短波赤外領域で発光するナノプローブのハイパースペクトル多重化生物学的イメージング

はじめに

生物医学画像技術はここ数十年で急速に発展しており、さまざまな病気や病状の早期発見と評価を可能にしています。さまざまなイメージングモダリティの中で、光学イメージングは​​、その高い空間的および時間的解像度と比較的低コストのために独自の位置を占めています。フォトルミネッセンス（またはより具体的には蛍光）に基づく複数の光学イメージングアプローチが開発中であり、臨床的に翻訳されています。たとえば、リンパ系イメージングと術中蛍光イメージングガイド下手術は、ヘルスケアを進歩させるための有望な結果を示しています[1、2]。一方、特定の関心領域（腫瘍など）を標的とする外因性フォトルミネッセンスプローブは、invivoおよびexvivoイメージング用に積極的に開発されています。フォトルミネッセンス（PL）プローブの通常の要件（つまり、高吸光度、発光量子収率、および光安定性）に加えて、PL発光のスペクトル位置と形状も考慮する必要のある重要なパラメーターです。生体組織による光の減衰は、可視領域よりも近赤外（NIR）スペクトル範囲（〜700–950 nm）で低いことが知られているため、生体組織のNIR透明ウィンドウ（〜700– 950 nm）が導入され、NIR発光プローブの開発と応用に多くの努力が注がれています[3,4,5,6]。さらに、最近の進歩により、スペクトル範囲が約1000〜1700 nmの2番目と3番目のNIRウィンドウ（NIR-IIおよびNIR-III）が導入されました。これは、特に短波赤外線（SWIR）と呼ばれることがよくあります。急速に発展している赤外線イメージング分野のメーカー[7,8,9]。従来のNIRウィンドウと比較してSWIR範囲での吸水率が高いにもかかわらず、生体組織の自家蛍光と散乱が低いため、SWIRPLバイオイメージングで優れたイメージング解像度とより高いイメージング深度が可能になります[10、11、12]。たとえば、リンパ管および脳血管系のSWIR PLイメージングでは、新規SWIR蛍光色素CH1055-PEGを使用して、NIR-I蛍光色素であるインドシアニングリーンを使用した従来のNIRPLイメージングと比較して解像度と信号対バックグラウンド比が優れていることが示されました。 [13]。さらに、SWIR放出ナノプローブ（単層カーボンナノチューブ）とSWIRイメージングカメラを使用することで、Daiのグループは、マウスの脳血管系の非侵襲的（開頭術なし）イメージングで、深さ> 2mmのサブ10μm血管を視覚化することができました。これは、可視またはNIR-I範囲のPLイメージングにはアクセスできません[8]。

