生物システムにおける短波長赤外ナノプローブの多重検出を実現する高度なハイパースペクトルイメージング技術

概要

外因性発光プローブを用いた短波長赤外（SWIR、約1000–1700 nm）領域での光学バイオイメージングは急速に発展しており、複数のSWIR発光ナノプローブの開発が報告されています。ハイパースペクトルイメージング（HSI）とアンミキシングアルゴリズムの組み合わせは、ナノエージェントの光ルミネセンス（PL）スペクトルプロファイルに基づく効率的な多重化を可能にする有望なツールです。本研究で報告するSWIR HSI技術は、有機色素ドープ高分子ナノ粒子（PNPs）と希土類ドープフッ化物ナノ粒子（RENPs）という2種類のナノプローブを多重化するために開発されました。両ナノプローブは同じスペクトル範囲（約900–1200 nm）でPLを示すため、光学フィルターによるスペクトル分離が困難で、生体組織での多重イメージングの可能性が制限されていました。SWIR HSIを適用することで、PLスペクトルプロファイルの差異を利用し、各ナノ粒子タイプからのPL信号をスペクトル選択的かつ高感度にイメージングすることに成功しました。取得データのアンミキシングにより、スペクトル重複するナノプローブをPLプロファイルで多重化し、混合懸濁液中の各ナノ粒子の定量的・空間的分布を取得しました。さらに、開発したSWIR HSI技術とアンミキシングプロトコルを、PNPsとRENPsを皮下投与したマウスのin vivoイメージングに適用し、ハイパースペクトル技術によるナノプローブのin vivo多重化の適用可能性を実証しました。

はじめに

生体医用イメージング技術は近年急速に発展し、様々な疾病や病理の早期発見・評価を可能にしています。中でも光学イメージングは、高い空間・時間分解能と比較的低コストという独自の利点を持っています。光ルミネセンス（特に蛍光）に基づく複数の光学イメージング手法が開発・臨床応用されており、リンパ系イメージングや術中蛍光ガイド手術などが医療の進歩に寄与しています。一方、特定の領域（腫瘍など）を標的とする外因性発光プローブもin vivoおよびex vivoイメージング向けに活発に開発されています。PLプローブには高吸収、高発光量子収率、光安定性といった一般的要件に加え、PL発光のスペクトル位置と形状も重要なパラメータです。生体組織による光減衰は可視光より近赤外（NIR、約700–950 nm）領域で低いため、NIR透過ウィンドウ（約700–950 nm）が知られ、NIR発光プローブの開発・応用に多くの努力が注がれてきました。さらに近年の進歩により、第2および第3のNIRウィンドウ（NIR-II、NIR-III）が約1000–1700 nmのスペクトル範囲で導入され、この領域は短波長赤外（SWIR）と呼ばれ、赤外イメージング分野の急速な発展に伴い特にメーカー側で用いられるようになりました。SWIR領域では従来のNIRウィンドウより水吸収が高いものの、生体組織の自己蛍光と散乱が低いため、SWIR PLバイオイメージングでは優れた分解能とより深いイメージング深度が得られます。例えば、新規SWIR蛍光色素CH1055-PEGを用いたリンパ管および脳血管のSWIR PLイメージングでは、従来のNIR-I蛍光色素インドシアニングリーン（ICG）を用いたNIR PLイメージングと比較して、分解能と信号対背景比が優れていることが示されています。また、SWIR発光ナノプローブ（単層カーボンナノチューブ）とSWIRイメージングカメラを用いて、ダイグループは開頭術なしの非侵襲的マウス脳血管イメージングにおいて、深さ2 mm以上で10 μm未満の血管を可視化することに成功し、これは可視光やNIR-I領域のPLイメージングでは不可能でした。

