層別積層電気活性色素/LDHナノプレートレット膜による高度なデュアル電気光学センシング

概要

アルミニウムイオン（Al³⁺）が人体神経系に及ぼす最も破壊的な影響や、アルツハイマー病などの関連疾患が報告されている。Al³⁺のセンサーベース検出法における固体電極の開発はまだ初期段階にある。本研究では、新規な柔軟ITO/PETベース電気化学固体センサーを設計・構築した。電極基板表面を、Mg-Al LDHナノプレートレットとアリザリンレッドS（ARS）を層別積層（LbL）法で相互接続マトリックス膜として修飾した。電極のセンシング基盤の分子設計において、ITO/PET上に層別積層された（ARS/LDHs）_nマトリックス中の電気活性有機単位（ARS分子）が、標的分子（Al³⁺イオン）に曝露されると電気化学反応に関与し、新たに形成されたAlキレート系の電気化学的変化が検出可能となる。このタイプのセンサーはAl³⁺の感度・選択的検出に用いられる。修飾マトリックス膜の最小シート抵抗、形態、高い電気触媒活性は、LbL積層法の第5サイクルで得られた。この電気化学センサーでは、電気化学的手法と光学的手法の両方で高感度・高選択的にAl³⁺を検出でき、サイクリックボルタンメトリー（CV）電気化学手法では、蛍光ベースの光学手法と比較して、より低い検出限界10.1 nM、線形範囲[0.2〜120 μM]を達成した。

はじめに

層状二重水酸化物（LDH）は、アニオン粘土の一般式を持つ二次元化合物であり、光学、生物、電子用途で広く利用されている[1,2,3,4]。LDHの化学構造は[M^II_1−xM^III_x(OH)₂]⁻(Aⁿ⁻)_x/n·mH₂Oで表され（M^IIとM^IIIはそれぞれ二価・三価金属、Aⁿ⁻は層間アニオン）[1]。この二次元構造により、LDHの柔軟性とイオン交換能を、新しい層別積層（LbL）法で適切な有機分子と規則的な層状配列で組み合わせ、有機/無機複合体を形成し、様々な科学分野で広く応用されている[5,6,7]。この配列におけるゲスト分子の一つとして電気活性分子があり、電気化学反応に関与する種と初期電極基板間の直接電子移動プロセスを加速する[8, 9]。LDHナノプレートレットの利用とその表面構造改質は、電子・光電子デバイスの開発に広く応用されている[10]。この分野の重要な研究として、Chenら[11]は単段階Ni-Co LDHハイブリッド膜成長法により、超薄型多孔質ナノシートを用いて電極の比容量を大幅に向上させた。Liら[12]は、異なるモル比の2種類のアニオンをMg-Al LDHネットワークにインターカレートし、青色発光ハイブリッド材料を得た。Tianら[13]は、層別積層法で金ナノクラスター（Au NCs）を二次元LDHグリッド内に局在化し、蛍光向上とAu NCsベース膜の効率的製造法を実現した。層別積層法は高蛍光効率を持つ蛍光センサー製造の主要な新手法と見なされている。したがって、電気化学デバイスにおける電極基盤の精密な分子・構造設計により、設計ネットワーク内での高度な電気化学的・光学的変化の検出・表示が可能となり、装置の効率と感度を大幅に向上させられる。

透明電極は、光電子デバイスの重要コンポーネントとして近年注目されている。最近、柔軟・伸縮性エレクトロニクスと光電子技術デバイスが急速に発展し、特にウェアラブルエレクトロニクスと高携帯性デバイスの発展を促進している[14]。柔軟エレクトロニクス研究は急速に拡大し、スーパーキャパシタ、埋め込みセンサー、柔軟圧電センサー、電子ペーパー、太陽電池、タッチパネル、ワイヤレスウェアラブルガジェット、柔軟ディスプレイ、生体統合治療デバイス、表皮エレクトロニクスなどに応用されている。インジウムスズ酸化物（ITO）は優れた光電子特性を示し、現在最も広く用いられる透明電極である[15,16,17]。さらに、ITOコーティングポリエチレンテレフタレート（PET）基板（ITO/PET）は、優れた柔軟性と高い電気伝導性を兼ね備え、多数の用途に適用されている[18]。

