PSAの超高感度電気化学的センシングのためのスクリーン印刷電極上に直接製造されたマイクロ流体デバイス

背景

マイクロ流体システムは、少量（10 ^-9 ）の流体を操作するプロセスです。 〜10 ^-18 L）数十から数百マイクロメートルの寸法のチャネル内[1]。この技術は、生物医学、環境モニタリング、および食品安全分析において大きな可能性を示しています。特に、マイクロ流体デバイス（MFD）は通常、フットプリントが小さい、試薬の消費量が少ない、複数のサンプルを並行して検出する、信頼性、感度が高い、大規模な統合が行われるなど、次の利点があります[2,3,4]。

電気化学センサーは、サンプリング、流体処理、分離、およびその他の工学的検出シナリオと広く統合され、ハイフンでつながれています[5]。電気化学センサーは、高感度と選択性、信頼性の高い再現性、継続的なオンサイト分析の簡単な使用、最小限のサンプル前処理、比較的低コスト、短時間の応答など、多くの利点を示すため、生体分子検出への電気化学センサーの適用は有望です。電気化学システムはマイクロ流体システムに簡単に統合でき[6、7]、これにより、サンプル前処理の容易さ、優れた感度と汎用性、かさばる除去など、従来の分析プラットフォーム[8、9、10]に比べて利点があります。光学部品[11、12]。

この研究では、ポイントオブケア診断用の市販のスクリーン印刷電極を使用した電気化学センシングMFDの製造に、シンプルで安価で用途の広い戦略を使用しました。開発されたデバイスは、CASPE-MFD（市販のスクリーン印刷された電極ベースのマイクロ流体デバイス）として定義されました。ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体チャネルは、最初に標準的なフォトリソグラフィーを使用してパターン化され、CASPE-MFDは、市販のスクリーン印刷電極にPDMSマイクロ流体チャネルを直接結合することによって製造されました（図1）。スクリーンプリントされた電極は直接使用され、ゾルゲル法を使用してガラスの薄層でコーティングされました[13]。続いて、PDMSマイクロ流体チャネルは、それらの表面のプラズマ処理後に電極に結合されました。 CASPE-MFDは、リン酸緩衝液（PBS）や血清サンプルなどの生体液中のさまざまな分析物の濃度を定量化することができます。 CASPE-MFDは、クロノアンペロメトリー（CA）および方形波ボルタンメトリー（SWV）を使用して、PBS緩衝液およびヒト血清サンプル中の前立腺特異抗原（PSA）バイオマーカーの検出および定量化を実証するために使用されました。このデバイスでのPSAの検出は高感度を示し、PSAの検出限界（LOD）は0.84 pg / mL（25.8 fM）です。 LODは、市販のアッセイの検出限界である0.1 ng / mLよりも100倍以上感度が高く[14]、他のデバイスよりも優れています[3、15、16]。 CASPE-MFDは持ち運び可能で、使いやすく、サンプル前処理や分離システムなどの他のコンポーネントを統合できる可能性があります。

a SU-8フォトリソグラフィーによってパターン化されたPDMSマイクロ流体チャネルの製造プロセス。 b 市販のスクリーン印刷された電極ベースのマイクロ流体デバイスの製造プロセス。 CASPE-MFDは、PDMSマイクロ流体チャネル、作用電極と対電極としての2つの印刷された金電極、および疑似参照電極としての印刷された銀電極で構成されています。 c 市販のスクリーン印刷された電極ベースのマイクロ流体デバイス

