デュアルモードカーボンナノドットセンサによる過酸化水素の迅速・選択的検出

概要

過酸化水素（H₂O₂）は、グルコース/グルコースオキシダーゼ（GOD）反応など、オキシダーゼベースの酵素反応の重要な生成物である。したがって、生成されたH₂O₂を検出することで、さまざまな炭水化物とそれらのオキシダーゼの検出を達成することは非常に意義深い。本稿では、蛍光比色両モードでH₂O₂を選択的に検出できる新規デュアルモードナノセンサとして機能する、一種の二重発光カーボンナノドット（CDs）を報告する。デュアルモードナノセンサは、無修飾の二重発光CDsのみで確立され、CD溶液に異なる濃度のH₂O₂を添加すると、顕著な蛍光および比色変化が観測され、H₂O₂の肉眼検出を可能にする。ナノセンサのメカニズムは、H₂O₂由来のヒドロキシルラジカルなどの外部化学刺激がCDsの表面特性変化と凝集をもたらし、これらが発光と吸収を支配することに起因すると考えられる。構築されたデュアルモードナノセンサは良好な生体適合性とH₂O₂に対する高い選択性を示し、0.05–0.5 Mの線形検出範囲を持ち、14 mMという低濃度のH₂O₂検出を可能にする。

背景

蛍光カーボンナノドット（CDs）は、良好な生体適合性、低毒性、調整可能なフォトルミネッセンス（PL）、高量子収率などの独自の物理化学的特性により、広範な研究の注目を集めている。これらの特性により、CDsはバイオイメージング、バイオセンサ、発光デバイスなど、多岐にわたる分野で潜在的な応用が見出されている。さらに、アップコンバージョンとダウンコンバージョン能力、光ブリンクの欠如、有機染料や半導体量子ドット（QDs）と比較した高い光安定性により、CDsは蛍光増強または消光による蛍光ナノセンサ応用により適している。

過酸化水素（H₂O₂）は一般的な酸化剤の一種で、殺菌能力により医療用消毒剤として常用されている。また、H₂O₂はグルコース/グルコースオキシダーゼ（GOD）反応など、オキシダーゼベースの酵素反応の重要な生成物でもある。したがって、H₂O₂の検出を通じたセンシング戦略は、炭水化物とそれらのオキシダーゼの検出における有望なアプローチとして採用できる。この理由から、H₂O₂の検出は糖尿病などの炭水化物代謝に関わる疾患のモニタリングに利用できる。現在、H₂O₂の測定に基づくさまざまなグルコースセンサが多様な分析手法により開発されているが、従来のセンサシステムは主に電気伝導度、蛍光、比色変化などの単一信号に基づいている。近年、ナノテクノロジーの進歩、特に半導体QDsや新興カーボンベースナノ粒子などの蛍光ナノ粒子により、新規H₂O₂ナノセンサがもたらされている。Luらは、CdTe QDsとローダミンを組み合わせて二重発光マイクロハイブリッド（DEMBs）を開発し、H₂O₂生成をモニタリングすることでグルコースの比率蛍光検出を実現した。Zhangらは、CDsの蛍光消光を通じてH₂O₂に選択的かつ感度よく応答する蛍光ナノセンサを報告した。しかし、これらの研究は必然的に、高価な化学成分と重金属汚染という半導体ベースQDs固有の欠点を伴う。さらに、蛍光消光または色変化のいずれか単一信号読み出しに基づくナノセンサは、環境要因の変動や実験操作誤差により、アッセイ安定性が低い可能性がある。上記の考慮から、H₂O₂濃度変化に対して蛍光と溶液色が非常に感度よく応答する新種の蛍光CDsを開発し、これらのCDsに基づくデュアルモードナノセンサによって、CD溶液の蛍光と比色変化を同時に検査することで、H₂O₂を明確かつ感度よく検知し、肉眼検出の実現に資することを目指した。