最近、我々はドーパミンとFe(III)検出のためのデュアル増幅戦略を用いたLDHベース電気化学センサーを報告した。層別積層（LbL）積層時に、合成した電気活性ナフタリミド色素/LDHナノプレートレットマトリックス（NALD-n）がGO/ITO/PET表面電極に連続層として表示された。この構造設計により、センサー基盤での電気活性色素の蛍光放出が大幅に増加した[19]。

高感度エレクトロニクス（ナノセンサーなど）の構造におけるこの分子工学分野が、本研究で設計されたプロセスの基盤となっている。

アリザリンレッドS（化学名：1,2-ジヒドロキシ-9,10-アントラキノン）は平らな複素環構造を持ち、生物科学、光化学、有害汚染物質に関わる環境研究で広く用いられている[20, 21]。ARSは高い蛍光強度を持つため、金属イオンと生体分子の検出センサーとして広く利用されている[22, 23]。

Al³⁺イオンは様々な産業で多数の用途を持つ重金属イオンであり、人体への毒性と破壊的影響が複数の研究で調べられている。最も破壊的な影響はアルツハイマー病などの人体神経系に及ぶと報告されている[24]。生物・環境試料中のアルミニウムイオン量を決定するため、いくつかの精密実験室法が通常用いられる。一般的な方法として、誘導結合プラズマ原子発光分光法（ICP-AES）[25, 26]、誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）[27]、グラファイト炉原子吸光分光法（GF-AAS）[28]、高分解能連続光源フレーム原子吸光分光計（HR-CS）[29]、フレーム原子吸光分光法（FAAS）[30]などがある。これらは標準的で機能的だが、深刻なマトリックス干渉や精度不足といった重大な欠点がある。アルミニウムイオン決定法の違いは表1にまとめられている。検出限界はmg/Lまたはµg/Lの範囲であり、一部の手法は試料調製と分析に長時間を要する。

微量分析では、特定の吸着剤への前濃縮ステップが必要な場合が多い。一部の分光蛍光法は高感度で低検出限界だが、応答時間が長い[31,32,33,34,35,36,37]。検出システムがシンプルでも、感度と選択性に弱点がある。光学的・電気化学的手法を組み合わせたセンサーは、他の手法より優れた利点を提供する。光-電気化学センサーは小型化に適し、低コストで使いやすく、リアルタイム環境モニタリングに必要な優れた選択性と感度を備える。固体センシングプラットフォームはセンサー製造に不可欠である。化学試薬が固体マトリックス内部または表面に固定化されると、固定化媒体での安定性が向上し、望ましくない干渉や汚染への感受性を回避できる。

近年の研究では、Al³⁺イオンのより精密な検出のために電気化学センサーの利用が導入されている[38]。三次元無機または二次元有機/無機剛性ネットワークで構成されるセンサーは、イオン吸着のためのより大きな界面積を持ち、センサーでの電気触媒反応性が高まり、結果として電気化学センサーの感度と選択性が向上する[39]。我々の知る限り、ここで提示するITO/PET層別積層（ARS/LDHs）_nマトリックスは、アルミニウム監視のための最初の電気光学プラットフォームである。

本研究では、Al³⁺イオンを精密に検出する新規電気化学固体センサーを開発した。この電気化学センサーの基盤は、電気化学的手法と光学的手法で信号を同時に測定することである。このタイプのセンサーでは、ITO/PET上にLbL積層された（ARS/LDHs）_nマトリックス中の電気活性有機単位（ARS分子）が、標的分子（Al³⁺イオン）に曝露されると電気化学反応に関与し、新たに形成されたAlキレート系の電気化学的変化が検出可能となる。電気化学的変化に加え、標的分子との接触によりセンサーから放出される光の量と質も評価される。

