強化された腫瘍標的化学療法のためのレスベラトロール制御可能な負荷および放出を備えたpH誘導可逆アセンブリシステム

はじめに

肺がんは、人間にとって最も致命的な固形悪性腫瘍の1つです。環境の悪化などにより、肺がんの発生率は年々増加しており、5年生存率は17.4％に過ぎません[1,2]。現在、外科的切除、放射線療法、標準的な一次化学療法などの従来の臨床治療が利用可能ですが、肺がん患者の全生存率の中央値は依然として改善する必要があります[3、4]。したがって、この致命的な病気を治すために、より効果的で安全な治療法を早急に開発する必要があります。現在、多くの化学療法薬の低い標的効果と高い副作用が化学療法におけるそれらの有用性を制限しているが[5、6]、特にナノ薬物の新興分野において、新しい化学療法剤が絶えず開発されている[7,8、 9,10]。レスベラトロール（RV）は、ブドウや大豆などの天然植物の抽出物であり、血小板凝集の促進、血管拡張の抑制、血液粘度の低下などの臨床現場で広く使用されています[11、12、13、14、15 ]。近年では、強力な抗がん効果も見出されています[16、17、18]。ただし、潜在的な小分子薬として、RVには、溶解性の低さ、血液循環の半減期の短さ、腫瘍選択性の欠如など、他の第一選択化学療法薬と同様にいくつかの欠点があります[19、20]。 RVベースのナノドラッグは、これらの欠点を克服し、その治療効果を高めるために、近年開発されました[21]。 RVのロードには、リポソーム、血清アルブミン、炭素材料、2次元遷移金属ジカルコゲナイド（2D-TMD）など、さまざまな種類のナノキャリアが使用されています[21、22、23、24、25]。これらのナノキャリアは、RVの治療効果を効率的に高めることが報告されていますが、リポソームや血清アルブミンの高効率の能動的トリガー放出能力、炭素材料や2Dの潜在的な長期全身毒性などのいくつかの欠陥を示しています。 TMD [26、27]。したがって、より適格なナノキャリアが依然として求められています。

フェリチンは、内腔が約8 nmの天然ナノケージタンパク質であり、重鎖と軽鎖の24個のサブユニットの相互作用と集合によって形成されます[28、29]。フェリチンは内因性タンパク質であるため、優れた生体適合性と安全性を備えています。さらに、フェリチンは自然にpHに敏感なタンパク質であり、環境が酸性からアルカリ性に変化するにつれて、可逆的に変性および再構築できるという報告があります[30]。 pHが酸性の場合、分解された棒状のオリゴマーはヘッドセット型の構造にのみ回復し、分解されたヘッドセット型の中間体は中空の球状構造にのみ回復しました[28、29、30]。このユニークなpHトリガーの組み立ておよび分解動作により、フェリチンは理想的なドラッグデリバリーシステムになります。最近、張等。ドキソルビシン（DOX）分子はフェリチンにカプセル化され、腫瘍治療のためのpH調節によって正常に放出される可能性があると報告されています[28]。

この研究では、フェリチンベースのpH誘導リバーシブルアセンブリシステム（PIRAS）を開発して、腫瘍を標的とする化学療法を強化するためのRVの負荷と放出を制御することを目的としました。フェリチン球の表面は、腫瘍標的ペプチドRGDと結合していた。得られたナノ薬物RV @ Ft-RGDは、中性およびアルカリ性環境（pH> 7.4）で安定であり、酸性環境（pH <7.4）でのみRVを放出することが実証されました。さらに特徴づけられると、RV @ Ft-RGDはinvitroおよびinvivoで以下の利点を示しました：（1）RV @ Ft-RGDは腫瘍細胞を標的とし、リソソーム（酸性環境）に蓄積し、細胞質へのより多くのRVの放出を促進しました; （2）フェリチン担体は、遊離RVの血液半減期を大幅に延長し、体循環における薬物保持を改善して、腫瘍部位への薬物の蓄積を促進します。 （3）フェリチンの構造的安定性により、送達プロセス中のRVバースト漏れが防止されました。 （4）RV @ Ft-RGDは、invitroおよびinvivoで優れた生体適合性を示しました。したがって、これらのメリットにより、RV @ Ft-RGDは優れた抗腫瘍治療特性を示し、将来の診療所での翻訳に大きな可能性を示しています。