最初のNIRウィンドウで強い吸収を示し、NIR-IIウィンドウで蛍光を発する有機色素および色素複合体は、有望なNIR-SWIRプローブと見なすことができます。それらは、血管系およびリンパ節の画像化、腫瘍の描写、および画像誘導手術のための優れた造影剤として機能することが示されました[13、14、15、16]。有機染料インドシアニングリーン（ICG）は、米国食品医薬品局によって現在ヒトでの使用が承認されている唯一のNIR蛍光造影剤であることに注意してください[17]。同時に、分子イメージングプローブ（すなわち、色素または色素複合体）には、バイオプローブの特性（水溶性、細胞透過性など）を変更したり、他のイメージングを提供したりするために分子構造を変更する必要性に関連する制限があります。モダリティをターゲットにします。対照的に、PL中心を含むナノ粒子（NP）は、水の分散性と安定性の向上、表面電荷の制御、またはターゲティングの目的で、表面をさまざまな部分で共有結合的に修飾することができます。さらに、NIR-SWIR PLナノプラットフォームの導入により、PLイメージングを他のイメージング、診断、または治療モダリティと組み合わせることができます。最近の研究では、生体内のさまざまなプロセスを監視するために使用されるSWIR放出ナノ製剤を使用した深部組織、全身、腫瘍、または経頭蓋イメージングが報告されています[14、18、19、20、21]。報告されているさまざまなinvivoイメージング用のNIR-SWIR発光ナノプローブの中で、2つのタイプを区別できます。有機部分（共役ポリマー）またはセラミック（フッ化物）ナノ結晶から生じるNIR-SWIR蛍光で、希土類イオンがドープされています。ポリマーベースのナノ粒子（PNP）は、合成と化学的機能化が比較的容易であり、優れた生体適合性と生分解性があるため、臨床翻訳で最も成功しているナノメディシンの1つです[22]。 NIR-SWIRフルオロフォアを搭載した場合、PNPは有望なイメージングプローブまたはイメージングガイドドラッグデリバリービヒクルとして機能します[23、24]。一方、希土類イオンドープナノ粒子（RENP）は、よく知られているクラスのナノプローブであり、アップコンバージョン（ストークスシフト防止）プロセスとダウンコンバージョン（ストークスシフト）プロセスの両方でアクセスできる独自のフォトルミネッセンス特性を備えています。 [25、26、27、28、29、30]。最近、RENPはNIR-SWIRイメージングで使用するために翻訳されました。有機部分ベースのNIR-SWIRプローブとは対照的に、それらは高い量子収率、並外れた光安定性、およびさまざまなイオンのドーピングによって調整できるNIR-SWIRスペクトル領域全体での狭い発光バンドを備えています[20、31、32]。 RENPは、小動物の血管系および臓器のイメージング、腫瘍の検出、多重化、およびマルチスペクトルのイメージングに適用されました[3、19、20、33、34、35]。

PLバイオイメージングの新たな開発に伴い、in vivoでいくつかのPL部分を同時に追跡する機能が、さまざまな目的で必要になる可能性があります（たとえば、選択した細胞または臓器のターゲットイメージングとイメージングガイドドラッグデリバリー）。この課題に対処するために、多重イメージング法が開発されました。マルチプレックスイメージングとは、イメージングされた生物学的システムにおける解剖学的および機能的情報の相補性を指します。そのアプリケーションは、イメージングバイオマーカー、コントラスト、およびモダリティの組み合わせを可能にして、研究および診療所アプリケーションでのイメージングの有用性を高めることができます[36]。マルチプレックスPLイメージングは​​、ナノメディシンの治療的側面を強化し、治療法とともにいくつかのPLイメージングコントラストを導入する機能を提供します。最も一般的に使用される多重イメージング法は、適切な光学フィルターを使用して、PL発光のスペクトル位置によってPLプローブを区別します[37、38、39]。ただし、このようなアプローチで適切に多重化するには、スペクトルが狭く、重複しないPLスペクトルを持つナノプローブを利用する必要があります。この点で、スペクトル混合分析アルゴリズムと組み合わせたハイパースペクトルイメージング（HSI）は、PL多重化の有望なツールです。ただし、PL HSIの生物医学的用途は、さまざまなタイプのナノプローブを多重化し、バックグラウンドと自家蛍光を排除するために、主に蛍光顕微鏡に限定されています[40、41]。インビボHSIに関しては、組織反射スペクトルの取得と逐次分析を通じて反射イメージングモードで最も頻繁に使用されます[42]が、インビボでのHSIイメージング（マルチスペクトルイメージングとも呼ばれる）は、可視のPLについても報告されています。およびNIR範囲[3、5]。ただし、SWIRを放出するナノプローブのHSIに関する報告は文献に見つかりませんでした。

