透析法で作製したヘミンナノ粒子のカエル形と球形：鉄生体利用率向上に向けた308倍の溶解度向上

概要

高い生体利用率を持つ鉄源であるヘミンは、水への難溶性という課題を抱えています。本研究では、シンプルな透析法により、カエル形（頭部約200 nm、尾部約100 nm）と球形（50〜100 nm）という2種類の異なる形態のヘミンナノ粒子を作製しました。両形態とも溶解度が劇的に向上し、特に球形粒子では遊離ヘミンと比較して25 ℃で308倍の増加を達成しました。これらのナノ粒子は酸性pH、高温、イオン強度の変化に対して安定であり、強い近赤外吸収を示すことから、食品強化、医薬品送達、光熱療法への応用が期待されます。

はじめに

鉄欠乏は世界人口の約20%に影響を及ぼし、貧血や生活の質の低下を招いています。植物由来の非ヘム鉄は入手しやすいものの、吸収率は必ずしも最適ではありません。ヘモグロビンやミオグロビンから得られるヘム鉄（ヘミン）は吸収率が50〜87%と優れていますが、疎水性で水溶性が低いため実用化が阻害されてきました。タンパク質複合化、アルギニンとの共結晶化、シクロデキストリン包接などの従来手法では溶解性が改善されますが、工程が複雑でスケールアップが困難でした。

ナノテクノロジーは、感覚的特性を損なうことなく疎水性生理活性物質の物理化学的性質を向上させる有力なアプローチです。ナノ粒子化により見かけの溶解度を高め、生体利用率を改善し、標的送達を可能にします。本研究では、透析法によるヘミンナノ粒子の簡便な作製法を開発し、その形態、物理化学的安定性、溶解度を評価するとともに、応用可能性を探りました。

材料と方法

材料

ヘミンおよび8〜12 kDaの透析膜は北京Solarbio社製、アセトン（≧99.5%）はKant Chemical社製を使用しました。その他の試薬は特級品です。

ヘミンナノ粒子の調製

ヘミン（0.1または0.5 mg mL⁻¹）を0.1 mLのHClで酸性化したアセトンに溶解し、脱イオン水に対して透析を行いました（毎日水を交換）。凍結乾燥によりナノ粒子を得ました。ヘミン/水比（1:3、1:5、1:10、1:50）、温度（4 ℃または25 ℃）、透析期間（1〜5日）をパラメータとして変化させました。

透過型電子顕微鏡（TEM）観察

日立7700 TEM（80 kV）を用いて観察しました。試料はカーボン膜支持グリッドに滴下し、凍結乾燥後におこないました。

動的光散乱（DLS）測定

マルバン・ゼータサイザー・ナノを用い、0.05%に希釈したミリQ水溶液（25 ℃）で粒径、ζ電位、PDIを測定しました。

UV-Vis分光分析

TU-1810分光光度計で200〜800 nmの吸収スペクトルを測定し、640 nmでの吸光度から濃度を決定しました。

溶解度試験

遊離ヘミンおよびナノ粒子の過飽和溶液を、25、37、60、80 ℃で500 rpm、30分間攪拌しました。遠心分離後の上清を希釈し、UV-Visで分析しました。

安定性試験

ナノ粒子懸濁液（0.5 mg mL⁻¹）をpH 2〜11、25〜80 ℃、NaCl（0〜500 mM）の条件下に曝露し、粒径、ζ電位、PDI、濁度を一晩（25 ℃）モニタリングしました。

FTIR、蛍光、XRD測定

FTIR（400〜4000 cm⁻¹、Jasco Tensor 27）、蛍光（励起402 nm、放出300〜600 nm、日立F-7000）、XRD（2θ 4〜40°、Bruker AXS D8 ADVANCE）を実施しました。

結果と考察

形成と形態

ヘミン濃度0.5 mg mL⁻¹、ヘミン/水比1:10、透析3日目の条件で球形ナノ粒子（50〜100 nm）が生成しました。比率を1:50に高めるとロッド状凝集体が形成されました。一方、0.1 mg mL⁻¹では同条件下でカエル形粒子（頭部約200 nm、尾部約100 nm）が得られました。TEMで単分散性が確認され、DLSでは球形で218 ± 6 nm、カエル形で300 ± 8 nmの流動径が示されました。ζ電位は球形で−21 mV、カエル形で−11 mVであり、良好なコロイド安定性が示唆されます。PDI値（0.35〜0.40）は狭い粒径分布を反映しています。

光学特性

UV-Visスペクトルでは、遊離ヘミンのソレ帯（344 nm）がナノ粒子で265 nmにシフトし、π-π共役が強化されていることがわかりました。両形態とも近赤外域（約660〜770 nm）で強い吸収を示し、光熱・光音響応用に有利です。蛍光放出ピークは500 nmで遊離ヘミンより高く、溶解度向上に起因すると考えられます。

溶解度向上

遊離ヘミンの25 ℃での溶解度は0.009 mg mL⁻¹でした。球形ナノ粒子は1.33 mg mL⁻¹まで溶解し、308倍の増加です。カエル形も1.00 mg mL⁻¹まで溶解しました。全試料で温度上昇とともに溶解度が上昇し、熱活性化溶解が確認されました。

構造確認

FTIRでは、ナノ粒子でN-H/O-H伸縮振動帯（3470 cm⁻¹）が拡がり、水素結合の強化が示されました。XRDでは、球形は遊離ヘミンの結晶ピークを保持したのに対し、カエル形では結晶性が低下（遊離ヘミン56.7%に対し35.7%）、部分的非晶質化が示唆されました。

安定性

酸性〜中性pH（≦7）では粒径とPDIの変化が最小限で安定でした。アルカリ性pH（≧9）では凝集が進行（>400 nm）。80 ℃までの加熱ではわずかな粒径増大にとどまり、コロイド安定性は維持されました。高イオン強度（≧250 mM NaCl）では分散が不安定化しました。

結論

シンプルな透析法により、カエル形と球形のヘミンナノ粒子を作製し、25 ℃で308倍の溶解度向上を達成しました。これらの粒子は優れた酸・熱安定性と強い近赤外吸収を示し、鉄強化、薬物送達、光熱療法のための多機能プラットフォームとして有望です。今後は治療薬の担持と光熱応答の最適化に焦点を当てた研究を進めます。