第1 NIRウィンドウで強い吸収を持ち、NIR-IIウィンドウで蛍光を示す有機色素および色素複合体は、有望なNIR-SWIRプローブと見なされており、血管・リンパ節イメージング、腫瘍輪郭描出、イメージガイド手術のための優れた造影剤として機能することが示されています。なお、有機色素ICGは現在、米国FDAによってヒト使用承認された唯一のNIR蛍光造影剤です。一方、分子イメージングプローブ（色素や色素複合体）は、生物学的プローブ特性（水溶性、細胞透過性など）を変更したり、他のイメージング・標的機能を付与したりするために分子構造を修飾する必要があるという制約があります。対照的に、PL中心を含むナノ粒子（NPs）は、表面を様々な官能基で共有結合修飾することで、水分散性・安定性の向上、表面電荷の制御、標的化などが可能です。また、NIR-SWIR PLナノプラットフォームの導入により、PLイメージングを他のイメージング・診断・治療モダリティと組み合わせることができます。最近の研究では、in vivoでの様々なプロセス監視に用いられるSWIR発光ナノ製剤を用いた深層組織、全身、腫瘍、経頭蓋イメージングが報告されています。in vivoイメージング向けに報告されている様々なNIR-SWIR発光ナノプローブの中で、有機モイエティ（共役高分子など）由来のNIR-SWIR蛍光を持つタイプと、希土類イオンドープセラミック（フッ化物など）ナノ結晶由来のタイプの2種類が区別できます。高分子ベースナノ粒子（PNPs）は、合成と化学修飾の容易さ、優れた生体適合性と生分解性により、臨床翻訳で最も成功しているナノ医薬品の一つです。NIR-SWIR蛍光体をロードすると、PNPsは有望なイメージングプローブやイメージガイド薬物送達ビークルとして機能します。一方、希土類イオンドープナノ粒子（RENPs）は、アップコンバージョン（反ストークスシフト）とダウンコンバージョン（ストークスシフト）の両プロセスを通じてアクセス可能な独自の光ルミネセンス特性を持つよく知られたナノプローブクラスです。最近、RENPsはNIR-SWIRイメージング用に翻訳されています。有機モイエティベースのNIR-SWIRプローブと異なり、RENPsは高量子収率、例外的な光安定性、NIR-SWIR全スペクトル領域での狭い発光バンドを持ち、ドーピングイオンによって調整可能です。RENPsは小動物の血管・臓器イメージング、腫瘍検出、多重化・多スペクトルイメージングに応用されています。

PLバイオイメージングの発展に伴い、複数のPLモイエティをin vivoで同時に追跡する能力が、標的細胞・臓器のイメージングとイメージガイド薬物送達の併用など、様々な目的で求められるようになっています。この課題に対処するため、多重化イメージング手法が開発されました。多重化イメージングとは、イメージング対象の生物システムにおける解剖学的・機能的情報の補完性を指し、イメージングバイオマーカー、コントラスト、モダリティの組み合わせを可能にし、研究・臨床応用におけるイメージングの有用性を高めます。多重化PLイメージングは、複数のPLイメージングコントラストを治療モダリティとともに導入することを可能にし、ナノメディシンのセラノスティクス次元を拡張します。最も一般的な多重化イメージング手法は、PL発光のスペクトル位置によってPLプローブを区別し、適切な光学フィルターを用いるものです。しかし、このアプローチでの適切な多重化には、スペクトル的に狭く重ならないPLスペクトルを持つナノプローブの利用が必要です。この点で、ハイパースペクトルイメージング（HSI）とスペクトル混合分析アルゴリズムの組み合わせは、PL多重化のための有望なツールです。しかし、PL HSIの生体医用応用は主に蛍光顕微鏡に限られ、異なるタイプのナノプローブの多重化や背景・自己蛍光の除去に用いられてきました。in vivo HSIについては、組織反射スペクトルの取得・逐次解析による反射イメージングモードでの利用が最も頻繁ですが、可視光およびNIR領域でのPLを対象としたin vivo HSI（マルチスペクトルイメージングとも呼ばれる）も報告されています。しかし、SWIR発光ナノプローブのHSIに関する報告は文献上見当たりません。