最近、SWIRPLイメージング用のスペクトルアンミキシングソフトウェアと組み合わせたバンドシーケンシャルHSIシステムの開発を報告しました[43]。バンドシーケンシャルHSI手順は、スペクトル的に変化する透過率を持つ要素（つまり、液晶調整可能フィルター、LCTF）を介した2D画像の連続取得に基づいていました。 RENP懸濁液から得られたSWIRPLデータは、2つの空間次元と1つのスペクトル次元を含む3次元スペクトルデータキューブ（ハイパーキューブ）として提示されました。取得した超立方体のすべての空間ピクセルにスペクトルアンミキシング手順をさらに適用すると、PL混合成分の存在量の計算が可能になります。ここでは、in vivo SWIRPLバイオイメージングのためのナノプローブの多重化に対処するためにHSIを適用しました。スペクトルが重なっており、スペクトルプロファイルが異なるにもかかわらず、光学フィルターを使用した従来のPLイメージングでは簡単に区別できない2種類のSWIR放出ナノ粒子を使用しました。図1は、これらのナノ粒子からのPLのスペクトル混合の問題と、HSIとのバンドシーケンシャルアンミキシングを使用してそれを克服する方法を示しています。

フォトルミネッセンスナノプローブを多重化するためのHSIの適用を示すスキーム

HSIは、両方のタイプのナノ粒子のスペクトル選択性と感度の高いPLイメージングを取得するために適用されました。 SWIR PLスペクトルプロファイルをアンミキシングするために、アンミキシングプロトコルが開発されました。これにより、存在量に加えて強度分布を決定しながら、混合物中の成分の定量的および空間的マッピングを取得できます。 SWIR HSI技術と開発された混合解除プロトコルは、ナノ粒子を皮下注射したマウスのin vivoイメージングにさらに適用され、invivoイメージングでSWIRPLナノプローブを多重化するHSIの適用性を実証しました。

メソッド

ナノ製剤の準備と特性評価

有機蛍光NIR-SWIR色素をロードした高分子コアシェルナノ粒子の合成

ポリスチレン（PS）-ポリ- N -イソプロピルアクリルアミド（PNIPAM）コアシェルナノ粒子は、前述の方法を変更して、マイクロエマルジョン重合によって合成されました[44、45]。まず、PS-co-PNIPAM（PNIPAMの10 wt。％）コアナノ粒子を次のように調製しました。 NIPAM（0.1 g）、ドデシル硫酸ナトリウムSDS（0.1 g）、および0.005gのNaH ₂ PO ₄ ×H ₂ Oを45mlのH ₂ に溶解しました。 O.スチレン（1 g）を激しく攪拌しながら、温度を60℃に上げたときに滴下した。次のステップでArを30分間混合物にバブリングしたとき、温度を70°Cに上げ、0.08gのK ₂ S ₂ O ₈ 1mlのH ₂ に溶解 重合を開始するためにOを注入した。次に、PNIPAMシェルがPS-co-PNIPAMコアに階層化されました。この目的のために、反応器にモノマーNIPAM（1.8 g）と架橋剤 N の水溶液を加えました。 、 N 4 mlH ₂ 中の '-メチレンビスアクリルアミド（BIS）（0.18 g） O注射器を使用します。反応を70℃で4時間継続させた。混合物を室温に冷却し、MWCO 3500Daのセルロース膜を使用して74時間透析した。その結果、PS-PNIPAMナノ粒子の懸濁液が製造されました。ナノ粒子のコアシェル構造は、透過型電子顕微鏡（TEM）画像によって明確に示されます（図3a）。 NIR-SWIR蛍光PNPを得るために、2-ブチル-6- [5-（2-ブチル-1,3-ジメチルシクロヘプタ[c]ピロール-6（2H）-イリデン）ペンタ-1,3-ジエン-1-イル] -1,3-ジメチルシクロヘプタ[c]ピロリウムテトラフルオロボレート（JB9-08と表示）蛍光色素[46]をPS-PNIPAMナノ粒子にポストロード[47]しました。 8マイクロリットルのDMF中の1mM JB9-08染料溶液を、2mLの0.25wt％PNPs水懸濁液に添加し、使用前に24時間保持しました。