材料と方法

材料

ITO/PETシート（60 Ω cm⁻¹）、アリザリンレッドS（3,4-ジヒドロキシ-9,10-ジオキソ-2-アントラセンスルホン酸ナトリウム塩）、硝酸アルミニウム(III)（Al(NO₃)₃）、硝酸コバルト(II)（Co(NO₃)₂）、硝酸ニッケル(II)（Ni(NO₃)₂）、硝酸カルシウム(II)（Ca(NO₃)₂）、硝酸ストロンチウム(II)（Sr(NO₃)₂）、硝酸銅(II)（Cu(NO₃)₂）、酢酸/炭酸ナトリウム緩衝液、塩化カリウム（KCl）はSigma Aldrich社製を使用した。

装置

修飾電極のシート抵抗はフルークオームメーター（1550B）で測定した。吸収測定はシングルビームUV-Vis分光光度計（CECIL CE9200）で200〜800 nmで行った。走査型電子顕微鏡（SEM）と原子間力顕微鏡（AFM）試験は、調製サンプルに対しそれぞれ（LEO 1455VP）と（Micro Photonics Inc/Dual scope DS95-200E）で実施した。蛍光分光光度計（PerkinElmer LS55）で試料の蛍光強度を測定した。サイクリックボルタンメトリー（CV）測定は（Zahner PP211ポテンショスタット）を用い、三電極電気化学セルで実施した。この試験では、調製電極表面を作業電極とし、白金を対極、Ag/AgClを参照電極とした。KCl溶液（脱イオン水中0.1モル）を全試験で標準電解質として用いた。すべてのCV試験で電位スキャンステップは0.005 V、電位スキャン速度は0.05 V/sとした。本研究で提示する各サイクリックボルタモグラムは、各実験で得られた最も代表的なサイクルである。

ARS/LDH膜修飾電極の作製

Mg-Al LDH（硝酸アニオン含有）はICRC研究グループが開発した方法で合成した[40]。Mg-Al LDHナノプレートレットのコロイド懸濁液（脱イオン水中1.0 g/L）を、超音波洗浄機（Bandelin electronic/510 h）で40 °C、4時間超音波処理して調製した。LDHナノプレートレットとARS色素分子の電極表面への吸着に及ぼすpH効果を、pH 3.5〜11.5の範囲で異なる（酢酸/炭酸塩）緩衝液で調整し調査するため、ITO/PET電極をLDH懸濁液（pH 3.5〜11.5の範囲で調整）に10分間浸漬した。電極を取り出し蒸留水で洗浄した。その後、一定の中性pH（= 7.0）のARS水溶液（1.0 g/L）に浸漬した。ARS溶液浸漬後、洗浄し窒素ガス流で2分間、25 °Cで乾燥させた。このLbLプロセスを5回繰り返した。第5LbLサイクル後の電極表面からUV-Vis分光光度測定を行った（図1a）。LDH分散の最適pH選択後、同様の試験を実施した。今回は、1段階で電極をLDHコロイド懸濁液（最適pH）に10分間浸漬し、洗浄・乾燥後、ARS溶液（他条件同一）に浸漬した。ARS溶液のpHを3.0〜7.0の範囲で変化させ、電極表面からUV-Vis分光光度測定を行った（図1b）。その後、LDH懸濁液（最適pH）とARS溶液（最適pH）に対する一連の操作をn回繰り返し、（ARS/LDHs）_n多層膜を得た（図1c）。LbL浸漬試験の手順をスキーム1に示す。調製電極の特性とコードを表2に示す。

層別積層電気活性色素/LDHナノプレートレット膜による高度なデュアル電気光学センシング — ARLD-nの吸光度変化（pH依存性） a LDHコロイド懸濁液（1.0 g/L）を脱イオン水中で異なる調整pH（LbLサイクルではARS溶液pHを7に固定）、 b ARS溶液（1.0 g/L）を脱イオン水中で異なる調整pH（LbLサイクルではLDH懸濁液pHを5.5に固定）、 c ARLD-5の吸光度変化（LbLサイクル全体でLDH懸濁液pH 5.5、ARS溶液pH 4.0に固定）

