ダイゼイン長循環リポソームの調製と薬物動態研究

背景

ダイゼインは、大豆やその他のマメ科植物にのみ含まれる天然化合物であり、構造的にはイソフラボンとして知られる化合物のクラスに属しています。ダイゼインの心血管疾患の予防と治療[1]、更年期障害の緩和[2]、骨粗鬆症[3]、一部のホルモン関連癌のリスク低下[4]、および抗炎症効果[4]の薬理活性が報告されています。 5]。ダイゼインは化学構造上、水溶性や脂溶性が非常に低く、経口投与後は主に腸管に吸収され、代謝されやすくグルクロン酸抱合体や硫酸抱合体を形成します[6,7,8,9,10]。バイオアベイラビリティの低さを改善するために、最近の研究では、ダイゼインリン脂質複合体[11]、ダイゼイン自己組織化ミセル[12]、ポリ乳酸ナノ粒子[13]などの新しいドラッグデリバリーシステムに焦点が当てられました。

リポソームは、疎水性薬物、親水性薬物、およびリン脂質と相互作用する薬物をカプセル化できる効果的な薬物担体システムです[14、15]。その非常に優れた生体適合性により、リポソームは腸透過性を高め、化学的および生物学的分解を減らし、薬物の非特異的副作用を減らすことができます[16]。しかし、従来のリポソームを使用しても、血清成分との結合や単核食細胞系（MPS）による取り込みを完全に克服することはできません[17]。このような問題を克服するために、親水性または糖脂質（ポリエチレングリコール）（PEG）またはモノシアロガングリオシド（GM1）などで修飾された長期循環リポソームが過去数年間に開発されました。長期循環リポソーム担体の表面にPEGが存在すると、親水性保護フィルムの層が形成され、リポソームが血清中のさまざまな成分と相互作用し、食細胞認識によって消費されるのを防ぐことができます[18]。したがって、循環の長いリポソームは、MPSの取り込みを減らし、それによって薬物のバイオアベイラビリティを改善することにより、血液循環時間を延長することができます[19、20]。本論文では、ダイゼイン長期循環リポソーム（DLCL）の調製方法、ならびにラットにおけるそのinvitro放出および薬物動態学的特性を調査した。結果は、DLCLの臨床応用の実験的基礎を提供します。

メソッド

資料

大豆ホスファチジルコリン（SPC）は、Lipoid GmbH（ドイツ）から購入しました。コレステロールとDSPE-mPEG2000は、AVT Pharmaceutical Co.、Ltd。（Shanghai、China）から購入しました。 HPLCグレードのメタノールとアセトニトリルはTEDIACompany（USA）から購入しました。クロロホルムとメタノール（分析グレード）は、Sinopharm Chemistry Reagent Co.、Ltd。（Shanghai、China）から入手しました。水はMilli-Q®浄水システム（（ミリポア、米国）で精製されました。ダイゼイン（純度98％以上）はYuanye Biotechnology Co.、Ltd。（上海、中国）から購入しました。アピゲニン（内部標準、IS、純度98％以上）はDelge Pharmaceutical Technology Co.、Ltd。（中国、南京）から購入しました。リンタングステン酸水和物（分析グレード）はMacklin Co.、Ltd。（中国、上海）から購入しました。Tween-80とエチル酢酸塩はSigma（Missouri、USA）から入手しました。ギ酸（MSグレード）はFischer（USA）から購入しました。

動物

10匹のオスのSprague-Dawleyラット（200–210 g）を湖北省の疾病予防管理センターからSCXK（E）2017–0012のライセンス番号で購入しました。動物実験は、Hubei大学の倫理委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関するガイドに準拠しました。

ダイゼイン長循環ナノリポソーム（DLCL）の調製

粒子サイズとカプセル化効率（EE）を評価指標として、SPCとコレステロールのモル比（A）、質量比の最適なマッチングを最適化するために、4つの要素と3つのレベルの直交設計（表3）を実行しました。 DSPE-mPEG2000の含有量が5％の条件での総脂質（SPCおよびコレステロール）（w / w）（B）、水和温度（C）、および超音波時間（D）に対する薬物（ダイゼイン）[21、22] 。