コアシェルRENPの合成

RENPは、他の場所で報告されている修正されたプロトコルに従って合成されました[48]。まず、α-NaYF ₄ ：10％Yb ³⁺ 、30％Nd ³⁺ コアナノ粒子は、高温での金属トリフルオロアセテートの分解によって調製されました。典型的な手順では、0.05 mmol Yb ₂ O ₃ 、0.15 mmol Nd ₂ O _3、 および0.25mmolY ₂ O ₃ 5mlの脱イオン水と5mlのTFAを含む250mlのフラスコにロードし、90°Cで1時間加熱して透明な溶液を生成しました。得られた透明な溶液をこの温度でアルゴンパージ下で蒸発させて、濁った粉末のRE（TFA） ₃ を得た。 。続いて、8 ml OA、8 ml OM、12 ml ODE、および2 mmolNaTFAをフラスコに加えました。溶液を120℃に加熱し、その温度で30分間保持した後、300℃まで30分間加熱した後、自然に室温まで冷却しました。アルゴン環境は、合成プロセス全体を通して適用されたままでした。得られたナノ粒子は、冷却した反応フラスコに20mLのエタノールを加えることによって沈殿させました。エタノールで3回遠心洗浄した後、収集した白色粉末を最終的に10mlのヘキサンに分散させてさらに使用しました。

第二に、α-NaYF ₄ ：10％Yb ³⁺ 、30％Nd ³⁺ @CaF ₂ コアシェルRENPは、α-NaYF ₄ の使用を含む、シードを介したエピタキシャル成長プロセスによって調製されました。 ：10％Yb ³⁺ 、x％Nd ³⁺ シードとしてのコアとそれに対応するシェル前駆体溶液の成長。シェル前駆体を調製するには、まず、5mlの脱イオン水と5mlのTFAを含む2mmolのCaOを250mlのフラスコに加え、90°Cで1時間加熱して透明な溶液を生成しました。次に、この溶液をこの温度で蒸発させて、トリフルオロ酢酸カルシウムのシェル前駆体（Ca（TFA） ₂ ）。次に、0.5 mmol NaYF ₄ ：10％Yb ³⁺ 、30％Nd ³⁺ コアナノ粒子、7 mlOA、および7mlODEをすべてフラスコに加えました。次に、溶液を120℃で30分間加熱し、続いて300℃で60分間加熱してから自然に冷却した。全プロセスは、アルゴン環境下で実施された。得られたコアシェルナノ粒子は、冷却した反応フラスコに20mLのエタノールを加えることによって沈殿させました。エタノールで3回遠心洗浄した後、収集したコアシェルNPを最終的に10mlのヘキサンに分散させてさらに使用しました。水性分散液の調製のために、調製されたα-NaYF ₄ ：10％Yb ³⁺ 、30％Nd ³⁺ @CaF ₂ コアシェルRENP（5 mLヘキサン分散液）を最初に5 mL N と混合しました 、 N -ニトロソニウムテトラフルオロボレート（NOBF ₄ ）のジメチルホルムアミド（DMF）溶液 ）（0.1 M）室温で。 RENPの沈殿が観察されるまで、混合物を穏やかに振とうしました。続いて、トルエンとヘキサン（1：1、容量）を混合物に加え、10000rpmで10分間遠心分離しました。沈殿物を収集し、5mLのDMFに分散させました。次に、250 mgのポリ（アクリル酸）（PAA、MW =18,000）をNOBF ₄ の5mLDMF溶液に添加しました。 80°Cに加熱し、激しく攪拌しながらこの温度で30分間保持した処理済みRENP。その後、アセトンを加えてNPを沈殿させ、エタノールで洗浄し、最後に蒸留水に分散させました。