材料と方法

化学試薬および材料

前立腺特異抗原（PSA）およびマルチクローン抗PSA抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）はPetsec Energy Ltdから購入しました。ビオチン化抗PSA抗体、ストレプトアビジン磁気ビーズ、ウシ血清アルブミン、およびハイドロキノンはFisherScientificから購入しました。 Tween-20、過酸化水素（H ₂ O ₂ ; 30％）、およびフェロセンカルボン酸はSigma-Aldrichから入手しました。 SU-82075はMicroChemCorpから入手しました。ポリジメチルシロキサン（PDMS）プレポリマーと硬化剤はDowCorningから購入しました。すべての免疫試薬は、KD MedicalSolutionsの1×pH7.4PBS緩衝液に溶解しました。すべての化学試薬は、MilliporeMilli-Q浄水システムからの超純水を使用して調製されました。

インストルメンテーション

オリンパスU-CMAD3（オリンパス、日本）で蛍光顕微鏡を実施した。 μCSPEデバイスは、プラズマクリーナーPDC-32G（Harrick Plasma、USA）によって製造されました。すべての電気化学的測定は、CHI 760B（CHI、中国）によって、それぞれ作動電極と対電極として2つの印刷された金電極、および疑似参照電極として印刷された銀電極で構成される従来の3電極システムを使用して実行されました（図1 。

マイクロ流体チップの製造

PDMSマイクロ流体チャネルは、標準的なフォトリソグラフィーを使用してパターン化されました。簡単に説明すると、混合溶液（H ₂ ）ですすいだシリコンウェーハ SO ₄ / H ₂ O ₂ =7/3）続いて超純水で洗浄し、SU-82075フォトレジストでコーティングしました。次に、ウェーハを65°Cで7分間、続いて95°Cで40分間ベークして溶媒を除去し、フォトマスクを介して15秒間UV光に光露光しました。システム全体を65°Cで5分間ベークし、続いて95°Cで15分間ベークして重合を安定させました。シリコンウェーハをＳＵ－８現像液に浸し、イソプロパノールおよび脱イオン水で洗浄することにより、未重合のフォトレジストを除去した。 PDMSプレポリマー溶液と硬化剤（10,1）の混合物を、前述のシリコンウェーハ上にキャストし、65°Cで2時間硬化させ、剥離しました[17]。

市販の印刷電極は、ゾルゲル法を使用してガラスの層でコーティングされました。簡単に説明すると、テトラエトキシシラン（TEOS）、MTES、エタノール、および水を1：1：1：1の比率で完全に混合し、5分間超音波処理しました。混合物を65℃のオーブンに一晩置いた。ガラスコーティングの前に、電極をホットプレート上に80°Cで5分間置き、次に、混合物が電極表面に侵入するのを防ぐために、ブラシを使用して前駆体混合物を塗り付けました。塗抹後、電極を室温で乾燥させた。次に、PDMSチップとガラスで覆われた電極をO ₂ で処理しました。 30秒間プラズマを照射し、互いに接着しました。

クロノアンペロズメトリー実験

クロノアンペロメトリー実験は、4.5mMハイドロキノンと0.1mM過酸化水素溶液を含む1×pH7.4 PBSで、-2.0 mVステップ電位（対銀疑似参照電極）で実施し、0からのPSA濃度の検量線を作成しました。 〜10 ng mL ^-1 。簡単に説明すると、50μLの0.2 mg mL ^-1 を注入しました。 50μLmin ^-1 の速度でのμCSPEデバイスに対する磁気ビーズ結合抗PSA抗体 、および50μLmin ^-1 の速度で100μLpH7.4PBSを使用して完全に洗浄します。 。さらに、50μLのブロッキングバッファー（0.05％（ v / v ）Tween-20および2％（ w / v ）PBS中のウシ血清アルブミン（BSA））を10μLmin ^-1 の速度で注入しました。 37°Cの条件下で30分間インキュベートし、100μLのpH 7.4PBSを50μLの速度で使用して完全に洗浄しました ^-1 。次に、50μLの異なる濃度のPSAを10μLmin ^-1 の速度で注入しました。 37°Cで30分間インキュベートし、100μLpH7.4PBSを50μLmin ^-1 の速度で使用して完全に洗浄しました。 。さらに、50μLのHRP結合抗PSA抗体（1：1000希釈）を10μLmin ^-1 の速度で注入しました。 、37°C​​で30分間インキュベートし、50μLmin ^-1 の速度で100μLpH7.4PBSを使用して完全に洗浄しました。 。最後に、4.5mMのハイドロキノンと0.1mMの過酸化水素溶液を含む50μLの1×pH7.4PBSを50μLmin ^-1 の速度で注入しました。 。ピーク電流が安定した後、電流の3つの測定値を平均し、対応する標準偏差を計算しました。最後に、クロノアンペロメトリーが4 mVの定電位で、各グループに8回繰り返されて実装されました。電気化学実験中にCASPE-MFDが常に最良の状態にあることを保証するために、CASPE-MFDの電極は、新たに準備された0.5 MH _{2 <で10サイクルの間0.5〜1.5Vの電位範囲内でスキャンすることによって最初にアクティブ化されました。 / sub> SO 4 サイクリックボルタンメトリーを使用したソリューション。きれいな多結晶金の典型的なボルタモグラム特性が提示されました。次に、CASPE-MFDを超純水とPBS溶液で洗浄しました。}