材料と方法

資料

フェリチン、レスベラトロール（RV、≥99％）はSigma-Aldrichから入手しました。 1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）は、Aladdin Bio-Chem Technology Co.、LTD（上海、中国）から購入しました。 NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -RGDはHunanHuateng Pharmaceutical Co.、Ltd（Hunan、China）から購入しました。 DMEM細胞培地、ウシ胎児血清（FBS）、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、Invitrogen（Carlsbad、CA、USA）から入手しました。細胞計数キット-8（CCK-8）は、同仁堂研究所（日本）から提供されました。

RV @ Ft-RGDの合成

RVローディングは、以前のレポート[21、28]に従って、変更を加えて説明されているように準備されました。まず、NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -RGD（10 mg）は、20μLのEDC（5 mg / mL）および20μLのNHS（20 mg / mL）の存在下でFt溶液（1.5 mg / mL）に分散されました。混合物をわずかに攪拌しながら4°Cで2時間反応させ、蒸留水（MWカットオフ=5 kDa）に対する透析によって一晩精製し、Ft-RGDナノ粒子を生成しました。次に、水不溶性RVをDMSOに溶解して2 mg / mLにし、最終濃度1.5 mg / mLでFt-RGD溶液に添加しました。混合物のpHをpH =5に調整して、ポリペプチドサブユニットを分解しました。その後、混合物のｐＨを水酸化ナトリウム（１Ｍ）でゆっくりと７．４に調整して、ポリペプチドサブユニットに類似させた。得られた溶液を蒸留水中で一晩透析して、遊離のRV分子を除去して最終生成物（RV @ Ft-RGD）にした。負荷されたRVの量は、306 nmでの吸収ピークを監視することにより、UV-vis分光光度計（UV3100、島津製作所、日本）によって検出されました。 RV負荷率は（ A _a − A _b ）/ A _c 、ここで A _a 、 A _b 、および A _c それぞれ、初期の無負荷のRVとFt-RGDの重量を表します。

特性

動的光散乱（DLS）法（BI-9000AT、ブルックヘブン、米国）を使用して、ナノ粒子のサイズとゼータ電位を検出しました。ナノ粒子の形態は、透過型電子顕微鏡（TEM、JEM-100S、JEOL、日本）によって観察された。蛍光スペクトルは、Perkin-ElmerLS50B発光分光光度計によって検出されました。細胞の蛍光シグナルは、市販のレーザー走査顕微鏡（LSM 510、Zeiss、ドイツ）およびフローサイトメトリー（FCM、EPICS XL、Beckman、米国）によって記録されました。

RVリリース調査

500マイクロリットルのRV @ Ft-RGD溶液をDチューブ（MWCO 6–8 kDa、Novagen）に入れ、溶液をさまざまなバッファーを介してさまざまなpH値に調整しました。次に、溶液を37 ^o で透析した。 C.異なるインキュベーション時間の後、透析液の1 mLアリコートを取り出し、1mLの新鮮な培地と交換しました。異なるインキュベーション時間で放出されたRVは、UV-vis分光光度計によって決定されました。さらに、RV @ Ft-RGDは、pH 5、6.5、7.4、8.5などのさまざまなpH条件のフラッシング溶液に溶解しました。 37°Cで24時間のインキュベーション後、ナノ粒子のサイズはDLSによって特徴づけられました。

細胞培養

ヒト肺がん細胞A549およびNCI-H358は、中国科学院のCell Collection（上海、中国）から入手し、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリンストレプトマイシン（PS）を含むDMEM培地で培養しました。 5％CO ₂ を含む加湿雰囲気 37 ^o C。