本研究では、可視光下で暗赤色の溶液色を示し、365 nm紫外線照射下で二重蛍光発光（青色と緑色）を示す新規タイプのCDsを、シンプルかつ便利な方法で合成することに成功した。CDsは、クエン酸、尿素、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）をそれぞれ炭素源、窒素源、反応溶媒とする溶媒熱法で簡便に合成される。蛍光と溶液色はH₂O₂濃度変化に非常に敏感である。したがって、これらのCDsに基づくデュアルモードナノセンサにより、CD溶液の蛍光と比色変化を同時に検査することで、H₂O₂を明確かつ感度よく検知でき、肉眼検出の実現に資する。高価な装置を導入することなく、これらのCDsに基づくデュアルモードナノセンサを確立した。このセンシングシステムは、潜在的な操作誤差を効果的に回避し、測定信頼性を著しく向上させる可能性がある。さらに、CDベースナノセンサは良好な生体適合性と高い水溶性を持つため、インビボおよびインビトロでの血糖検出応用に有望である。

手法

CDsの合成

CDsは、クエン酸を炭素源、尿素を窒素源、DMFを共反応物とする溶媒熱法で調製した。典型的実験では、クエン酸（1 g）と尿素（2 g）を10 mL DMFに溶解した。溶液を25 mLポリ(テトラフルオロエチレン)ライニング付きオートクレーブに移し、160 °Cで4時間加熱した。反応後、オートクレーブを自然冷却して室温に戻した。暗赤色溶液が得られた。反応液5 mLを大量のエタノール25 mLに加えてCDsを沈殿させ、7500 rpmで30分遠心分離した。その後、沈殿物を透析して純粋なCDsを得た。調製されたCDsを回収し、60 °C、<1 Paの真空乾燥オーブンで12時間乾燥させた。その後、CDsを脱イオン水に再溶解し、0.75 mg mL⁻¹ CD溶液を作製して更なる研究に用いた。その後のH₂O₂処理CDsも同様の方法で回収・乾燥し、表面形態と構造特性のキャラクタリゼーションに用いた。

測定

CDsの表面形態は高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM、JEOL JSM-IT100）で評価した。CDsの構造特性はX線回折計（XRD、PA National X'Pert Pro）とマイクロラマン分光計（Renishaw RM 2000）で測定した。CDsの吸収スペクトルは日立U-3900 UV-Vis-NIR分光光度計で測定した。CDsの蛍光スペクトルは分光光度計（Hitachi F-7000）で測定した。CDsの蛍光量子収率は、校正済み積分球を備えたHoriba FL-322分光光度計で測定した。CDsの蛍光減衰曲線もHoriba FL-322で、405 nm NanoLED励起、450 nmと500 nmでの発光監視で測定した。CDsのフーリエ変換赤外分光（FTIR）はBio-Rad Excalibur分光計（Bruker Vector 22）で記録した。X線光電子分光（XPS）は、Mg励起源を用いたESCALAB MK II X線光電子分光計で記録した。

CDナノセンサの確立

H₂O₂検出のため、PBS緩衝液（pH = 7.4、25 °C）中でH₂O₂存在下のCDsの蛍光と吸収スペクトルを調べた。典型的実験では、異なる量のH₂O₂を蒸留水と混合し、その後0.75 mg mL⁻¹ CD溶液20 μLを、異なる濃度（0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 M）のH₂O₂溶液4 mLに注入した。その後、CDsをH₂O₂溶液に添加した後、写真、蛍光、吸収スペクトルを取得した。

CDベースナノセンサの選択性も評価した。CD溶液（20 μL、3.75 μg mL⁻¹）を様々な陽イオンと酸化剤（4 mL、0.1 M）と混合し、1分間振とうした。最後に、CDsをH₂O₂溶液に添加した後、UV-Vis吸収と蛍光スペクトルを記録した。