結果と考察

固体電極上での最適なARS吸着を得るため、LDHナノプレートレットの吸着挙動に及ぼすpH効果をUV-Vis分光光度法で調査した。LDHとARSはそれぞれ[260〜360]および[400〜600]領域に指数吸収ピークを示す[24]。LDHコロイド懸濁液とARS溶液のpH最適化結果を図1に示す。

結果より、LDHナノプレートレットとARS分子の吸着はpH 3.5で最小、pH 5.5で最大となった。LDH結晶ネットワークにおける異性置換現象（Mg²⁺がAl³⁺に置換）と、プロトン化/脱プロトン化によるLDH表面の電荷レベルのpH依存性により、LDHの金属イオン（LDH基底面上）は強酸性条件（pH < 4）で溶解し、LDH構造が変化する。他のpH値ではLDH溶解は観察されない[41,42,43]。ゼロ電荷点（PZC）は、一定温度・圧力・媒質下で反対電荷がゼロになるpHとされる。LDHにもPZCが存在することが研究で示されている[44]。LDH表面へのプロトン電荷吸着は媒質pHを変化させるが、系のpH変化に伴いLDH表面電荷も変化する。また、静電結合効果により、異なるpH条件下でのLDHナノプレートレット配列（基底面と稜柱面）は色素分子吸着に対する傾向が異なる。結果によれば、強酸性条件（pH < 4）ではLDH基底面上の金属イオン溶解により、固体電極表面に吸着する安定で不溶性のLDHナノ粒子量が最小となる。

一方、完全アルカリ性条件に移行すると、LDHの脱プロトン化により、LDH表面へのARS分子吸着量が減少する。したがって、LbL浸漬試験におけるLDHコロイド懸濁液の最適pHは5.5と判断された。図2bによれば、LDHナノプレートレットを含む電極表面へのARS吸着量が最大となるのはpH 4.0である。LDH表面上でのAl³⁺イオンとの錯体形成に不適切な媒介体が形成されたと思われる。強酸性条件（pH 4.0）では、中間化合物（スキーム2の化合物II）の構造形態がより安定し、LDHネットワーク内でAl³⁺イオンとキレートを形成しやすい。中性pHでは、LDH表面へのARS相対吸着量が減少する。Sathish[45]とSupianら[24]も、ARS試薬が酢酸緩衝液pH 4.0でAl³⁺イオンと錯体を形成することを報告している。したがって、LbL浸漬試験におけるARS溶液の最適pHは4.0と判断された。LDH懸濁液（pH 5.5）とARS溶液（pH 4.5）について全5回のLbLサイクルで最適pH調整を行った場合のARLD-5修飾電極の吸光度挙動を図1cに示す。

Mg-Al LDHナノプレートレットが電極表面電気伝導度に及ぼす影響について、浸漬サイクル数（n）を決定する必要があった。このため、異なる浸漬サイクルでの電極シート抵抗変化を調査した。図2に（ARS/LDHs）_nで層別積層されたITO/PET電極サンプルのシート抵抗結果を示す。

図2の結果から明らかなように、電極シート抵抗は第5サイクルまでわずかに減少し、第5サイクル以降はLDHナノプレートレット密度の過度な増加と電子移動経路の延長によりシート抵抗が増加する。LDHナノプレートレットの電極表面へのLbL積層はイオン交換機能と強固な電子移動をもたらす可能性があることに注意が必要である。したがって、第5サイクルを最適サイクルとして選択し、この条件下では修飾電極が最小抵抗と最高電気伝導度を持つ。一般的に、この試験結果は、LDHナノプレートレットとARS色素分子のLbL積層法が、第10サイクルまで電極の抵抗と電気伝導度に有意な影響を与えないことを示している。

図3と図4に、調製サンプルから得られたSEM画像とAFM三次元地形像をそれぞれ示す。

調製電極の形態と地形走査結果から、LbLサイクル数（n）の増加に伴い、電極表面上でARSとともにLDH層の密度が連続的に増加することが観察される。第1サイクルから第5サイクルにかけて、表面粗さが増加（AFM画像）し、LDHナノプレートレットの厚さと吸着ARSが急激に増加し続けた。