最近、バンドシーケンシャルHSIシステムとスペクトルアンミキシングソフトウェアをSWIR PLイメージング向けに開発したと報告しました。バンドシーケンシャルHSI手順は、スペクトル透過率が可変な素子（液晶チューナブルフィルター、LCTF）を通じて2D画像を連続取得するものです。RENPs懸濁液から得られたSWIR PLデータは、2つの空間次元と1つのスペクトル次元からなる3次元スペクトルデータキューブ（ハイパーキューブ）として表現されます。取得したハイパーキューブの全空間ピクセルにスペクトルアンミキシング手順を適用することで、PL混合成分の存在量を計算できました。本研究では、in vivo SWIR PLバイオイメージングにおけるナノプローブの多重化にHSIを適用しました。スペクトル的に発光が重なる2種類のSWIR発光ナノ粒子を用いましたが、これらは異なるスペクトルプロファイルを持つにもかかわらず、光学フィルターを用いた従来のPLイメージングでは容易に区別できません。図1は、これらナノ粒子のPLスペクトル混合の問題と、バンドシーケンシャルアンミキシングによるHSIでの解決策を示しています。

HSIを適用し、両タイプのナノ粒子に対してスペクトル選択的かつ高感度なPLイメージングを取得しました。SWIR PLスペクトルプロファイルをアンミキシングするためのプロトコルを開発し、混合物中の各成分の定量的・空間的マッピングを、強度分布に加えて存在量として取得できるようにしました。開発したSWIR HSI技術とアンミキシングプロトコルを、ナノ粒子を皮下投与したマウスのin vivoイメージングにさらに適用し、SWIR PLナノプローブのin vivoイメージングにおけるHSIの多重化適用可能性を実証しました。

方法

ナノ製剤の調製と特性評価

有機蛍光NIR-SWIR色素をロードした高分子コア-シェルナノ粒子の合成

ポリスチレン（PS）-ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド（PNIPAM）コア-シェルナノ粒子を、従来法を改良したマイクロエマルション重合により合成しました。まず、PS-co-PNIPAM（PNIPAM 10 wt.%）コアナノ粒子を調製しました。NIPAM（0.1 g）、ドデシル硫酸ナトリウムSDS（0.1 g）、NaH₂PO₄·H₂O（0.005 g）を45 mlの水に溶解し、60°Cで激しく攪拌しながらスチレン（1 g）を滴下添加しました。アルゴンを30分間バブリングし、温度を70°Cに上げ、K₂S₂O₈（0.08 g）を1 mlの水に溶解して注入し重合を開始しました。次に、PNIPAMシェルをPS-co-PNIPAMコア上に層状に形成しました。モノマーNIPAM（1.8 g）と架橋剤N,N'-メチレンビスアクリルアミド（BIS、0.18 g）の水溶液（4 ml）をシリンジで反応器に添加し、70°Cで4時間反応を継続しました。室温まで冷却後、MWCO 3500 Daのセルロース膜で74時間透析を行い、PS-PNIPAMナノ粒子懸濁液を得ました。コア-シェル構造は透過型電子顕微鏡（TEM）画像で明確に確認できます（図3a）。NIR-SWIR蛍光PNPsを得るため、2-ブチル-6-[5-(2-ブチル-1,3-ジメチルシクロヘプタ[c]ピロール-6(2H)-イリデン)ペンタ-1,3-ジエン-1-イル]-1,3-ジメチルシクロヘプタ[c]ピロリウムテトラフルオロボレート（JB9-08と標記）蛍光色素を、ポストローディング法でPS-PNIPAMナノ粒子にロードしました。DMF中の1 mM JB9-08色素溶液8 μLを、0.25 wt% PNPs水懸濁液2 mLに添加し、使用前24時間保持しました。

