スクリーン印刷電極上に直接作製した迅速・低コストマイクロ流体電気化学センサによる超高感度PSA検出

要旨

市販のスクリーン印刷電極（SPE）上に、簡便、迅速、低コストなプロセスでマイクロ流体プラットフォームを直接作製する初の実証を行った。このデバイス（CASPE-MFD：市販SPEベースマイクロ流体デバイス）は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャンネルとガラスコートSPE基板を組み合わせる。ヒト血清中で、前立腺特異抗原（PSA）に対して検出限界（LOD）0.84 pg/mL（25.8 fM）、0.001-10 ng/mL範囲で優れた直線性を示す。このプラットフォームは、ポイントオブケア診断、環境モニタリング、食品安全性分析へのスケーラブルで低コストなソリューションを提供する。

背景

マイクロ流体システムは、ナノリットルからピコリットルの体積をマイクロメートルスケールのチャンネル内で操作し、高スループット、試薬効率の良い分析を可能にする。電気化学センサとの統合により、卓越した感度、迅速な応答、最小限の装置要件を実現し、現場バイオメディカル診断に理想的である。

電気化学読み出しはマイクロ流体と本質的に適合し、大型光学系を不要とし、製造を簡素化する。臨床ポイントオブケアデバイスで広く使用されているSPEとの相乗効果は、完全統合された使い捨てセンサプラットフォームを約束する。

本研究では、酸素プラズマ活性化によりPDMSマイクロチャンネルをガラスコートSPE上に接合してCASPE-MFDを作製した。リン酸緩衝液とヒト血清中で、クロノアンペロメトリー（CA）とスクエアウェーブボルタンメトリー（SWV）を用いてPSA定量を実施した。

a SU-8フォトリソグラフィによるPDMSマイクロチャンネル作製。b CASPE-MFDの組み立て：2つの金作用/対極と銀疑似参照電極を含むガラスコートSPEにPDMSチャンネルを接合。c 完成したCASPE-MFDの写真

材料と方法

試薬と材料

PSA、HRP標識抗PSA、ビオチン標識抗PSA、ストレプトアビジン磁性ビーズ、BSA、ヒドロキノン、Tween-20、H₂O₂、フェロセンカルボン酸を市販品（Petsec Energy Ltd.、Fisher Scientific、Sigma-Aldrich）から入手。PDMSプレポリマーと硬化剤をDow Corningから購入。すべての緩衝液は超純水（Millipore Milli-Q）で調製。

装置

蛍光イメージング：Olympus U-CMAD3。プラズマ洗浄：Harrick PDC-32G。電気化学測定：CHI 760Bポテンショスタット（3電極系：金作用/対極、銀疑似参照）。

マイクロ流体チップ作製

PDMSチャンネルを、SU-8 2075でコートしたシリコンウェハ上にパターニングし、UV露光、硬化。SPE基板をゾルゲル混合液（TEOS:MTES:エタノール:水=1:1:1:1）で薄いガラス層でコートし、65℃で一晩硬化。PDMSとSPE表面を30秒O₂プラズマで活性化後、アライメントと接合を行い、気密シールを形成。

クロノアンペロメトリー実験

pH 7.4 PBS（4.5 mMヒドロキノン、0.1 mM H₂O₂含有）で測定。CASPE-MFDを0.5 M H₂SO₄中で0.5-1.5 Vサイクリングで活性化。次に、磁性ビーズ共役抗PSA抗体50 µLを50 µL min⁻¹で導入、ブロッキング、PSAインキュベーション、HRP-抗PSA添加、最後に電気活性溶液を導入。銀疑似参照電極対-2.0 mVでクロノアンペロメトリーを実施し、30秒後の定常電流を記録。

結果と考察

デバイスキャラクタリゼーション

CASPE-MFDに注入した蛍光マイクロビーズが気泡なく均一にチャンネルを充填し、100 µL min⁻¹までの流量で堅牢な流体性能を確認（Figure 2）。

a SPE上の蛍光マイクロビーズ浸透。b 充填されたCASPE-MFDの明視野像。c 蛍光分布の拡大図

0.5 mMフェロセンカルボン酸でのサイクリックボルタンメトリーで可逆的電子移動（E_pa-E_pc=62 mV）と拡散制御キネティクス（i_pa∝√v）を確認。CASPE-MFDでの電流はバルク溶液と一致し、マイクロ流体構造が感度を損なわないことを示す（Figure 3）。

a 10-350 mV s⁻¹スキャンレートでのCV。b i_paとi_pcの√スキャンレートに対する検量線

PSA検出性能

クロノアンペロメトリー曲線（Figure 5a）は、PSA濃度（0-10 ng mL⁻¹）に対して単調な電流増加を示す。線形範囲（0.001-10 ng mL⁻¹）で回帰式I(µA)=14.87+3.927×log C_PSA（R²=0.9985）を得た。LOD 0.84 pg mL⁻¹は市販アッセイ（0.1 ng mL⁻¹）を100倍以上上回り、同等のマイクロ流体センサをも上回る。

スクエアウェーブボルタンメトリー（SWV）でも並行した結果が得られ、電気化学読み出しの堅牢性を確認（Figure 5c）。

a 0-10 ng mL⁻¹でのクロノアンペロメトリー。b 緩衝液（青）とヒト血清（赤）での検量線。c SWV曲線。d SWVの線形フィット（R²=0.9884）

選択性と実サンプル分析

ヒト血清中でも同一の直線性とLODを維持し、複雑な生物学的マトリックスとの適合性を実証。マトリックス成分による有意な干渉は観察されず、アッセイの選択性を裏付ける。

結論

CASPE-MFDは、低コスト製造、マイクロ流体制御、SPE電気化学を組み合わせ、携帯可能なフォーマットで超高感度PSA検出（<0.85 pg mL⁻¹）を実現する。その組み立て容易性、再現性、多重化の可能性は、がんバイオマーカー、電解質、核酸のポイントオブケア診断への有望なプラットフォームとなる。

略語

MFDs

マイクロ流体デバイス

CASPE-MFDs

スクリーン印刷電極ベースマイクロ流体デバイス

PDMS

ポリジメチルシロキサン

PSA

前立腺特異抗原

CA

クロノアンペロメトリー

SWV

スクエアウェーブボルタンメトリー

LOD

検出限界

HRP

ホースラディッシュペルオキシダーゼ

TEOS

テトラエトキシシラン

MTES

メチルトリエトキシシラン

BNP

B型ナトリウム利尿ペプチド