LDHナノプレートレット上のARS分子吸着を調査するため、吸着層の光学的挙動を分光蛍光光度法で研究した。各LbL浸漬サイクル後、固体電極表面から分光蛍光光度試験を実施した。調製電極の分光蛍光光度試験結果を図5に示す。

結果より、第1LbL浸漬サイクル後は、電極表面に吸着したARS分子とLDHナノプレートレットの量が少ないため、蛍光放出量は微弱で、弱い蛍光放出ピークは約666 nmであった。LbL浸漬サイクル数（n）を増やすと、固体電極表面上のARS層とLDHナノプレートレットの密度増加に伴い、蛍光放出率が連続的に増加した。第5サイクルでは、最高蛍光放出ピークが668 nmで観察された。脱イオン水中低濃度（10⁻⁴ M）ARS溶液の弱い放出スペクトルにより、固体電極基板上でMg-Al LDH間に封入されたこの化合物の蛍光放出強度は、固相での色素分子の分子回転が溶媒相より少なく、固相での溶媒効果が減少するため向上した[46]。層数が増えるとクーリエの形状がシャープになり、ピーク幅が狭くなることがこれを裏付ける。凝集体または結晶格子に組み込まれた分子の蛍光放出は増強され、非放射エネルギー移動効果と分子回転の減少が大幅に軽減または排除される。しかし、固体表面での高度な凝集は顕著な自己消光をもたらす。クロモフォア間の分子間相互作用を減らすため、積層構造間の分離を増やして芳香族コア間のπ重なりを減らすことで、蛍光消光を減らし強い放出が得られた[47]。

ARSは溶液pHに依存して3つの平衡構造を持つことが分かった（スキーム2）[48, 49]。第2脱プロトン化により、pH > 12.1で青紫色のジアンイオン（III）が生成する。実験条件の関数として酸化型ARS 1と還元型ARS 7が存在する。以下からpH 4まではARS 1が主種、pH 5.5〜10.5ではARS 2が優勢、pH 12以上ではARS 3が関連種となる。ARSのイオン形態は互変異性構造を持つ。スキーム2に各種の還元形と互変異性を示す。

アリザリン（I）とARSはAl³⁺と安定な錯体を形成し、「レークピグメント」として知られる。V. Ya. Fainらがアリザリンとアリザリンレッドの金属錯体を電子吸収スペクトルに基づき深く研究した[50]。彼らはジヒドロキシアントラキノンの錯体形成が常にペリまたはオルト-ヒドロキシカルボニル基で進行し、互変異性アントラキノン形態を伴うと結論付けた。アリザリン錯体形成は、ARSモノアニオン形態（化合物II、スキーム3）においてペリ-ヒドロキシカルボニル基を介したC=O M-O配位結合と6員キレート環形成で進行する。著者らはアルカリ溶液ではアリザリンが金属イオンとオルト-ジフェノール化合物として反応し構造IIIを与えると提案した。中性媒質での錯体形成は、錯体Iのキレート環内の水素原子が金属イオンで置換され、その後M-O結合が電離することで説明できる。したがって、アリザリンモノアニオンの位置1のイオン化ヒドロキシ基は分子内水素結合で結合している。また、IIを形成するため、この錯体はさらに3つの互変異性形態（IV-VI）を持つ可能性がある。

酸性媒質ではO-M結合は共有結合のまま維持され、単核アリザリネートの電子吸収スペクトルは非電離アリザリンのスペクトルと同一である。弱アルカリ媒質では、アリザリンはモノアニオンとして金属イオンと錯体形成反応を起こす。すべてのモノアニオン構造の中で、9-ヒドロキシ-2-オキソ-1,10-アントラキノンのみが隣接カルボニルとオキソ基を含む。したがって、アルカリ媒質で形成される単核アリザリネートは、5員キレート環を持つ1,10-アントラキノン構造VIIを持つべきである。