DLCLは、以下のように簡単に説明する薄膜蒸発超音波処理法によって調製されました[21]：大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、DSPE-mPEG2000、およびダイゼインを10 mLのクロロホルム-メタノール（1：4、v / v）混合物。真空および40℃（水浴）の条件下で、混合物を回転蒸発装置（RE-2000A、上海イーロング生化学機器工場、中国）で乾燥させて薄膜を形成し、次に20mLで水和させた。氷浴中で24分間の超純水（80 w）による超純水。 0.45μmと0.22μmのミクロポーラス膜を順番にろ過することにより、リポソーム懸濁液を3回押し出しました。調製したDLCL溶液は4℃で保存しました。長期保存には、DLCL懸濁液に3％スクロース（凍結保護剤として使用）を添加し、-20°Cで凍結乾燥保存する必要があります。

HPLCによるDLCL中のダイゼインの測定

カラムは、Phenomenex ODS分析カラム（150mm×4.6mm、5μm）をガードカラム（30mm×10mm、3μm）に接続し、カラム温度は40°Cでした。移動相は、10 mM酢酸アンモニウム水溶液（A）とメタノール（B）で構成され、次のようなグラジエント溶出が行われました。0〜3.0分、45％B〜80％B。 3.0〜4.0分、80％B; 4.0–6.0 min、80％B〜45％B。流量は1 mL / minでした。検出波長は240nmでした。注入量は10μLでした。ダイアゼインの直線範囲は0.313〜50μg / mLで、回帰式は y でした。 =35,461x + 1802.4、 R ² =0.9999。ダイゼインの保持時間は4.30分であり、ダイゼインの測定においてDLCL製剤からの干渉は見られませんでした（図1）。分析メソッドの精度、再現性、安定性、およびサンプル回収率は厳密に調査され、定量分析の要件を満たしていました（表1）。

ブランクリポソームの典型的なクロマトグラム（ a ）、ダイゼイン参照物質（ b ）、およびDLCLサンプル（ c ）

直交テストによる処方スクリーニング

粒子サイズとカプセル化効率（EE）を評価指標として、SPCとコレステロールのモル比（A）、薬物（ダイゼイン）の質量比の最適なマッチングを最適化するために、4つの要素と3つのレベルの直交設計が実行されました。 DSPE-mPEG2000の含有量が5％の条件での総脂質（SPCおよびコレステロール）（w / w）（B）、水和温度（C）、および超音波時間（D）。

DLCLの直径と形態

調製したDLCL溶液の粒子サイズとゼータ電位を、レーザー粒子サイズアナライザー（Zetasizer Nano90、Malven Instruments Limited、英国ウスターシャー）により、室温、230Vおよび50HZで測定しました。調製したDLCL溶液を純水で10倍に希釈し、ピンセットで銅メッシュの端から取り出しました。室温で乾燥し、リンタングステン酸水溶液（2％、w / v）で対比染色した後、完全に乾燥したDLCLの形態を、電界放出透過型電子顕微鏡（JEM-2100（HR）、JEOL Ltd. 、東京、日本）加速200kVおよび送信機LaB6。

DLCLのEEおよび薬物負荷

調製したDLCLのEEおよび薬物負荷は、次のように記載された透析法によってアッセイしました。（1）500μLの調製したDLCL溶液を、分子量カットオフが8000〜14,000の透析バッグに追加しました（BioSharp Sai-Guo Biotechnologyその後、透析バッグの両端をしっかりと結び、透析バッグを20 mLの水（透析液）に入れます。シェーカーで12時間振動させた後、1 mLの透析培地を採取し、12000 rpmで10分間遠心分離して、遊離薬物濃度（ C ）を決定しました。 ₁ ）上澄みに。 （2）調製したDLCL溶液500マイクロリットルと2000μLのメタノールを15分間ボルテックスして混合し、リポソームを破壊し、12000rpmで10分間遠心分離して総薬物濃度（ C > ₀ ）上澄みに。 （3）調製したDLCL溶液の10ミリリットル（ V ₀ ）を凍結乾燥して、固体粉末塊（ W ）を秤量した。 ₀ ）。 （4）EEおよび薬物負荷は、次の式に従って計算されました。