結果と考察

CASPE-MFDの準備

CASPE-MFDの有用性を調査するために、均一分布が使用されました。蛍光マイクロビーズの溶液を5μL/分の流速でCASPE-MFDのチャネルに注入しました。CASPE-MFDの隅々が蛍光マイクロビーズの溶液で満たされ、気泡が形成されなかったことは明らかです。デバイス内（図2）。 CASPE-MFDの堅牢性を証明するために、流量を100μL/ minに増やしました。これは、このデバイスが分析物の検出に適していることを示しています。

a 蛍光画像を撮影するために使用されるスクリーン印刷された光電極。 b CASPE-MFDの蛍光画像。モデル蛍光画像として光電極を使用して、作業領域が色素で満たされ、CASPE-MFDに気泡がないことを示します。 c 蛍光画像の部分拡大図

図3に示すように、サイクリックボルタモグラムによって製造プロセスも調査しました。モデルのレドックス活性化合物としてフェロセンカルボン酸を使用しました。図3aは、さまざまな潜在的なスキャンレートでのレドックスピーク電流の関係を示しています。 CV曲線の酸化還元ピークは、典型的な可逆的電気化学反応を示し、反応速度は電極表面への電気活性種の拡散によって支配されます。ピーク陰極電位間の電位分離（ E _pc ）およびピーク陽極電位（ E _pa ）は62 mVであり、これはフェロセンレドックスカップルの理論値59mVに近い値です。さらに、ピーク電位の位置は、電位スキャンレートおよび陽極ピーク電流（ i ）の関数として変化しません。 _pa ）は、陰極ピーク電流（ i ）にほぼ等しくなります。 _pc ）10〜350 mV / sの範囲。可逆的挙動はバルク溶液中のシグナルに対応しており（追加ファイル1：図S1A）、これは副反応が起こらず、予想通り、電子移動の動力学がレドックスの表面濃度を維持するのに十分速いことを示しています。 -ネルンストの式で必要な値の活性種。図3bは、両方の陽極ピーク電流（ i _pa ）および陰極ピーク電流（ i _pc ）はスキャンレートの平方根に比例し、典型的な拡散律速プロセスを意味します[18]。さらに、CASPE-MFDで測定された電流は、バルク溶液の電流の値にかなり近く（追加ファイル1：図S1B）、デバイスでの分析がその感度を犠牲にしないことを示しています。

a さまざまなスキャン速度（ y に沿って上昇）でのCASPE-MFD中の0.1 M KCl水溶液（pH 7.0）中の0.5mMフェロセンカルボン酸のサイクリックボルタモグラム -軸）：10、25、50、80、100、150、200、250、300、および350 mV / s。 b 陽極（ i ）のキャリブレーションプロット _pa ）および陰極ピーク電流（ i _pc ）対二乗スキャンレート。 2本の線は、それぞれ回帰方程式を使用した線形曲線を表しています。 Y （ i _pa ）=0.9932 X − 0.2563（ R ² =0.9996、 n =8）; Y （ i _pc ）=− 0.9384 X − 0.1774（ R ² =0.9996、 n =8）