スキーム2からわかるように、ARSは可逆的酸化還元挙動を示す。その金属錯体も異なる酸化還元特性を持つ電気活性種であり、電気化学分析への応用に適した候補となる。その錯体形成速度は、一般的な金属イオン錯体形成試薬に比べて速い。ARSとARS-Alは異なる酸化還元ピーク電位を示す。したがって、遊離ARSへのアルミニウムイオン添加時に、ARS-Al錯体の酸化還元に関連する異なる電位での新しいピーク（ARS-Al）が、アルミニウムイオン濃度に比例して増大する。ARSベースセンサーの感度と適用性を向上させるため、様々な安定プラットフォームが導入されている。ARSとその錯体はともに固体状態で電気活性である。

調製電極の電気化学的挙動をサイクリックボルタンメトリー試験で調査した。調製電極のサイクリックボルタモグラム結果を図6に示す。

図6aの結果によれば、裸ITO/PET電極の形状は電流流量が少なく浅い幅を持つノイズの多いグラフであり、電極の弱い電気触媒活性を示している。(ARS/LDHs)_n LbL積層による電極表面修飾により、CVグラフの形状はより幅広く対称的なサイクルに傾向し、浸漬サイクル数増加に伴い電流間隔が増大し、クーリエ表面がより広がり、第5サイクル（n = 5）で最高ピーク電流と最も幅広いグラフを示す。図6bの結果の通り、0.1 M KCl中のARLD-5電極ではアルミニウムイオン不在時に、CV試験結果によりやや「可逆的」なピークが観察される。このピークでは、修飾電極表面での遊離ARSの酸化/還元により、約0.25 V（vs Ag/AgCl）で陽極と陰極電流が発生する。アルミニウムイオン存在下（図6c）では、修飾電極表面でのアリザリン-アルミニウム錯体の酸化ピークに関連する、約0.58 V（vs Ag/AgCl）での疑似可逆的ピークバーストが検出可能となり、ARLD-5では酸化ピークが鋭く明確に検出される。ボルタモグラム結果は、LbL浸漬層数増加に伴い、電極外部表面への電子移動に関する修飾電極の電気触媒活性が向上したことを示す。また、電極表面での(ARS-Al)錯体還元反応（スキーム3）も改善され、最高の電気触媒活性はARLD-5電極で明らかである[24]。

色素の構造モデルと(ARS-Al)錯体形成へのpH効果の重要性を考慮し、すべてのCV実験は中性pH（= 7.0）（脱イオン水中0.1 M KCl）で実施し、Al³⁺イオン濃度変化のみで電極表面のすべての電気化学的・光学的変化を制御・検出できるようにした。

Al³⁺の電気化学的検出

異なる濃度のAl³⁺添加後のサイクリックボルタモグラム変化を図7に示す。すべての結果は、アルミニウムイオンを電解質に添加後10秒で取得したものである。

図7の結果によれば、Al³⁺イオン濃度増加に伴い、ピーク電位（E_pa）0.58 V（vs Ag/AgCl）での酸化ピーク電流強度が制御された連続的プロセスで徐々に増加する。これは、ARS-Al³⁺錯体がARLD-5電極表面で約0.58 V（vs Ag/AgCl）の酸化電位で形成されることを示している。A.R.S.とAl³⁺の錯体形成強度が高いため、錯体形成の酸化ピークは疑似可逆的である[51]。本研究で得られた結果は、線形スイープスキャンで遊離アリザリンの酸化に対応する0.27 Vの大きなピーク、Al錯体化アリザリンの酸化が異なるスキャンレートで0.58 Vのピークを与えるという他の研究結果と近い[52]。図7bは、ARLD-5電極のAl³⁺イオン検出における電気触媒挙動を示す。陽極ピーク電流変化はAl³⁺濃度増加に伴い直線的に増強される。線形応答範囲は[0.2〜120 μM]、回帰式はi_pa (μA) = 0.0282C (10⁻⁶ M) + 0.0608、r² = 0.991、Al³⁺の検出限界は10.1 nMとなった。

さらに、同条件下（ARLD-5を作業電極、0.1 M KCl溶液中120 μM干渉イオンでCV試験）で、Co²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Cu²⁺を干渉イオンとして調査した。干渉イオン添加後のARLD-5電極サイクリックボルタモグラムを図8に示す。