コア-シェルRENPsの合成

RENPsは、別報の改良プロトコルに従って合成しました。まず、α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30%Nd³⁺コアナノ粒子を、金属トリフルオロアセテートの高温分解法で調製しました。典型的な手順では、Yb₂O₃（0.05 mmol）、Nd₂O₃（0.15 mmol）、Y₂O₃（0.25 mmol）を5 ml脱イオン水と5 ml TFAを含む250 mlフラスコに入れ、90°Cで1時間加熱して澄明溶液を得ました。この溶液をアルゴンパージ下で同温度で蒸発させ、泥状のRE(TFA)₃粉末を得ました。続いて、OA（8 ml）、OM（8 ml）、ODE（12 ml）、NaTFA（2 mmol）をフラスクに添加し、120°Cで30分、さらに300°Cで30分加熱後、自然冷却しました。全工程アルゴン雰囲気下で行いました。得られたナノ粒子をエタノール（20 ml）添加で沈殿させ、遠心洗浄（エタノール、3回）後、白色粉末を10 mlヘキサンに分散させました。

次に、α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30%Nd³⁺@CaF₂コア-シェルRENPsを、シード媒介エピタキシャル成長法で調製しました。α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, x%Nd³⁺コアをシードとし、対応するシェル前駆体溶液中で成長させます。シェル前駆体調製のため、CaO（2 mmol）に5 ml脱イオン水と5 ml TFAを加え、90°Cで1時間加熱して澄明溶液を得、同温度で蒸発させカルシウムトリフルオロアセテートCa(TFA)₂を得ました。NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30%Nd³⁺コアナノ粒子（0.5 mmol）、OA（7 ml）、ODE（7 ml）をフラスクに加え、120°Cで30分、300°Cで60分加熱後自然冷却しました。全工程アルゴン雰囲気下で行いました。得られたコア-シェルナノ粒子をエタノール（20 ml）で沈殿させ、遠心洗浄（エタノール、3回）後、コア-シェルNPsを10 mlヘキサンに分散させました。水性分散液調製のため、調製したα-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30%Nd³⁺@CaF₂コア-シェルRENPs（5 mlヘキサン分散液）を、ニトロソニウムテトラフルオロボレート（NOBF₄、0.1 M）のN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）溶液（5 ml）と室温で混合し、RENP沈殿が観察されるまで穏やかに振盪しました。トルエンとヘキサン（1:1、体積比）を添加し、10000 rpmで10分遠心分離しました。沈殿物を回収し、5 ml DMFに分散させました。次に、ポリ(アクリル酸)（PAA、MW = 18,000、250 mg）をNOBF₄処理RENPsの5 ml DMF溶液に添加し、80°Cで30分激しく攪拌しながら加熱しました。アセトン添加でNPsを沈殿させ、エタノールで洗浄後、蒸留水に分散させました。

透過型電子顕微鏡観察

PNPsとRENPsの形態を透過型電子顕微鏡（TEM）で評価しました。TEM観察のため、ナノ粒子懸濁液10 μLをフォルバールで安定化したカーボン支持膜上に滴下しました。PNPsのコア-シェル構造を可視化するため、リン酸タングステン酸1%水溶液で負の染色を行ってから支持膜上に滴下しました。カーボン支持膜を自然乾燥させ、純水5 μLで洗浄しました。加速電圧100 kVでTEM（JEM-1230、JEOL）を操作して画像を取得しました。

光ルミネセンス分光法

両タイプのナノ粒子のPLスペクトルを、NIRおよびSWIR領域で測定しました。iHR320分光器（NIR-SWIR領域用）を装備したFluorolog-3分光蛍光計（Horiba）を使用し、808 nm発光ファイバ結合レーザーダイオード（QSP-808-4、QPhotonics）でPNPsとRENPsのPLを励起しました。