透過型電子顕微鏡

PNPとRENPの形態は、透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して評価されました。 TEMで画像化するために、10μLのナノ粒子懸濁液をformvarで安定化したカーボン支持フィルムに滴下しました。 PNPのコアシェル構造を視覚化するために、支持フィルムに滴下する前に、リンタングステン酸の1％水溶液でネガティブ染色しました。カーボン支持フィルムを風乾し、5μLの純水で洗浄しました。画像は、TEM（JEM-1230、JEOL）で100kVの加速電圧で動作することによって取得されました。

フォトルミネッセンス分光法

両方のタイプのナノ粒子のPLスペクトルは、NIR-SWIR範囲（Horiba）用のiHR320分光計を備えたFluorolog-3分光蛍光計を使用してNIRおよびSWIR範囲で測定されました。 808 nmで発光するファイバー結合レーザーダイオード（QSP-808-4、QPhotonics）を使用して、PNPおよびRENPからPLを励起しました。

ハイパースペクトルイメージングシステム

自家製SWIRHSIシステムは、バンドシーケンシャル取得方法（図2）を活用し、NIRカメラ（Xeva-1.7-320、Xenics、ベルギー）、集束光学系（TEC-M55MPW、Computar、米国）、および液晶調整可能フィルター（Varispec LNIR）を備えています。 20-HC-20、PerkinElmer、USA）分散要素として。このシステムの解像度は340×258ピクセルで、900〜1700nmのスペクトル範囲で動作します。システム内の照明源には、白熱灯（画像の位置合わせ、焦点合わせ、明視野イメージング用）と、レーザー電源（Laser Source 4308）を搭載した808 nmファイバー結合レーザーダイオード（QSP-808-4、QPhotonics、USA）が含まれます。 、Arroyo Instruments、USA）、PLイメージングにおけるPL励起用。スペクトルデータキューブの取得は、900〜1200nmの範囲で20nmのスペクトル幅のLCTF透過率を10nmのステップで順次調整し、対応する画像をキャプチャすることによって実行されました。 HSI取得中のNIRカメラの露光時間は200msに設定されました。サンプルのレーザー出力密度は〜100 mW / cm ² に固定されました。 。 NIR-SWIR範囲全体のPL画像を取得するために、LCTFは850 nmの長さのパスフィルター（Edmund Optics、米国）に置き換えられました。

NIR-SWIRハイパースペクトルイメージングシステムの概略図

スペクトルアンミキシングソフトウェア

得られたスペクトルデータキューブの解析のために、MATLAB環境を使用してスペクトルアンミキシングアルゴリズムを開発しました。すべてのピクセルのスペクトルは、既知の端成分の線形混合と見なされます：\（F \ left（\ lambda \ right）=\ sum \ Limits_i {a} _i {G} _i \ left（\ lambda \ right）\）、ここで F （λ ）-ピクセルスペクトル、 G _i — 端成分スペクトル、および a _i 端成分が豊富です。アンミキシングソフトウェアの目的は、取得したスペクトルデータキューブのすべてのピクセルで線形スペクトル混合分析（LSMA）の問題を解決することにより、既知の端成分の存在量を推定することです。仮に、 L はスペクトルバンドの数であり、 p 混合物に存在する端成分の数です。次に、LSMAの問題は F と表現できます。 = Ga + n 、ここで F L です ピクセル強度の×1ベクトル、 G L です × p すべての端成分ベクトルを含む行列、 a p です 未知の存在量の×1ベクトル、および n L です ×1エラーベクトル。 LSMA問題を解決するための最小二乗誤差（LSE）ベースの方法は、次の最適化タスクとして形成できます。min _a {（ F − Ga ） ^T （ F − Ga ）}であり、古典的な解決策は a （ r ）=（ G ^T G ） ^-1 G ^T F 。ただし、このようなソリューションには、物理​​的な意味を持たない存在量の負の値が含まれている場合があります。この障害を解決するには、LSE最適化タスクを変更する必要があります：min _a {（ F − Ga ） ^T （ F − Ga ）}、 a の対象 ≥0。このタスクを解決するために、[49、50]で詳細に説明されている非負性制約付き線形スペクトル混合分析（NC-LSMA）に基づく反復アルゴリズムを利用します。すべてのコンポーネントの存在量を計算した後、それらは2Dカラーマップグラフとしてマッピングされます。最後に、アンミキシングソフトウェアは、取得された存在量に基づいて、対応するコンポーネントの強度画像を生成します。 {\ lambda} {G} _i \ left（\ lambda \ right）\）、ここで I _i （ x 、 y ）— i の積分強度 -ピクセル単位の端成分、および a _i （ x 、 y ）— i -豊富さ。