RV @ Ft-RGDの細胞内取り込みとローカリゼーション

一般的に使用される方法として、FITCを適用してナノ粒子を標識しました。 FITCをエタノール溶液（2.0 mg / mL）に溶解し、RV @FtおよびRV @ Ft-RGD水溶液（1.0 mg / mL）と、室温の暗所で4時間撹拌しながら混合しました。混合物を蒸留水中で一晩透析して、余分なFITCとエタノールを除去し、FITC標識RV @FtおよびRV @ Ft-RGD溶液を得ました。 in vitroでのナノ粒子のオルガネラ局在を確認するために、細胞をFITC標識RV @FtおよびRV @ Ft-RGDで5時間処理し、リソソーム特異的色素Lyso Tracker Red（Invitrogen）で染色しました。その後、RV @FtおよびRV @ Ft-RGDの細胞内在化がCLSMを使用して観察されました。簡単に説明すると、A549細胞をFITC標識RV @FtおよびRV @ Ft-RGD（同じ濃度のFITC）と5時間インキュベートしました。次に、細胞をLyso Tracker Red溶液（100 nM）で37°Cで30分間処理しました。 PBSで3回洗浄した後、市販のレーザー走査型顕微鏡で細胞を観察した。 ImageJソフトウェアを使用して細胞の蛍光強度を分析しました。

インビトロ腫瘍化学療法およびアポトーシス研究

まず、キャリアFt-RGDの細胞毒性を、標準的なCCK-8アッセイ（Bestbio、中国）で評価しました。 A549およびNCI-H358細胞（1×10 ⁵ 細胞/mL、0.5 mL）を96ウェルプレートに播種し、24時間培養しました。古い培地を廃棄した後、0、0.01、0.1、0.5、および1 mg / mLのFt-RGDを含む新しい培地をA549およびNCI-H358細胞と24時間インキュベートしました。細胞をPBSで3回穏やかに洗浄した。次に、100マイクロリットルのCCK-8作業溶液（10％CCK-8 + 90％DMEM）を各ウェルに添加し、37°C​​で30分間インキュベートしました。マイクロプレート分光光度計（Multiskan FC、Thermo Scientific）を使用して、450nmでの吸光度値を測定しました。細胞の各グループの写真を光学顕微鏡（オリンパス）で観察しました。

さまざまな濃度の遊離RV、RV @ Ft、RV @ Ft-RGD、およびRV @ Ft-RGD + RGD（0、10、20、30、および40μg/ mLのRV相当量）をA549細胞で処理しました。 24時間のインキュベーション後、処理した細胞の生存率をCCK-8アッセイで分析しました。一方、これらの処理された細胞は、アポトーシス検出キット（Annexin VFITC / PI）によって二重染色され、FCMによって分析されました。

血液中のRV @ Ft-RGDの循環時間

遊離RVまたはRV @ Ft-RGD（6 mg / kg RV相当）を健康なBalb / cヌードマウス（ n ）に静脈内注射しました。 =グループあたり5）。注射後、マウスの静脈血を異なる時点で採取し、ヘパリンを含む採血管に入れ、血漿を分離した。血漿中のRV濃度を酸性化イソプロパノール試薬で抽出し、306nm励起での吸光度を測定してRVの濃度を測定しました。

動物モデルとinvivo 腫瘍化学療法

この作業で使用したBalb / cマウス（4〜6週齢）は、Charles River Laboratories（北京、中国）から購入しました。動物実験を伴うすべての操作は、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに厳密に従っています。このガイドラインは、鄭州大学の動物管理使用委員会によって承認されました。 A549の皮下腫瘍モデルを確立するには、2×10 ⁶ A549細胞をマウスの背中に皮下注射した。次に、それらを動物の家に7〜9日間置いた。腫瘍体積の計算式は、長さ×幅 ² です。 / 2。

マウスを有するA459腫瘍はランダムに5つのグループに分けられました。各グループは5匹のマウスで構成されていました。特定のグループは、コントロール（生理食塩水）、RV、RV @Ft、およびRV @ Ft-RGDです。治療の開始時に、サンプルは3日間連続して尾静脈から1日1回注射されました。腫瘍体積およびマウス体重を5日ごとに記録した。 45日間の治療後、各グループの腫瘍を収集しました。腫瘍組織を10％ホルマリン溶液で固定し、切片にした後、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を行いました。