ハイパースペクトルイメージングシステム

自作のSWIR HSIシステムはバンドシーケンシャル取得法を採用し（図2）、NIRカメラ（Xeva-1.7-320、Xenics、ベルギー）、フォーカシング光学系（TEC-M55MPW、Computar、米国）、液晶チューナブルフィルター（Varispec LNIR 20-HC-20、PerkinElmer、米国）を分散素子として含みます。システム解像度は340×258ピクセル、動作波長範囲は900–1700 nmです。照明源として、イメージアライメント・フォーカシング・明視野イメージング用の白熱灯と、PLイメージングでのPL励起用808 nmファイバ結合レーザーダイオード（QSP-808-4、QPhotonics、米国）、レーザー電源（Laser Source 4308、Arroyo Instruments、米国）を備えます。スペクトルデータキューブ取得は、LCTF透過率（スペクトル幅20 nm）を900–1200 nmの範囲で10 nmステップで順次チューニングし、対応する画像を取得することで行いました。HSI取得時のNIRカメラ露光時間は200 msに設定し、サンプル上のレーザー電力密度を約100 mW/cm²に固定しました。NIR-SWIR全域でのPL画像取得には、LCTFを850 nm長波長パスフィルター（Edmund Optics、米国）に置き換えました。

スペクトルアンミキシングソフトウェア

取得したスペクトルデータキューブの解析のため、MATLAB環境でスペクトルアンミキシングアルゴリズムを開発しました。全ピクセルのスペクトルを、既知のエンドメンバーの線形混合とみなします：\( F(\lambda) = \sum_i a_i G_i(\lambda) \)、ここで \( F(\lambda) \) はピクセルスペクトル、\( G_i \) はエンドメンバースペクトル、\( a_i \) はエンドメンバーの存在量です。アンミキシングソフトウェアの目的は、取得したスペクトルデータキューブの全空間ピクセルで線形スペクトル混合分析（LSMA）問題を解き、既知エンドメンバーの存在量を推定することです。\( L \) をスペクトルバンド数、\( p \) を混合物中のエンドメンバー数とすると、LSMA問題は \( \mathbf{F} = \mathbf{G}\mathbf{a} + \mathbf{n} \) と表せます。ここで \( \mathbf{F} \) は \( L \times 1 \) ピクセル強度ベクトル、\( \mathbf{G} \) は \( L \times p \) エンドメンバーベクトル行列、\( \mathbf{a} \) は \( p \times 1 \) 未知存在量ベクトル、\( \mathbf{n} \) は \( L \times 1 \) 誤差ベクトルです。最小二乗誤差（LSE）ベースのLSMA解法は、最適化問題 \( \min_{\mathbf{a}} \{ (\mathbf{F} - \mathbf{G}\mathbf{a})^T(\mathbf{F} - \mathbf{G}\mathbf{a}) \} \) として定式化され、古典的解は \( \mathbf{a}(\mathbf{r}) = (\mathbf{G}^T\mathbf{G})^{-1}\mathbf{G}^T\mathbf{F} \) となります。しかし、この解は存在量に負の値を含む可能性があり、物理的意味を持ちません。この障害を解決するため、LSE最適化問題を \( \mathbf{a} \ge 0 \) の制約下で修正します。このタスクを解くため、非負制約付き線形スペクトル混合分析（NC-LSMA）に基づく反復アルゴリズムを使用します（詳細は文献[49, 50]参照）。全成分の存在量計算後、それらを2Dカラーマップグラフとしてマッピングします。最終的に、アンミキシングソフトウェアは取得した存在量に基づき、対応する成分の強度画像を出力します：\( I_i(x,y) = a_i(x,y) \sum_\lambda G_i(\lambda) \)、ここで \( I_i(x,y) \) はピクセルにおけるi番目エンドメンバーの積分強度、\( a_i(x,y) \) はi番目の存在量です。

動物実験

BALB/cヌードマウス（出典：The Jackson Laboratory、米国）を、小動物施設内で暗黒無菌条件下で飼育しました。全動物実験は、中国の実験動物の飼育および使用に関する国家規定の基準に準拠して実施しました。イメージング前、雄性ヌードマウス（6週齢、20±2 g）を5%クロラールハイドレート（体重1 gあたり0.06 ml）で腹腔内投与し麻酔しました。SWIR PL in vivoイメージングのため、ナノ粒子を10倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁し、PNPs、RENPs、またはそれらの混合物のPBS懸濁液100 μLをマウスに皮下投与しました。

