矢印）で示されました。 B 空腸、腸のGCにある三角形の銀ナノプレート（白い矢印）。 C 回腸といくつかの三角形の銀ナノプレートが排泄されましたが、いくつかはまだ中にありました。 D 結腸、いくつかの三角形の銀ナノプレートが腸内に分泌されました。 E 、 F 直腸、いくつかの三角形の銀ナノプレートは排泄する準備ができていましたが（分散モード、白い矢印）、他のプレートはまだ中にありました（凝集モード、白い矢印）

追加ファイル1：図S4、S5、およびS6に示すように、金ナノクラスター、磁性ナノ粒子、および金ナノロッドについても同様の結果が観察されました。これらの結果は、これら3種類の金属ナノ粒子が腸管のGC内にあることを明確に示しており、これらの金属ナノ粒子がGC経路によって除去される可能性があることを間接的に裏付けています。

GCは腸管の全線に沿って分布していますが、総上皮体積へのGCの寄与は同じではありません。マウスの小腸では、GCの体積密度は十二指腸から回腸に向かって徐々に増加します。この傾向は大腸でも続き、結腸上皮のGCの密度も近位から遠位、結腸から直腸に向かって増加します[43]。三角銀ナノプレート、磁性ナノ粒子、および金ナノクラスターが腸管全体の腸GCに存在し、総上皮体積に対するGCの寄与がまったく異なるという事実に基づいて、大腸が主である可能性があると考えています。腸のGC排泄経路の排泄場所。

それらの特徴的な形状のために、三角形の銀ナノプレートは、GCに到達するための提案された経路に記載されている場所でのTEMイメージングによって容易に区別されました。ただし、この手法を使用して磁性ナノ粒子と金ナノクラスターを他の構造と区別することはできませんでしたが、追加ファイル1：図S4は、CBDライゲーショングループの腸管に一定量の金ナノクラスターが残っていることを示しています。上記のGC排出メカニズムは、他の種類の金属ナノ粒子にも適用されるという結論。

さらに、追加ファイル1：図S7に示すように、ICP-MSの結果は、これらのナノ粒子がまだライゲーションマウスの体から分泌される可能性があることを明確に示しています。これらの結果は、腸組織の杯細胞がナノ粒子の排泄のための重要な経路に関与していることを証明しました。

腸の血管における金属ナノ粒子の輸送の潜在的なメカニズム

上記の結果は、これらの4種類の金属ナノ粒子（磁性ナノ粒子、銀三角形ナノ粒子、金ナノロッド、および金ナノクラスター）が腸管全体のGCに分布していたが、ナノ粒子がGCに入る方法はまだそうではなかったことを示しています。解明された。 CBDライゲーションを備えたマウスモデルは、尾静脈注射を介して金属ナノ粒子の懸濁液で処理されたため、これらのナノ粒子は、血流によって腸血管に輸送されることしかできませんでした。 TEMイメージングで明らかになったように、いくつかの三角形の銀ナノプレートが実際に血液小体に配置されていました（図5a、白い矢印）。さらに、以前の研究では、小さなサイズのナノ粒子が循環器系全体の血液小体によって送達される可能性があることが明らかになっています[46]。図5bから、いくつかの三角形の銀ナノプレートが血管の膜を通過し（緑色の矢印）、いくつかの三角形の銀ナノプレートが血管に配置されていることがわかります（赤い矢印）。したがって、図8に示すように、三角形の銀ナノプレートは血球によって輸送され、血漿に放出された後、腸血管の血管壁の膜を通過し、最終的にGCに到達したと推測されます。

CBDライゲーションを行ったマウスの腸血管における三角形の銀ナノプレートの分布。 a 血液小体にある三角形の銀ナノプレート（白い矢印）。 b 三角形の銀ナノプレートが血管壁に浸透し（緑色の矢印）、一部は血液小体にあります（赤色の矢印）

杯細胞分析アッセイ

杯細胞は、ナノ粒子の排泄経路において重要な役割を果たします。この研究では、金属ナノ粒子がこれらの杯細胞から分泌される可能性があることを発見しました。この声明に続いて、杯細胞の分泌プロセスが加速されると、理論的にはナノ粒子の排出も増加する可能性があります。これに対処するために、伝統医学で使用される漢方薬によって誘発される下痢モデルを確立しました。下痢のプロセスがGCの分泌にどのように影響するかを調べるために、腸のGCの組織学的分析を実施しました。腸組織杯細胞の数が増えると、ムチン産生が増えることを認識しておく必要があります[47]。図6に示すように、下痢群では、小腸と大腸の杯細胞の総数が対照と比較して有意に多かった。さらに、腸組織の空洞化杯細胞の割合と数は、対照と比較して下痢群で有意に高かった。これらの観察結果は、腸組織細胞の量が下痢に反応して増加することを主張させ、GCによる排泄の増加を示唆しています。これらの結果は、以前に報告されたデータと一致しています[47]。

杯細胞を視覚化するためにアルシアンブルー/シフの試薬で染色された腸組織の顕微鏡写真。画像は、生理食塩水（結紮グループ）およびセンナ葉（結紮+下痢グループ）で処理されたマウスを表しており、矢印は非空洞化杯細胞（緑色の矢印）および空洞化杯細胞（赤色矢印）を分泌するムチンを示しています。すべてのバーは100μmです