動物実験

BALB / cヌードマウス（出典：米国ジャクソン研究所）は、小動物施設で暗所および無菌条件下で飼育されました。すべての動物実験は、実験動物の世話と使用に関する中国の国家規制の基準に従って実施されました。イメージングの前に、オスのヌードマウス（6週齢、20±2 g）を腹腔内注射により5％抱水クロラール（マウス体重1グラムあたり0.06 ml）で麻酔しました。インビボでのSWIRPLイメージングでは、ナノ粒子を10倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁し、PNP、RENP、またはそれらの混合物の各PBS懸濁液100μLをマウスに皮下注射しました。

結果と考察

2種類のSWIRフォトルミネッセンスNPをHSIで使用するために準備しました。（1）水溶液中で実質的に非蛍光性であるJB9-08色素をポストロードしたPNP [46]ですが、私たち[51]が示すように、 PNPの高分子マトリックス（図3aおよびb）および（2）PAAでコーティングされたNaYF ₄ へのポストローディングによる水中での蛍光 ：10％Yb ³⁺ 、30％Nd ³⁺ @CaF ₂ コアシェル希土類イオンドープナノ粒子（RENP、図3cおよびd）。 Nd ³⁺ RENPのコアにあるイオンは、〜808 nmの光（ ⁴ ）で励起できます。 I _9/2 → ⁴ F _5/2 遷移）およびエネルギーをYb ³⁺ に転送します イオンは、950〜1100 nmの範囲で放出され、ピークは〜975 nm（ ² ）です。 F _5/2 → ² F _7/2 遷移）。 RENPsコアは不活性CaF ₂ でコーティングされていました 表面の欠陥や周囲の環境との相互作用による非放射損失を減らすためのシェル[48]。両方のナノ製剤は、808 nmの励起下で900〜1200の範囲のフォトルミネッセンスを示します（図3e）。

PNPおよびRENPの特性評価。 TEM画像（ a ）および概略構造（ b ）JB9-08色素をロードしたPNPの。 TEM画像（ c ）および概略構造（ d ）RENPの。 e 808nm励起下でのPNPs-JB9-08およびRENPs懸濁液の正規化されたPL発光スペクトル。スケールバー、100 nm