インビトロ薬物放出

DLCLと遊離ダイゼインのinvitro放出は透析法によって決定されました。シミュレートされた胃液は0.5％Tween-80を含む0.1 mol / LHCl（pH 1.2）であり、シミュレートされた腸液は0.5％Tween-80を含む25 mM PBSバッファー（pH 6.9）でした。調製したDLCL溶液0.5mLを、分子量インターセプトが8000〜14,000の透析バッグに加え、それぞれ20mLの2つの放出媒体に入れました。放出試験媒体を37℃で連続的に撹拌（100 rpm）した。示された時点（0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、96、120、および144 h）で、サンプルのアリコート（1 mL） ）透析液から採取し、同量の新鮮な放出培地を補充しました。 1ミリリットルあたり1ミリグラムのダイゼイン（DMSOに溶解）をコントロールとして使用し、同じ処理のために上記の2つの放出媒体にそれぞれ入れました。ダイゼインは各時点で測定され、累積放出率は次の式に従って計算されました。

式では、 V ₁ 各時点でのサンプリング量 V ₂ 透析培地の量、 C ₁ 〜 C _i 各時点で測定されたダイゼインの濃度であり、 V ₀ および C ₀ 透析バッグに追加されたDLCLの量と濃度でした。

ラットにおけるDLCLの薬物動態

10匹のオスのSprague-Dawleyラットをランダムに2つのグループに分けました（ n =5）。 1つのグループはダイゼイン（0.5％カルボキシメチルセルロースナトリウムに懸濁）グループであり、もう1つのグループはDLCL（水に溶解）グループでした。 2つのグループのダイゼインの投与量は30mg / kgでした。経口投与前に、ラットを12時間絶食させ、自由に水を飲ませた。ラットに胃内投与した後、ダイゼイン群を各ラットの静脈叢から0.5 mLの血液を3分、5分、10分、15分、30分、45分、60分、1.5時間、2時間で採取しました。 、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、および36h。一方、DLCLグループは各ラットから0.5 mLの血液を同じ方法で1分、3分、5分、10分、15分、30分、45分、60分、1.5時間、2時間、3時間採取しました。 、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、および36h。血液サンプルをヘパリン処理した遠心分離管に入れ、4000rpmで10分間遠心分離し、血漿を採取して-80℃で保存しました。血漿サンプル中のダイゼインの含有量は、確立されたLC-MS / MS法によって決定され、試験されたラットにおけるその薬物時間曲線が得られた。薬物動態パラメータは、DAS3.0ソフトウェア（中国薬理学会の専門家、上海、中国）を使用して非コンパートメントモデルで計算されました。