図8は、修飾電極のAl³⁺に対する良好な選択性を示している。pHを酢酸/炭酸ナトリウム緩衝液、0.1 M KCl（15 μM Al³⁺イオン含む）で2.0〜12.0に変更した。サイクリックボルタモグラム結果を図9に示す。

図9の通り、pH 5.0〜7.5範囲ではグラフ形状と酸化ピーク電流にほとんど差がない。しかし、より酸性条件（pH 5〜6.5）では、電解質中の水素イオン濃度が高いため、固体電極表面での化合物II（スキーム4）形成確率が増加し、アルミニウムイオンとキレート形成するため、ARS-Al錯体の酸化ピーク電流が増加する[38]。このセンサーは、pH 5.0未満（強酸性条件）および8.0超（強アルカリ性条件）での適用は推奨されない。電極表面に吸着したLDHナノプレートレットの構造変化が生じるためである。

Al³⁺の光学的検出

アリザリンレッドS（ARS）は分光光度法開発のための発色剤として用いられてきた。アントラキノン-金属錯体は強い蛍光を示す。金属-ARS錯体の蛍光は陽イオンの場エネルギーに影響される[53]。したがって、Al-ARS錯体の最大励起蛍光波長対は、分光光度法によるAl決定における干渉物質となる他の金属イオンとは大きく異なる。分光蛍光法によるアルミニウム決定の原理は、遊離ARSへのアルミニウムイオン添加時に増大する強度増強に基づく。本研究ではARSをLDH固体プラットフォームに吸着させ、より剛直にし、強度を向上させることで感度を高めた。

調製電極を三電極電気化学セルの作業電極とした。電解質は蒸留水中KCl溶液（0.1 M）を用いた。異なる濃度のアルミニウムイオンを電解質に添加した。各CV試験後、この試験完了後に電極表面で定期的に分光蛍光光度試験を実施した。分光蛍光光度試験結果を図10に示す。

(ARS/LDHs)₅マトリックスで修飾されたITO/PET電極は、Al³⁺イオン存在下で強い蛍光放出スペクトルを示す。図10は、Al³⁺添加後（濃度範囲0.2〜120 μM）のARLD-5での漸進的蛍光増加を示し、A.R.S.とAl³⁺間のスタティックアダクト形成を示唆している。Al³⁺添加後10秒以内にARLD-5蛍光強度が増加することが分かった。したがって、ARLD-5の蛍光増加はインキュベーション時間に比較的依存しない。以上の結果から、ARLD-5はAl³⁺イオンに対する感度と高効率蛍光放出を持つ。

光学センサーでの検出限界とキャリブレーション曲線を算出するため、まず蛍光強度差の比を求め、次にこの比を標的濃度逆数のグラフとして描画する。式(1) [54]に従い、フィット直線の傾きを用いて検出限界を決定した。得られた結果を図10cに示す。

$$(F_{\max} - F_{0})/(F_{c} - F_{0}) = 1 + (KC)^{-1}$$ (1)

図10bの結果の通り、蛍光強度変化はAl³⁺濃度増加に伴い線形応答範囲[0.2〜120 μM]で増強される。蛍光強度を濃度逆数に対してプロットすると、回帰式Y = 0.6994X + 0.5445、r² = 0.986、Al³⁺の検出限界は23 nMとなった。

センサーのAl³⁺選択性を決定するため、120 μM干渉イオン（Co²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Cu²⁺）を調製した。電解質に干渉イオン添加後、電極表面から分光蛍光光度試験を実施した。図11の結果の通り、干渉イオン添加では電極表面の蛍光放出に有意な差は見られず、Al³⁺で最も顕著な蛍光放出差が観察され、このタイプセンサーのAl³⁺に対する高選択性が示された。修飾電極のAl³⁺選択性をより明確にするため、完全同一条件で脱イオン水中10⁻⁴ M濃度ARS溶液を6つ調製した。それぞれに120 μMのAl³⁺イオンと干渉イオンを割り当て、よく混合した。図11bは、励起波長366 nmのUVキャビン下で撮影した各溶液の画像を示す。分光蛍光光度試験結果が示した通り、ARS溶液へのAl³⁺イオン添加で顕著な蛍光が観察された一方、初期ARS溶液と干渉イオン含有ARS溶液はUVキャビン下で蛍光放出を示さなかった。