InVivo生体適合性

200マイクロリットルのRV @ Ft-RGDを、健康なBalb / cマウスに尾静脈から注射しました（RV投与量は15 mg / kgでした）。同じ方法で生理食塩水を注射された健康なマウスを、ブランク対照群として使用した。注射後0、10、45日目に、白血球（WBC）、赤血球（RBC）、ヘモグロビン（HGB）、平均血小板量（MPV）などの細胞数を評価するためにマウスの血液を採取しました。 、平均赤血球ヘモグロビン（MCH）、ヘマトクリット値（HCT）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（MCHC）、平均赤血球容積（MCV）、および血小板（PLT）。さらに、各グループの心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓の組織を収集して、45日目のH＆E染色を行いました。

統計分析

データは平均±標準偏差（s.d.）として表されました。サンプルの統計分析は、Studentの t を使用して実行されました。 テスト、および p <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

RV @ Ft-RGDの合成と特性評価

RVのロードとRV @ Ft-RGDからの解放は、pHによって引き起こされるFtの可逆的分解と再組み立てによって実行されました（図1）。まず、フェリチンを腫瘍標的ペプチドRGDと結合させて、Ft-RGDを形成しました。次に、これを酢酸緩衝液（pH =5）に再溶解して、ポリペプチドサブユニットを分解し、中空の細孔球を形成しました。次に、RV分子を追加してキャビティに入れ、その後、溶液をゆっくりとpH約7.4に調整して、Ftを再構築し、密閉されたFtキャビティ内にRV分子をトラップしました。その後、バッファーのpHを約5に下げると、ナノ粒子の細孔が可逆的に開き、RV分子を放出しました。図2aおよび追加ファイル1：図S1は、球形構造を表示した、組み立てられたRV @ Ft-RGDのSEMおよびTEM画像を示しています。 DLS分析によると、RV @ Ft-RGD粒子は生のFtナノ粒子（〜11.8 nm）と比較して直径が大きく（〜22.5 nm）（図2b）、生のFtナノ粒子と同様のゼータ電位（-29.6 mV）を持っていました（図29.6 mV）。 。2c）。 20日後、水、FBS、細胞培地、およびPBSにおけるRV @ Ft-RGDの多分散度指数（PDI）は有意な変化を示さず（図2d）、RV @ Ft-RGDが顕著なコロイド安定性を示したことを示しています。図2eは、遊離RV、Ft-RGD、およびRV @ Ft-RGDの吸光度スペクトルを示しています。見てわかるように、RVおよびFt-RGDの吸収スペクトルと比較して、RV @ Ft-RGDの吸収スペクトルは306nm（RVに由来）に新しいピークを示し、RVのロードが成功したことを示しています。さらに、RV @ Ft-RGDは、325 nmレーザーで励起した場合、400 nmで遊離RVと同様の有意な発光蛍光を示しました（図2f）。

RV @ Ft-RGDの準備と腫瘍を標的とした化学療法の概略図

a RV @ Ft-RGDのTEM画像。 b 、 c Ft-RGDおよびRV @ Ft-RGDのサイズ分布とゼータ電位分布。 d 水、FBS、細胞培地、およびPBSにおける20日間にわたるRV @ Ft-RGDのPDI変化。 e 遊離RV、Ft-RGD、およびRV @ Ft-RGDの吸光度スペクトル。 f 遊離RVおよびRV @ Ft-RGD