結果と考察

CDsのキャラクタリゼーション

調製されたCDsの形態は透過型電子顕微鏡（TEM）で測定した。図1aに示すように、CDsは良好に分散し、2.5–6.5 nmの均一なサイズ範囲、平均直径約5 nmを示す（追加ファイル1：図S1b）。また、HRTEM像（図1aのインセット）は、グラファイトの(100)面に一致する約0.21 nmの回折縞を示す。CDsのXRDパターン（図1b）は、グラファイト様炭素構造を持つ高度に無秩序な炭素原子に対応する、約23.4°の広いピークを示す。CDsのラマンスペクトル（図1c）は2つのバンドを示す：Dバンド（約1347 cm⁻¹、sp³混成炭素の不完全性と無秩序に起因する振動）とGバンド（約1577 cm⁻¹、二次元六方晶構造におけるsp²混成炭素のE_2g振動モードに関連）。CDsのFTIRスペクトル（図1d）は、3100–3600 cm⁻¹のO–H/N–H広い振動吸収帯、約1690–1610 cm⁻¹のC=O/C=C伸縮振動、約1350–1390 cm⁻¹のN–O伸縮振動を示す。これらのデータは、CDs表面に何らかの官能基が存在し、これらがCDsの高い親水性と水溶液中での安定性に重要な役割を果たす可能性を示唆する。

CDベースナノセンサのH₂O₂に対する蛍光振る舞いは、CD水溶液で測定し、図1eに示す。単一波長励起（365 nm）下で、CD溶液は非対称発光スペクトルを示し、450 nmと500 nmを中心とする二重発光蛍光バンド（青色と緑色の蛍光バンドに対応）でフィッティング可能である。CD溶液にH₂O₂を混合すると、青色バンドの強度低下が緑色バンドより大きい。その結果、H₂O₂添加後のCDsの励起-発光マトリックスの結果から、CDsの最強発光が450 nmから500 nmへシフトする（追加ファイル1：図S2）。その結果、365 nm紫外線照射下でCD溶液の蛍光色が青から緑へ変化する（図1eのインセット）。さらに、CD溶液はH₂O₂添加により同時に暗赤色から緑色への比色変化を経験する（図1fのインセット）。この色変化は、H₂O₂添加によるCD溶液中の約555 nmと595 nmの吸収帯強度の変化に帰属できる（図1f）。これらの結果は、CDsがH₂O₂検出用デュアルモードナノセンサとして使用可能であることを確認する。

センシングメカニズム

センシングメカニズムを調査するため、H₂O₂添加後のCDsの形態と蛍光特性もキャラクタリゼーションした。追加ファイル1：図S1aとS1cに示すように、H₂O₂をCD溶液に添加すると、30–60 nmサイズ範囲のCDs凝集が生じる。H₂O₂誘起CDs凝集は、正規化吸収スペクトル（追加ファイル1：図S3）でも明らかである；すなわち、可視領域でCDsの吸収帯が555 nmから595 nmへレッドシフトする。対応して、CD溶液の色は暗赤色から緑色へ変化し、CDsの分散状態が凝集状態へ移行する。CDsのH₂O₂添加前後のXRDスペクトル（図1bと追加ファイル1：図S4）はほとんど変化せず、CDsの結晶構造に変化がないことを示す。

H₂O₂添加による調製CDsの蛍光変化を蛍光スペクトルで調査した。励起-発光マトリックスは、H₂O₂添加によりCDsの発光中心が450 nmから500 nmへ変化することを示す（追加ファイル1：図S2）。図2aに示す、450 nmと500 nm発光におけるCDsの蛍光減衰曲線は、単一指数減衰関数で良好にフィッティングされ、平均寿命はそれぞれ7.96 nsと7.12 nsであった（365 nm励起下）。対照的に、H₂O₂処理後のCDsの蛍光減衰寿命は4.53 nsと4.83 nsに変化した（図2bと表1）。一方、CD溶液にH₂O₂を添加すると、PL量子収率（η_int）が5.5%から4.6%に変化した。蛍光寿命とPL量子収率の変化を考慮すると、CDsとH₂O₂の間で電荷移動（CT）が起こり、これがCDsのPLスペクトル変化のトリガーとなっていると結論づけられる。