分光蛍光光度計で得られたナノ粒子のPL発光スペクトルは、2つの理由から、スペクトルアンミキシングソフトウェアの端成分として使用できないことに注意してください。まず、HSIシステムの感度は、従来の分光蛍光光度計とは異なり、スペクトル補正されていないため、取得される発光スペクトルプロファイルは2つの取得方法で異なります。次に、LCTFのスペクトル帯域幅は20 nmですが、HSIフレームは10nmステップで収集されます。その結果、隣接するフレームで信号がオーバーラップし、分光蛍光光度計で測定されたものと比較して、得られたスペクトルプロファイルの歪みが発生します。これらの障害を克服するために、端成分（PNPおよびRENPサンプルのスペクトルプロファイル）がHSIシステムで取得されました。この目的で、両方のタイプのナノプローブをPBSに懸濁し、それらのPBS懸濁液をマイクロ遠心チューブに入れました（図4a）。 PL発光スペクトルが重なっているため、従来のPLイメージングでは2つのサンプルを区別することはほとんど不可能です（図4bおよび3e）。 HSIシステムを使用して、10 nmステップで900〜1200 nmのスペクトル範囲で31枚のPL画像を収集しました（図4c）。 PNP、RENP、およびバックグラウンド（BG）のスペクトルプロファイルは、それぞれ赤、青、および緑の四角でマークされた領域の信号を平均することにより、スペクトルデータキューブのスペクトル次元から計算されました（図4b）。得られたPNPおよびRENPのスペクトルプロファイル（図4d）は、分光蛍光光度計で測定されたものと類似していることがわかり、後でスペクトルアンミキシングの端成分として使用されました。その後、PNP、RENP、およびBGスペクトルプロファイルを端成分として使用して、対応する成分の存在量が計算され、2Dカラーマッププロットとしてマッピングされます（図4e）。存在量は、超立方体のすべての空間ピクセルについて計算され、0から1までの値として表され、0と1は、それぞれコンポーネントの完全な不在と完全な存在量を示します。すべてのピクセルのすべてのコンポーネントの存在量の合計は1に等しいことに注意してください。アンミキシングソフトウェアは、信号の強度によるしきい値処理を使用して、低強度のピクセルによって引き起こされるエラーを排除しました。スペクトル次元に沿ったピクセルの最大強度がハイパーキューブ全体の最大値の5％未満である場合、そのようなピクセルはノイズ成分が完全に豊富であると見なされました。さらに、PNPとRENPの積分強度画像は、対応する存在量を考慮し、バックグラウンド成分を排除して計算されました（図4f）。予想通り、アバンダンスマッピングと積分強度画像の両方が、右チューブのPNPと左チューブのRENPの完全なアバンダンスを示していますが、PL発光散乱とアンミキシングアルゴリズムの不完全性によってわずかな誤差が生じています。

RENPおよびPNPを含むマイクロ遠心チューブのHSI。 a PBSに懸濁されたPNPおよびRENPを含むマイクロ遠心チューブの明視野画像。 b 808 nmで励起されたPNPおよびRENPサンプルのPL画像（画像取得には850 nmの長さのパスフィルターを使用）。 c HSIフレームで構成されるハイパーキューブを示すスキーム。 d b に示されているROIから平均化されたPNP、RENP、およびバックグラウンド（BG）のスペクトルプロファイル それぞれ、赤、青、緑の四角として。 e コンポーネントの豊富さのカラーマップ。 f PLコンポーネントの再構成された強度画像とPL /明視野マージ画像

スペクトルアンミキシングは、PNP、RENPの混合を区別することもできます。これを実証するために、3本のマイクロ遠心チューブにPNP、RENP、およびそれらの混合物の溶液を充填しました。超立方体とスペクトルアンミキシング手順の取得後、アバンダンスマッピングは、最初のマイクロ遠心チューブにPNPが完全に存在し、2番目にRENPが存在し、3番目に2つの混合物が存在することを示します（図5a）。強度画像の再構成をさらに実行して、標本内のPNPおよびRENPのPL信号の強度分布を明らかにしました（図5b）。

（左から右へ）RENP、PNP、および両方の混合物を含むマイクロ遠心チューブのHSI。 a 豊富なPNP、RENP、およびバックグラウンド（BG）。 b 再構成されたPL強度画像とPL /明視野マージ画像