の吸光度スペクトル

薬物のロードとリリース

Ft-RGDの最大負荷容量は252.6％であることがわかりました。これは、中空のFt-RGD内の大きな空洞が原因である可能性があります。 FtはpHに敏感であるため、さまざまなpH条件下でRVの負荷容量を特徴づけることができました。図3aに示すように、pHが5.0から8.5に上昇すると、RVの負荷効率は劇的に低下しました。複合体からのRV放出も、5.0から8.5までのさまざまなpH値で特徴づけられました。 pH値および時間依存のRV放出プロファイルは、このデータから作成され、図3bに示されています。最大薬物放出率（51.6％）は、pH =5.0で24時間発生し、pH =6.5、7.4、および8.5よりも高かった。関連する報告によると、5.0、6.5、および7.4のpH値は、それぞれ細胞リソソーム、腫瘍組織、血液、および通常の生理学的環境で見られる値です[31]。生理学的条件下（pH7.4）では、RV @ Ft-RGDのRV薬物含有量は50時間後も高いままであり（図3c）、RV @ Ft-RGDのRVは安定しており、簡単に漏れないことを示しています。さらに、いくつかの異なるpH条件下でRV @ Ft-RGDの直径の変化を調査しました。 37°Cで12時間のインキュベーション後、DLS分析は、RV @ Ft-RGDの直径がほぼ一定であり、pH8.5および7.4で約23nmであることを示しました。 pH値を6.5と5.0に下げると、RV @ Ft-RGDの直径はそれぞれ25nmと28.6nmに増加しました（図3d）。これらの結果は、RV @ Ft-RGDのpH誘導性の可逆的分解および再構築の挙動を確認します。これは、invitroでの制御可能な薬物負荷および腫瘍組織での薬物放出に有益です。

a さまざまなpH条件でのFt-RGDのローディング効率。 b 5.0から8.5までのさまざまなpH条件でのRV @ Ft-RGDからのRV放出プロファイル。 c 生理学的状態のRV @ Ft-RGDの永続的なRV。 d 5.0から8.5までのさまざまなpH条件でのRV @ Ft-RGDの平均サイズ変化

インビトロでの細胞の取り込みと局在化

次に、RV @ Ft-RGDのinvitro細胞取り込みおよび局在化を評価した。まず、RV @FtとRV @ Ft-RGDは、水素結合の相互作用と物理吸着を介してFITCによってラベル付けされました。図4aに示すように、遊離のFITC処理細胞は、ごくわずかな細胞質蛍光シグナルを示しました。対照的に、RV @ Ft-RGD処理細胞は、RV @Ft処理細胞よりも高い強いFITC緑色蛍光を示しました。特に、RV @ Ft-RGD処理細胞とRGD前処理細胞はどちらも低い緑色蛍光を示しました。これらの結果から、RV @ Ft-RGDは、おそらくRGDを介したアクティブなターゲット効果によって、細胞に大量に取り込まれたと結論付けることができます。これらの処理された細胞はFCMによっても分析され、その結果は図4bに示されています。細胞の蛍光強度の統計結果は、同様の結論を示唆しています。

a 遊離FITCおよびFITC標識RV @ Ft、RV @ Ft-RGD + RGD、およびRV @ Ft-RGDとそれぞれインキュベートした後のA549細胞の蛍光画像。スケールバー=60μm。 b 遊離FITCおよびFITC標識RV @ Ft、RV @ Ft-RGD + RGD、およびRV @ Ft-RGDとのインキュベーション後のA549細胞における細胞FITC蛍光強度のFCM測定。 c FITCとLysoTrackerRedの細胞蛍光の共局在係数。 ** P それぞれ<0.01、他のグループと比較して

RV @ Ft-RGDのオルガネラ局在を研究するために、リソソーム特異的染色色素（Lyso Tracker Red）を使用して、ナノ粒子とともにインキュベートした細胞を染色しました。図4aに見られるように、細胞質はすべてのグループで強い赤色蛍光を示しました。 FITC緑色蛍光と融合した後、RV @ Ft-RGDは、これらのグループの中で細胞質で最も強い黄色（緑色+赤色）の蛍光を示しました。統計分析に基づくと、RV @ Ft-RGD治療群は、FITCとLyso Tracker Red蛍光の間で最も高い共局在係数を示しました（図4c）。これらの結果は、RV @ Ft-RGDが活発に細胞に侵入し、リソソームの酸性環境（pH≈5.0）に移行する可能性があることを示しています。これらのメリットは、pH応答性の薬物放出とともに、RV @ Ft-RGDにinvivo腫瘍治療の多くの潜在的な用途をもたらします。