CDsのFTIRとXPSスペクトルを測定し、H₂O₂による化学組成と環境変化の洞察を得た。H₂O₂添加前後のCDsのFTIRスペクトル（追加ファイル1：図S7）は、約1350–1390 cm⁻¹のN–O伸縮振動がH₂O₂添加で増加することを示し、これはXPSスペクトルの結果でも確認される。フルサーベイXPSスペクトル（追加ファイル1：図S8）から、H₂O₂処理前後のCDsのO/N比はそれぞれ1.57と3.85であった。O/N比の増加は、CDs中のNの結合状態がH₂O₂添加により変化することを示唆し、これは図2c, dに示す高分解能N1s XPSスペクトルと一致する。N1s XPSスペクトルの結果から、CDs中のグラファイトN含有量がH₂O₂添加で増加している。さらに、H₂O₂添加後のN1sスペクトルに407.3 eVのN–O状態の追加ピークが現れ、H₂O₂の導入がCDsの表面状態変化をもたらすことを明確に示している。すべての調査は、CDsの表面NフレームがH₂O₂添加によって変化しうることを示している。

先行研究では、CDsの発光バンドはNドープラジカルや尿素基などの表面状態に関連すると示唆されている。一方、これらの表面状態は外部の物理的または化学的刺激に敏感である。上記の光物理的および表面環境分析に基づき、H₂O₂導入による蛍光変化のメカニズムを提案する（図3）。調製CDsのエッジ状態は、共役ピロール型N基で構成される。このタイプのN状態は主に高エネルギー準位に局在している可能性がある。したがって、励起電子は高エネルギー準位の表面N状態に非放射的に緩和し、その後基底状態へ放射遷移し、450 nm付近の発光バンドを伴う。対照的に、H₂O₂とCDsの間の動的消光による電荷移動（CT）が生じるため、CD溶液の蛍光強度はわずかに低下する。これは先行報告と類似している。あるいは、H₂O₂由来のヒドロキシルラジカルの影響により、高エネルギー蛍光ラジカル（N状態関連）が低エネルギーN–O状態へ変換されると推測できる。したがって、励起電子は主に低エネルギーN–O状態から基底状態へ放射遷移し、500 nmの緑色発光バンドを伴う。これは450 nm蛍光の静的消光ももたらす。したがって、CDsの主要発光バンドは青色発光から緑色発光へ変化する可能性がある。

CDナノセンサの評価

上記のCDsの蛍光と比色振る舞いに基づき、CDsによるH₂O₂検出ナノセンサを開発した。提案センシングシステムは、水溶液中の適切な濃度のCDs（3.75 μg mL⁻¹、追加ファイル1：図S9）で構成され、CDsはこのシステムで比色と蛍光の両レポーターとして二重機能を果たす。

CD溶液ベースの提案ナノセンシングシステムを図4に示す。H₂O₂による蛍光と比色変化は肉眼で明確に視認可能である（図4c, f）、紫外線照射下では青から緑へ、日光照射下では暗赤から緑への一連の顕著な色変化が観測される。また、H₂O₂添加は蛍光と吸収スペクトルで定量的に表現できる（図4a, d）。図4aに示すように、H₂O₂濃度が0から2 Mに増加するにつれて、450 nmと500 nm中心の蛍光バンドは徐々に減少する。しかし、H₂O₂濃度増加により、450 nm（I₄₅₀）と500 nm（I₅₀₀）での蛍光強度減少の度合いが異なり、これはCD溶液の蛍光色変化（図4c）とよく一致する。したがって、500 nmでの蛍光強度と450 nmでの蛍光強度の比（I₅₀₀/I₄₅₀）をH₂O₂濃度モニタリングに選択した（図4a, b）。低い比は青色発光に関連し、高いI₅₀₀/I₄₅₀比では緑色蛍光が肉眼で観測される。この手法による線形検出範囲は0.05–0.5 M、線形相関R² = 0.987であった。同様に、555 nmと595 nmの吸収帯の不均一な減少により、CD溶液で比色変化が生じる。図4dに示すように、可視領域で吸収強度は減少するが、H₂O₂濃度増加により595 nm付近の吸収減少が555 nm付近より緩やかになる。したがって、595 nmでの吸収（A₅₉₅）と555 nmでの吸収（A₅₅₅）の比もH₂O₂濃度測定に使用できる。A₅₉₅/A₅₅₅比は0.05–2 Mで指数関数的に増加し、指数相関R² = 0.999、比色変化は0.05–0.25 MのH₂O₂濃度範囲で線形相関し、検出限界（LOD）は14 mMであった（追加ファイル1：図S11と表S1）。デュアルモードナノセンサは、GOD反応によるH₂O₂濃度が血漿中でミリモルオーダー（約10 mM）であることを考慮すると、臨床・医療要件を満たす適切な感度を持つ。さらに、デュアルモードナノセンサは固有の内部校正基準を持つため、強度変動などの外因性要因を排除でき、測定精度の向上に寄与する。