結果と考察

HSI用に2種類のSWIR光ルミネセンスNPsを調製しました：（1）JB9-08色素をポストローディングしたPNPs。JB9-08は水溶液中ではほぼ非蛍光ですが、PNPsの高分子マトリックスにポストローディングすることで水中で蛍光を回復することを示しました（図3a、b）。（2）PAAコートNaYF₄:10%Yb³⁺,30%Nd³⁺@CaF₂コア-シェル希土類イオンドープナノ粒子（RENPs、図3c、d）。RENPsコア中のNd³⁺イオンは約808 nm光で励起され（⁴I₉/₂ → ⁴F₅/₂遷移）、Yb³⁺イオンにエネルギー移動し、約975 nmでピークを持つ950–1100 nm領域で発光します（²F₅/₂ → ²F₇/₂遷移）。RENPsコアを不活性CaF₂シェルでコートし、表面欠陥や周囲環境との相互作用による非放射損失を低減しました。両ナノ製剤は808 nm励起下で900–1200 nm領域で光ルミネセンスを示します（図3e）。

分光蛍光計で測定したナノ粒子のPL発光スペクトルを、スペクトルアンミキシングソフトウェアのエンドメンバーとして使用することは、2つの理由でできません。第一に、HSIシステムの感度はスペクトル補正されておらず、従来の分光蛍光計とは異なるため、2つの取得方法で取得される発光スペクトルプロファイルが異なります。第二に、HSIフレームは10 nmステップで収集されますが、LCTFのスペクトル帯域幅は20 nmです。これにより隣接フレームで信号が重複し、分光蛍光計で測定したスペクトルプロファイルと比較して取得スペクトルプロファイルが歪みます。これらの障害を克服するため、エンドメンバー（PNPsとRENPsサンプルのスペクトルプロファイル）をHSIシステムで取得しました。両ナノプローブをPBSに懸濁し、マイクロ遠心チューブに入れました（図4a）。従来のPLイメージングでは、PL発光スペクトルが重複するため（図4b、図3e）、2サンプルを区別するのは困難です。HSIシステムを用い、900–1200 nmのスペクトル範囲で10 nmステップで31枚のPL画像を取得しました（図4c）。図4bの赤、青、緑の四角で示した領域の信号をスペクトル次元で平均化することで、PNPs、RENPs、背景（BG）のスペクトルプロファイルを算出しました。得られたPNPsとRENPsのスペクトルプロファイル（図4d）は分光蛍光計で測定したものと類似しており、後にスペクトルアンミキシングのエンドメンバーとして使用しました。以降、PNPs、RENPs、BGのスペクトルプロファイルをエンドメンバーとして、対応する成分存在量を計算し、2Dカラーマッププロットとしてマッピングしました（図4e）。存在量はハイパーキューブの全空間ピクセルで計算され、0から1の値で表され、0と1はそれぞれ成分の完全な不在と完全な存在を示します。全成分の存在量の和は全ピクセルで1になります。アンミキシングソフトウェアは、スペクトル次元でのピクセル最大強度がハイパーキューブ全体の最大値の5%未満の場合、そのピクセルをノイズ成分として完全存在とみなす閾値処理を用いて、低強度ピクセルによる誤差を排除します。さらに、対応する存在量を考慮し背景成分を除外して、PNPsとRENPsの積分強度画像を算出しました（図4f）。予想通り、両存在量マッピングと積分強度画像は、右チューブにPNPs、左チューブにRENPsが完全存在することを示し、PL発光散乱とアンミキシングアルゴリズムの不完全さによるわずかな誤差があります。