さらに、生体内のSWIRPLイメージングでスペクトル的にオーバーラップしたナノプローブを多重化するHISメソッドの適用性を実証しました。ヌードマウスに麻酔をかけ、PNP、RENP、および2つの混合物を皮下注射した。長さ850nmのパスフィルターを使用したNIRイメージングでは、3つの区別できないフォトルミネッセンススポットが示されます（図6a）。 HSIと分析を実行した後、アバンダンスマッピングは、上部と下部の注入サイトでそれぞれPNPとRENPの完全なアバンダンスを示し、2つの混合物が左側の注入サイトで識別されました（図6b）。さらに、PL強度分布を取得するために、強度再構成が実行されました（図6c）。アンミキシングソフトウェアのしきい値を15％（経験的に推定）に調整することにより、放出スポットに隣接する領域のノイズを除去することが可能になりました（図6d）。このような結果は、ロングまたはバンドパス光学フィルターを使用する従来のPLイメージングモダリティとは異なり、HSIは標本内の強度分布をマッピングできるだけでなく、強度のスペクトルプロファイルを特定することによって混合物に存在する成分を多重化できることを示しています。画像のすべてのピクセル。

PNP（右上の注射部位）、RENP（右下）、およびRENP / PNP混合物（左）を皮下注射したマウスのHSI。 a 明視野（SWIR）、SWIR PL、および850nmの長さのパスエミッションフィルターで取得されたマージ画像。 b 豊富なPNP、RENP、およびバックグラウンド（BG）。 c 対応する再構成された強度画像。 d しきい値レベルが15％のアバンダンスから再構成されたPL強度画像と、PL /明視野マージ画像。

したがって、HSI取得とスペクトルアンミキシング処理の組み合わせは、スペクトル的にオーバーラップするSWIRPLナノプローブの多重イメージングを取得するためにこの作業に適用されました。ただし、HSIモダリティの適用性に関しては、いくつかの問題を考慮する必要があります。まず、スペクトル的に狭い取得のため、すべてのHSIフレームは比較的低い信号強度を処理します（特に、有機部分からのスペクトル的に広いPL発光の場合）。さらに、生物学的イメージングにおけるPL励起レーザー出力の増加は、組織損傷（または光毒性）の危険性によって制限されます。これにより、HSIは従来のPLイメージングと比較して桁違いに長い取得時間を必要とする可能性があるため、PLプローブの輝度とその光安定性に対する要件が高くなります。線形混合分析およびスペクトルアンミキシングアルゴリズムは、組織透過率があまり変化しないスペクトル範囲での生体組織の多重化PLイメージングに十分に機能することにも注意する必要があります。対照的に、組織の透過率がHSIのスペクトル範囲に特有の特徴を持っている場合、線形スペクトル混合モデルはほとんど適用できない可能性があり（特により深い組織の場合）、非線形モデルを検討できます。

結論

結論として、ハイパースペクトルSWIRバイオイメージング技術を開発し、SWIRスペクトル範囲で発光するナノ粒子の多重化に適用しました。従来のイメージングでは区別できない、重複するPLスペクトルを持つ2種類のナノ粒子は、線形スペクトル混合分析アルゴリズムとともにハイパースペクトル取得を使用して、PLスペクトルプロファイルによって正常に多重化されました。開発された方法は、サンプル懸濁液と小動物への注入の両方でSWIRPLナノ粒子の多重イメージングにうまく採用されました。 SWIRバイオイメージングは​​、より高いイメージング深度で優れた解像度を備えているため、SWIR HSIアプローチは、NIR-SWIRPLナノプローブを使用した多重イメージングを必要とするさまざまなアプリケーションでの使用に大きな可能性を秘めています。さらに、SWIRバイオイメージングは​​非常に初期の段階であるため、HSIと組み合わせたPLプローブの生物医学的応用を開発する余地は十分にあります。

データと資料の可用性

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略語

BG：

背景

HSI：

ハイパースペクトルイメージング

LCTF：

液晶チューナブルフィルター

NIR：

近赤外線

NP：

ナノ粒子

PL：

フォトルミネッセンス

PNIPAM：

ポリ- N -イソプロピルアクリルアミド

PNP：

高分子ナノ粒子

PS：

ポリスチレン

RENP：

希土類ドープフッ化物ナノ粒子

SWIR：

短波赤外線

TEM：

透過型電子顕微鏡