電極表面での電気化学メカニズムをより理解するため、120 μM Al³⁺イオン添加とCV試験実施前後で電極表面のUV-Vis分光光度調査を実施した。ARS溶液（10⁻⁴ M）を脱イオン水で調製し、120 μM Al³⁺イオンを添加してよく混合した。両溶液からUV-Vis分光光度試験を実施した。サンプルから得られたUV-Vis分光光度結果を図12に示す。

図12の結果によれば、アルミニウムイオンをARS溶液に添加すると、最大吸収波長577 nmで鋭いピークが見られ、ARS-Al³⁺錯体形成後の吸収波長シフト（赤方偏移）とクロモゲン吸光度強度増加を示す。Al³⁺イオンがARS分子と反応すると、ARS分子内のヒドロキシル（-OH）官能基がオキソクロム基として作用し、カルボニル（C=O）クロモフォアピークを577 nmの長波長側へシフトさせ、クロモゲン吸光度強度を増加させた[24]。興味深い点は、アルミニウムイオンを電解質溶液に添加しCV試験した後のARLD-5吸収図で、590 nm吸収波長での鋭いピークが見られ、固体電極表面でのARS-Al³⁺錯体形成が確認されたことである。Supianら[24]の研究では、ARS-Al³⁺錯体の最大吸収波長は488 nmで測定された。

センサー安定性

さらに、修飾電極上での0.2 μM Al³⁺の10回反復測定で、再現性のある電流と最大蛍光強度が得られ、相対標準偏差（R.S.D.）はそれぞれ2.5%と2.6%であった。また、同一手順で調製した6つの独立した修飾電極を用いてAl³⁺（0.2 μM）を決定し、（RSD）1.9%を示し、電気化学センサーの優れた繰り返し精度と再現性を実証した。長期および高柔軟性は、修飾ITO/PET電極を円筒状に90°曲げる試験を1ヶ月間で90回実施し、0.2 μM Al³⁺の電流応答を測定することで調査し、回収率96%となり、修飾柔軟電極の長寿命安定性を示した。

図13の結果は、アルミニウムイオン濃度変化に対する電気化学センサーの電気化学的・光学的応答変化を表し、このタイプセンサーの標的分子に対する電気化学的・光学的応答の完全かつ有意な適合を示している。

本研究の検出限界を先行研究と比較し、詳細は表3に示す。

表3にまとめた他の手法はASV技術ベースで、通常より長い検出時間と各測定での電極研磨ステップ繰り返しを必要とする。一方、本研究で設計した電気化学センサーはシンプルな設計システムであり、微量標的分子を定量的に精密検出する電気化学信号に加え、光学信号も持つ。分光蛍光光度試験での光学信号変化により、生物学者にとってセンサー応用が非常に便利となる。この設計構造は将来のバイオテクノロジー応用に非常に適していると考えられる。

結論

本研究では、新規柔軟ITO/PETベース電気化学センサーを設計・構築し、その表面をLbL積層法による（ARS/LDHs）_nマトリックスグリッドで修飾することで、Al³⁺検出用の感度・選択的センサーを得た。本研究結果は、LDHナノプレートレットと電気活性色素分子（ARS）のLbL積層が最大5サイクルまで、均一な形態とトポロジーを持つ導電性マトリックスネットワークを形成することを示した。最小シート抵抗と高い電気触媒機能は、LbL積層の第5サイクルで得られた。この電気化学センサーでは、電気化学的手法と光学的手法の両方で高感度にAl³⁺を検出でき、CVベース電気化学手法では蛍光ベース光学手法より低い検出限界10.1 nM、広い線形範囲[0.2〜120 μM]を達成した。電気化学手法がこのセンサーで光学手法の約2.27倍の感度を示したが、Al³⁺異なる濃度での明確な光学応答分解能があるため、光学応用はバイオテクノロジー診断のための生物学者の関心を引くであろう。