ナノセンサのH₂O₂に対する選択性を評価するため、Na⁺、K⁺、NH₄⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺などの一般的な陽イオンを用いて、同一条件下で干渉試験を実施した。図5a, bに示すように、様々な陽イオン存在下でのCDsの蛍光と比色変化を調査した。Na⁺、K⁺、NH₄⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺存在下では、I₅₀₀/I₄₅₀蛍光比とA₅₉₅/A₅₅₅吸収比はブランク試料と比較してわずかな変化のみを示し、これらの陽イオンはH₂O₂検出にほとんど干渉しないことを意味する。さらに、HNO₃、KClO₃、FeCl₃、NaClO、K₂Cr₂O₇、KMnO₄などの他の酸化剤とのCDsへの影響も比較した（図5c, dと追加ファイル1：図S12, S13）。これらの酸化剤添加では、K₂Cr₂O₇とKMnO₄を除き蛍光色が青から緑へ変化した。したがって、蛍光変化によりK₂Cr₂O₇とKMnO₄の干渉を除外できる。また、A₅₉₅/A₅₅₅吸収比の結果から、HNO₃、KClO₃、FeCl₃、NaClOなどの他の酸化剤の影響も容易に除外できる。したがって、本論文で示したデュアルモードナノセンサは、2つの独立した検出法の相乗効果により、非常に高い選択性での決定に有望である。さらに、H₂O₂添加時の蛍光変化応答時間を測定し、H₂O₂注入後に蛍光が減少し、約3.3秒で安定することを見出した（追加ファイル1：図S14）。

A549細胞の生存率を、標準的なCCK-8アッセイで評価し、CDsの細胞毒性を調べた。図6に示すように、CDs濃度500 μg mL⁻¹のような高濃度でも、48時間インキュベーション後にA549細胞の生存率が約80%得られた。GraphPad Prism 5.0による計算では、CDsの50%阻害濃度（IC50）は約1106 μg mL⁻¹であり、CDsは高濃度でも良好な生体適合性と非常に低い細胞毒性を持つと推測される。さらに、先行報告されたH₂O₂決定用ナノセンサの分析性能を比較した（追加ファイル1：表S2）。CDベースデュアルモードナノセンサの生体適合性、簡便性、可視化検出は、これらの報告されたH₂O₂アッセイの大半と同等かそれ以上である。CDベースデュアルモードナノセンサがH₂O₂検出に良好な選択性を持ち、血糖と同オーダーの適切な検出限界（LOD = 14 mM）、高濃度CDsでも非常に低い細胞毒性を持つことを考慮すると、これらのナノセンサは血糖検査やその他の臨床要件への使用に有望である。

結論

結論として、H₂O₂導入によるCD溶液の蛍光と比色変化に基づき、比色と蛍光の両出力を持つCDsベースのデュアルモードナノセンサを、H₂O₂の定量検出のために提案する。ナノセンサはシンプルかつ容易で、H₂O₂の肉眼検出を可能にする。ナノセンサのメカニズムは、H₂O₂由来のヒドロキシルラジカルなどの外部化学刺激がCDsの表面特性変化と凝集をもたらし、これらが発光と吸収を支配することに起因すると考えられる。提案ナノセンサは良好な生体適合性、H₂O₂に対する高い選択性、0.05–0.5 Mの線形検出範囲、約14 mMの検出限界を示し、これはGOD反応で生成されるH₂O₂レベルと比較可能である。本論文で報告された戦略が、血糖検出用新規センサの開発に有望なアプローチを提供し、疾病診断と環境検査で価値があると信じられる。