生体適合性と腫瘍治療

RV @ Ft-RGDの抗腫瘍特性を研究する前に、Ft-RGDキャリアの細胞毒性を調査しました。図5aおよび追加ファイル1：図S2およびS3に示すように、Ft-RGDは、1 mg / mLまでの濃度で肺がんA549細胞およびNCI-H358細胞に対して明らかな生存率抑制を示しませんでした。 1 mg / mLで処理した細胞を対照群と比較した場合も細胞形態に有意な変化は見られず（図5b）、担体としてのFt-RGDが優れた生体適合性を持っていることを明確に示唆しています。図6a、bに示すように、遊離RV、RV @ Ft、およびRV @ Ft-RGDはすべて、濃度依存的に細胞を殺します。 RV @ Ft-RGD処理細胞は、より多くの生存率の低下を示し、40μg/ mLグループで11.2％の細胞生存率しかありませんでした。これは、RV @FtおよびRV @ Ft-RGD + RGD前処理グループよりも低かった。 FCMを用いた予備研究では、RVのみ、RV @ Ft、またはRV @ Ft-RGDのいずれかを使用した場合、細胞死の大部分がアポトーシスを介して媒介されることがさらに明らかになりました（図6c）。これらの結果は、RVの腫瘍細胞殺傷効果がFt-RGDにロードすることによって大幅に強化されたことを示しています。これは主に、酸性pH条件がアポトーシス促進RVの放出の増加を引き起こしたリソソームでのRV @ Ft-RGDの蓄積の増加によるものです。細胞質に[32、33]。

a 異なる濃度のFt-RGDで24時間処理したA549細胞に対するinvitro細胞毒性。 b 1 mg / mLのFt-RGDで24時間処理した後のA549細胞の顕微鏡画像

a 異なる濃度のRV処理A549細胞の細胞生存率。 b RV @ Ft、RV @ Ft-RGD + RGD、およびRVさまざまな濃度のRV @ Ft-RGDで処理された細胞の細胞生存率。 c フローサイトメトリーによるPBS（コントロール）、RV、RV @ Ft、RV @ Ft-RGD + RGD、およびRV @ Ft-RGDで処理されたA549細胞の細胞アポトーシス。 ** P それぞれ<0.01、他のグループと比較して

RV @ Ft-RGDの血液半減期

注射後の異なる時間における血漿中のRV濃度を、遊離RVおよびRV @ Ft-RGD治療群でそれぞれ研究した。図7aに示すように、RV @ Ft-RGDの血中半減期は5.1±0.23時間でした。遊離RVは循環からのウォッシュアウトが速く、血中半減期はわずか0.43±0.11時間でした。血中のRV @ Ft-RGDの半減期が大幅に延長されることは、体循環における薬物の保持を改善するのに有益であり、腫瘍部位での薬物の蓄積を促進します。

a 血中の遊離RVおよびRV @ Ft-RGDの循環時間。 b 生理食塩水（対照）、RV、RV @ Ft、RV @ Ft-RGD + RGD、およびRV @ Ft-RGDの3回の静脈内注射後のA549異種移植腫瘍の成長プロファイル。赤い矢印は注入時点を示します。 ** P それぞれ、他のグループと比較して<0.01。 c 様々な治療後の担癌マウスの体重。 d 治療終了後に異なるグループのマウスから収集されたH＆E染色された腫瘍スライスの顕微鏡写真。スケールバーは50μmです