腸組織と糞便の金の内容

ナノロッドの2光子作用断面積（TPACS）は2320 GMに達する可能性があることが報告されています。これは、有機フルオロフォアよりもはるかに高く、量子ドットの範囲内であり、二光子励起を使用した生体組織における金ナノロッドの分布[48、49]。研究のこの部分では、ライゲーショングループとライゲーション+下痢グループのナノ粒子の腸内分布を観察するために、AuNRコアの2光子発光を測定しました。図7に示すように、小腸と大腸の金含有量は、結紮+下痢群で観察されたものと比較して、結紮群で有意に高かった。腸組織の金元素含有量は、尾静脈注射の7日後にICP-MSによって定量化されました。腸組織の金含有量は、結紮+下痢群と比較して結紮群で有意に高かった（ P <0.001）調査全体を通して（図7）。これらの結果は、下痢グループの杯細胞によって排泄されたナノ粒子のレベルが他のどのグループよりも高いことを示しています。

GNRの尾静脈注射（励起780 nm、発光601–657 nm）から7日後の腸組織切片の2光子レーザー走査型共焦点顕微鏡画像

次の実験では、マウスの糞便中の金の含有量を分析しました。図8aに示すように、糞便の金含有量は、結紮群または結紮+下痢群と比較して対照群で有意に高かった（ P <0.001）。さらに、結紮+下痢群では、金含有量が結紮群よりも有意に高かった（図8a）。これらの結果は、下痢が腸杯細胞によって分泌されるナノ粒子のプロセスを加速することを示唆している。糞便中の金元素の定量分析と組み合わせて、腸組織の杯細胞がナノ粒子の排泄のための重要な経路に関与していることをさらに証明しました。

注射から7日後の腸組織におけるGNRの含有量（ a ）、および糞便の金元素含有量（ b ）ICP-MS分析に基づいています。 *** P <0.01、結紮群と結紮+下痢群の間に有意差を示す

金属ナノ粒子の胃液分泌に対する壁細胞の影響

壁細胞は主に胃底と胃体に分布し、塩酸と内因子を分泌します。さらに、CBDライゲーションを行ったマウスの胃組織に金ナノクラスターが分布していることを発見しました（追加ファイル1：図S4B）。したがって、壁細胞がナノ粒子の排泄に関与している可能性があるという仮説を立てました。予想通り、2光子発光画像から、金のナノロッドが胃の組織に分布していることがわかりました（図9a、b）。さらに、図9c、dが示すように、三角形の銀ナノプレートが胃組織の壁細胞に分布していることを観察しました。以前の研究結果と組み合わせると、壁細胞がナノ粒子の分泌に関与していると推測されます。

胃組織におけるナノ粒子の分布。 （ a ）および（ b ）：GNRの尾静脈注射の7日後の腸組織切片の2光レーザー走査型共焦点顕微鏡画像（励起：780 nm、発光：601-657 nm）。 （ c ）胃壁細胞のTEM画像。 （ d ）胃壁細胞にある三角形の銀ナノプレート（白い矢印）

結論

要約すると、追跡剤として、三角形の銀ナノプレート、磁性ナノ粒子、金ナノロッド、および金ナノクラスターの準備と適用に成功しました。 CBDライゲーションのあるマウスは、胃腸組織の分布とこれらのナノ粒子の排泄を研究するために、尾静脈注射を介して以前に調製されたナノ粒子で治療されました。また、金ナノクラスターと磁性ナノ粒子の排泄経路を分析しました。金ナノクラスターは主に腎臓の尿路を介して除去されるのに対し、磁性ナノ粒子は主にHBS経路を介して生物から除去されることを述べておく必要があります。金属ナノ粒子のinvivoアプリケーションでの腎臓とHBSの排泄能力は非常に限られているため、GCとPCの排泄経路は、これらのナノ粒子の排泄のための別の重要な代替方法を提供する可能性があります。この問題に関して、我々はまた、GCおよびPCから分泌されるナノ粒子のプロセスが下痢によって加速されることを発見し、GCおよびPCが金属ナノ粒子の排泄のための重要な経路を表すことをさらに証明した。確かに、例えば、GCおよびPCの分泌経路の根底にある具体的なメカニズム、および腸のGCにおけるナノ粒子のクリアランス効率など、ナノ粒子の生体内クリアランスに関して、私たちの知識はまだ限られているため、さらなる調査が緊急に必要です。要約すると、金属ナノ粒子のin vivoクリアランスのこの新しい経路は、新薬の設計と開発、ナノ粒子ベースのラベリングとin vivo追跡、invivoナノ粒子のバイオセーフティ評価などの短期的なアプリケーションで大きな可能性を秘めています。

略語

CBD：

総胆管

CCD：

電荷結合デバイス

GC：

杯細胞

GNR：

金ナノロッド

HBS：

肝胆道

PC：

壁細胞

システムFe ₃ O ₄ ：

超常磁性マグネタイト

TEM：

透過型電子顕微鏡

TPACS：

二光子作用断面積