スペクトルアンミキシングは、PNPsとRENPsの混合物も区別可能です。これを実証するため、3本のマイクロ遠心チューブにPNPs、RENPs、およびそれらの混合物溶液を充填しました。ハイパーキューブ取得とスペクトルアンミキシング手順後、存在量マッピングにより、第1チューブにPNPs、第2チューブにRENPs、第3チューブに両者の混合物が完全存在することが示されました（図5a）。さらに強度画像を再構成し、試料中のPNPsとRENPsのPL信号強度分布を明らかにしました（図5b）。

開発したHSI手法を、スペクトル重複するナノプローブのSWIR PL in vivoイメージングでの多重化に適用可能か実証しました。ヌードマウスを麻酔し、PNPs、RENPs、およびそれらの混合物を皮下投与しました。850 nm長波長パスフィルターを用いたNIRイメージングでは、3つの区別できない光ルミネセンススポットが観察されました（図6a）。HSI実施と解析後、存在量マッピングにより、上部投与部位にPNPs、下部にRENPs、左側に両者の混合物が特定されました（図6b）。さらに、PL強度分布を取得するため強度再構成を行いました（図6c）。アンミキシングソフトウェアの閾値を15%（経験的に決定）に調整することで、発光スポット隣接領域のノイズを除去可能になりました（図6d）。この結果は、長波長パスまたはバンドパス光学フィルターを用いる従来のPLイメージングモダリティとは異なり、HSIが試料中の強度分布をマッピングできるだけでなく、画像の全ピクセルで強度のスペクトルプロファイルを特定することで、混合物中の成分を多重化できることを示しています。

以上、HSI取得とスペクトルアンミキシング処理の組み合わせを、スペクトル重複するSWIR PLナノプローブの多重化イメージング取得に適用しました。しかし、HSIモダリティの適用性については以下の点を考慮する必要があります。第一に、スペクトル的に狭い取得のため、全HSIフレームで比較的低い信号強度を扱うことになります（特に有機モイエティからのスペクトル広いPL発光の場合）。また、生体イメージングでのPL励起レーザー出力増加は、組織損傷（光毒性）の危険性により制限されます。これにより、従来のPLイメージングと比較して桁違いに長い取得時間を要するHSIでは、PLプローブの輝度と光安定性に対する要求が高まります。また、線形混合分析とスペクトルアンミキシングアルゴリズムは、組織透過率がHSIスペクトル範囲であまり変化しないスペクトル領域での生体組織の多重化PLイメージングでは満足に機能します。対照的に、組織透過率がHSIスペクトル範囲で顕著な特徴を持つ場合、線形スペクトル混合モデルは適用困難となり（特に深層組織では）、非線形モデルの検討が必要となります。

結論

結論として、SWIRスペクトル領域で発光するナノ粒子の多重化のために、ハイパースペクトルSWIRバイオイメージング技術を開発し適用しました。従来のイメージングでは区別できない、PLスペクトルが重複する2種類のナノ粒子を、ハイパースペクトル取得と線形スペクトル混合分析アルゴリズムを用いて、PLスペクトルプロファイルによって多重化することに成功しました。開発手法は、サンプル懸濁液中および小動物に投与したSWIR PLナノ粒子の多重化イメージングに成功裏に適用されました。SWIRバイオイメージングはより高い深度で優れた分解能を持つため、NIR-SWIR PLナノプローブを用いた多重化イメージングを必要とする様々な応用へのSWIR HSIアプローチの適用に大きな可能性があります。さらに、SWIRバイオイメージングは非常に初期段階にあるため、PLプローブとHSIの組み合わせによる生体医用応用の開発には十分な余地があります。

データおよび資料の入手可能性

本研究で生成・解析された全データは、本掲載論文に含まれています。

略語

BG:

背景

HSI:

ハイパースペクトルイメージング

LCTF:

液晶チューナブルフィルター

NIR:

近赤外

NPs:

ナノ粒子

PL:

光ルミネセンス

PNIPAM:

ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド

PNPs:

高分子ナノ粒子

PS:

ポリスチレン

RENPs:

希土類ドープフッ化物ナノ粒子

SWIR:

短波長赤外

TEM:

透過型電子顕微鏡