PSA検出でのCASPE-MFDのパフォーマンス

最近の報告によると、4〜10 ng / mLの範囲の前立腺特異抗原（PSA）濃度は、一般に前立腺癌の存在の可能性が高いことを示しています[19]。そのため、準備したCASPE-MFDの性能を評価するためのターゲットとしてPSAを選択しました（図4）。図4aは、準備されたCASPE-MFDをポータブル電気化学ワークステーションに直接接続できることを示しています。図4cに示すように、磁気ビーズ結合抗PSA抗体は、磁石を使用して金電極（作用電極）の表面に固定化されました。次に、PSA抗原を、調製したCASPE-MFDのマイクロ流体チャネルに注入し、作用電極に固定化された抗PSA抗体と結合させました。次に、HRP修飾抗PSA抗体をPSA抗原と結合させました。クロノアンペロメトリーを使用して、ハイドロキノンと過酸化水素が生成する電気化学的信号を検出しました。

a 検出装置全体。シリンジポンプを使用してCASPE-MFDに溶液を注入し、電気化学ワークステーションを使用して電気化学信号を検出しました。 b PSAの検出に使用されるCASPE-MFD。免疫磁気ビーズ結合抗PSA抗体に注入口から溶液を注入し、磁石を使用して磁気ビーズを捕捉しました。 c PSA抗原の検出におけるCASPE-MFDの概略図。免疫磁気ビーズ結合抗PSA抗体は、磁石を使用して作用電極に固定化されました。 PSA抗原をCASPE-MFDに注入し、抗PSA抗体と結合させました。次に、HRP修飾抗PSA抗体をPSA抗原と結合させました。クロノアンペロメトリーを使用して、ハイドロキノンと過酸化水素が生成する電気化学的信号を検出しました

クロノアンペロメトリーは、他のアンペロメトリー技術と比較して優れた信号対雑音比を提供し[20、21、22、23、24]、電極に機械的に固定された流体の薄いスラブの使用は、分析よりも振動に対してより耐性があります。大量のソリューション。ファラデー拡散制限電流の場合、電流時間応答はコットレル方程式で表されます。

ここで n は電子の数、 F はファラデー定数（96,485 C / mol）、 A は電極面積（cm ² ）、 D は拡散係数（cm ² / s）、および C は濃度（mol / cm ³ 。

調製したCASPE-MFDを使用して、0〜10 ng mL ^-1 の濃度の一連の分析物溶液中のPSAを検出しました。 。 CASPE-MFDでのPSAの検出のクロノアンペロメトリー応答を図5aに示しました。ピーク電流は、4.5mMヒドロキノンと0.1mM過酸化水素を含むpH7.4PBSのPSA濃度の増加とともに増加しました。図5b（青い線）に示すように、ピーク電流は0.001〜10 ng / mLの範囲でPSA濃度の対数値に比例し、線形回帰式は I です。 （μA）=14.87 + 3.927×log C _PSA （ng / mL）（ R ² =0.9985、 n =8）。検出下限（0.84 pg / mL）と良好な線形関係から、調製したCASPE-MFDを使用してPSAを実際に検出できることが示唆されました。さらに、図5cの方形波ボルタンメトリー（SWV）を使用して、CASPE-MFDでさまざまな濃度のPSAを検出しました。 SWVの応答も、クロノアンペロメトリーの結果と一致していました。