RV @ Ft-RGDのinvivo抗腫瘍効果と全身毒性

図7bは、相対的な腫瘍体積として表された、異なる治療を受けた担癌マウスの腫瘍成長プロファイルを示しています。 RV @ Ftで治療した場合、腫瘍の成長はある程度抑制されました。これはおそらくRV @Ftの取り込みが少ないためです。ただし、RV @ Ft-RGDで治療したグループでは、他のグループ（コントロール、RV、RV @ Ft、およびRV @ Ft-RGD + RGD）と比較して腫瘍増殖が有意に抑制されました。治療中、どの実験群でも体重の顕著な減少は見られず（図7c）、RV @ Ft-RGDの高い生物学的安全性を示しています。治療コースの終了後、化学療法効果を調査するために、これらのグループの腫瘍組織のH＆E染色を実施しました。図7dに示すように、RV @ Ft-RGDで治療した腫瘍では大きなアポトーシス領域が観察されました。これは、遊離RV、RV @ Ft、およびRV @で治療した腫瘍の小さな領域のアポトーシスとはかなり対照的です。 Ft-RGD + RGD。さらに、RV @ Ft-RGDの全身毒性も正常なマウスで評価されました。生理食塩水およびRV @ Ft-RGDで処理された健康マウスの全血サンプルは、血液分析のために注射後0、10、および45日目に収集されました。図8a、bに示すように、RV @ Ft-RGDを注射したマウスの全血球数（WBC、RBC、HGB、MPV、MCH、HCT、MCV、PLT、およびMCHC）は、0日から45日。生理食塩水およびRV @ Ft-RGDで処理された健康なマウスの主要臓器も、H＆E染色のために45日目に収集されました。これらの組織には明らかな副作用は見られず（図8c）、長期的な有害毒性はごくわずかであることを示唆しています。これらの結果はすべて、invivoでの癌化学療法の強化に対するRV @ Ft-RGDの有望な可能性を示しています。

a RV @ Ft-RGDで45日間治療された健康マウスの血液分析。 b RV @ Ft-RGDで45日間処理された健康なマウスのH＆E染色された主要臓器の画像。 c HE染色は、対照群とRV @ Ft-RGD治療群の主要臓器を画像化します。スケールバーは50μmです

結論

要約すると、我々は、強化された腫瘍標的化学療法のための抗腫瘍RV薬のpH制御可能な負荷と放出を備えたpH誘導可逆アセンブリシステム（PIRAS）の開発に成功しました。酸性（pH =5.0）条件下では、システムはRVを分解してロードまたはリリースできますが、中性条件（pH =7.4）では、RV @ Ft-RGDは非常に安定しており、薬物の漏れはごくわずかです。 RGDを介した標的効果により、RV @ Ft-RGDはA549細胞に高濃度で取り込まれ、リソソームに蓄積されます。これは、invitroおよびinvivoの両方でRVの放出に有益です。リソソームにRV @ Ft-RGDが蓄積し、酸性リソソームがpHをトリガーして細胞質にRVを放出するため、RV @ Ft-RGDは、遊離RVと比較して優れた腫瘍細胞殺傷およびアポトーシス促進効果を示しました。さらに、RVをFt-RGDにロードした後、RV @ Ft-RGDは遊離RVよりもはるかに長い血液半減期を示しました。インビボの結果は、RV @ Ft-RGDが顕著な腫瘍抑制を示し、顕著な全身毒性を示さないことを示しています。この研究は、FtベースのPIRASが、強化された抗癌療法のための薬物の負荷と放出において非常に効率的であることを示唆しています。

データと資料の可用性

この原稿でなされた結論は、この論文で提示され示されているすべてのデータに基づいています。

略語

BSA：

ウシ血清アルブミン

CCK-8：

細胞計数キット-8

DLS：

動的光散乱

EDC：

1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド

FBS：

ウシ胎児血清

FITC：

フルオレセインイソチオシアネート

Ft：

フェリチン

HCT：

ヘマトクリット

HGB：

ヘモグロビン

MCH：

平均赤血球ヘモグロビン

MCHC：

平均赤血球ヘモグロビン濃度

MCV：

平均赤血球容積

MPV：

平均血小板量

NHS：

N-ヒドロキシスクシンイミド

PIRAS：

pH誘導リバーシブルアセンブリシステム

PLT：

血小板

RBC：

赤血球

RGD：

Arg-Gly-Asp

RV：

レスベラトロール

WBC：

白血球