a さまざまな濃度のPSA抗原のクロノアンペロメトリー曲線（ y に沿って上昇） -軸）：4.5mMハイドロキノンと0.1mMH ₂ を含むpH7.4PBSバッファーで0、0.001、0.01、0.1、1、および10 ng / mL O ₂ 銀の疑似参照電極に対して− 2.0mVのCASPE-MFDの溶液。 b pH 7.4 PBSバッファー（青線）およびヒト血清（赤線）中のCASPE-MFDにおけるピーク電流とPSA抗原濃度の間の線形関係。青い線の線形回帰方程式は Y です。 =14.87 + 3.927× X （ R ² =0.9985、 n =8）、赤い線の線形回帰方程式は Y です。 =14.15 + 3.622× X （ R ² =0.9986、 n =8）。 c 4.5mMハイドロキノンと0.1mMH ₂ を含むpH7.4PBSバッファー中のさまざまな濃度のPSA抗原の方形波ボルタモグラム O ₂ CASPE-MFDのソリューション（ y に沿って昇順 -軸）：それぞれ0、0.001、0.01、0.1、1、および10 ng / mL。 d 異なる濃度のPSA抗原の対応する線形関係。線形回帰方程式は Y です。 =34.53 + 9.246× X （ R ² =0.9884、 n =8）

CASPE-MFDを使用したPSAの選択的検出

実際のサンプルに対するデバイスでの可能なアプリケーションを検証するために、クロノアンペロメトリーを使用して、ヒト血清サンプル中のさまざまな濃度のPSAを分析しました。追加ファイル1で得られた結果：図S2は、4.5mMヒドロキノンと0.1mM過酸化水素を含むヒト血清中のPSA濃度の増加に伴い、PSAのピーク電流も増加することを示しました。さらに、対応する検量線を図5b（赤い線）に示しました。線形回帰方程式は I です。 （μA）=14.15 + 3.622×log C _PSA （ng / mL）（ R ² =0.9986、 n =8）。 2つのグループ間に統計的な違いがほとんどないことは明らかであり、準備されたCASPE-MFDが実際のサンプルで機能することができたことを示しています。さらに、CASPE-MFDは、PSAを標的とする選択性が高く、前立腺癌の診断に臨床応用できることが実証されました。

結論

私たちは、シンプルで低コストのポータブルな商用スクリーンプリント電極ベースのマイクロ流体電気化学センシングを開発しました。さらに、PBSバッファーおよびヒト血清サンプル中のPSAの定量分析にCASPE-MFDを適用する方法を示しました。デバイスが市販のスクリーン印刷された電極上に直接製造されたため、測定は良好な感度と再現性を示しました。 CASPE-MFDには5つの利点があります。（i）軽量で、ポータブルで、多目的に使用できます。 （ii）標準化されている。 （iii）高い感度と精度で優れた再現性を備えています。 （iv）使いやすく、専門の医療関係者や複雑な器具を必要としません。 （v）高密度検出システムを小さなデバイスに統合することができます。さらに、小型化されたポテンシオスタットを使用すると、CASPE-MFDを現場または自宅で診断できるようになります。さらに、市販の電極と簡単な製造により、CASPE-MFDの標準化と工業化を実現できます。したがって、このプラットフォームは、小分子（ナトリウム、カリウム、塩化物、ブドウ糖）、癌マーカー（B型ナトリウム利尿ペプチドまたはBNP、トロポニンI）、細胞（CD ₄ ）、および核酸（DNA、RNA）。

略語

MFD：

マイクロ流体デバイス

CASPE-MFD：

スクリーンプリントされた電極ベースのマイクロ流体デバイス

PDMS：

ポリジメチルシロキサン

PSA：

前立腺特異抗原

CA：

クロノアンペロメトリー

SWV：

方形波ボルタンメトリー

LOD：

検出限界

HRP：

西洋ワサビペルオキシダーゼ

TEOS：

テトラエトキシシラン

MTES：

準安定移動発光分光法

BNP：

B型ナトリウム利尿ペプチド