LC-MS / MSによるラット血漿中のダイダゼインの測定

ラット血漿サンプルを次のように前処理しました：ラット血漿（50μL）、メタノール（10μL）、メタノールに溶解した内部標準（IS）アピゲニン（10μL、500 ng / mL）、および5％ギ酸水溶液（100μL） ）きれいな1.5mL試験管で混合しました。簡単にボルテックス混合した後、1.2mLの酢酸エチルを混合物に加えた。室温で5分間振とうした後、混合物を12,000rpmで10分間遠心分離しました。得られた上部有機相（1 mL）を別のきれいな1.5 mL試験管に移し、蒸発させて移動相（100μL）に再溶解しました。 12,000rpmで10分間遠心分離して得られた上清をLC-MS / MS分析のために収集しました。ラット血漿サンプルの定量条件を以下に説明します。GLInertsustainC18（100mm×2.1mm、3μm）をシムパックカラムホルダーガードカラム（5.0mm×2.0mm、1.6μm）にカラム温度で接続しました。 40°C;水（A）-メタノール（B）からなる移動相を50％B〜80％B（0〜2.00 min）、80％Bの条件で使用し、流速0.2 mL / minのグラジエント溶出を行いました。 （2.00–4.00 min）、80％Bから50％B（4.00–6.00 min）、および50％B（6.10–8.00 min）。注入量は10μLでした。負イオン多重反応モニタリングモード（MRM）を使用して、ダイゼイン（ m ）のイオンペアを検出しました。 / z 253.0→224.15）およびIS（ m / z 269.00→117.05）。その他の条件は次のとおりです。ESIイオン源、加熱ブロック温度400°C、DLチューブ加熱温度250°C、噴霧ガス（ N ₂ ）体積流量3.0 L / min、乾燥ガス（ N ₂ ）容量流量15.0 L / min、イオンスプレー電圧-4.5V。ダイゼインと内部標準（アピゲニン）の保持時間はそれぞれ4.5分と5.4分であり、血漿中の内因性物質はダイゼインの測定に干渉しませんでした。および内部標準（図2）。定量的方法論は厳密に調査され、生物学的サンプルの定量分析の要件を満たしていました（表2）。

ブランクプラズマのHPLC（ a ）、ダイゼイン+アピゲニン（内部標準）+ブランクプラズマ（ b ）、および血漿サンプル（ c ）。 1、ダイゼイン; 2、アピゲニン（IS）

統計分析

データは平均±標準偏差（SD）として表されます。一元配置分散分析（ANOVA）を使用して統計的比較を行い、続いてテューキーの検定を行いました。値は p で統計的に有意であると見なされました <0.05。

結果と考察

ナノリポソームの特性に対する調製プロセスの影響

直交テストの設計とテスト結果を表3に、分散分析の結果を表4に示します。直感的な分析（表3）では、4つの要因が粒子サイズに及ぼす影響の順序は薬物-脂質比> SPC-であることが示されました。コレステロール比>水和温度>超音速時間。カプセル化効率にはほとんど影響しませんでした。分散分析（表4）は、薬物と脂質の比率を示しています。 SPC-コレステロール比は粒子サイズに大きな影響を及ぼします。 DLCLの最適な準備条件はA ₁ でした。 B ₁ C ₂ D ₁ 、SPCとコレステロールの比率は55:40、薬物と脂質の比率は1:10、水和温度は50°C、超音波時間は24分でした。

DLCLの3つのバッチは、上記の最適化されたプロセスに従って並行して準備されました。 EEは85.3±3.6％であり、薬物負荷は8.2±1.4％でした。平均粒子サイズは156.1±3.0nm、PDIは0.294±0.012、ゼータ電位は-49±0.6mVでした。 DLCLの粒度分布を図3に示しました。これは、最適化された準備プロセス条件下で、準備されたDLCLの粒度分布が狭く均一であることを示しています。 TEMで観察されたDLCL粒子の形状と構造は円形または楕円形であり、サイズは基本的に均一でした（図4）。

DLCLの粒度分布

DLCLのTEM写真

ダイゼインは、親水性と親油性が低い典型的な薬剤です。リン脂質の極性末端への薬物の方向性のある組み合わせは、それらを両方とも高度に分散した状態にすることができます。薬物の結晶特性が阻害され、脂質溶解度が増加しました[11]。ダイゼインと脂質二重層の相互作用において、ダイゼインの約15％がリポソーム膜の親水性領域に位置し[23、24]、残りは水/膜界面に分布していることが報告されています[25]。 TEMの結果によると、DLCLの二重構造は明らかであり、ダイゼインの挿入は脂質の二重構造に影響を与えませんでした。

invitro薬物放出に対する調製プロセスの影響

インビトロ放出実験の結果を図5に示しました。シミュレートされた胃液の放出媒体（0.5％Tween-80を含む0.1 mol / L HCL）では、ダイゼインの累積放出率は1時間で約85％でした。そして12hで完全なリリース。 DLCLは、1時間で18％、12時間で60％、48時間で100％をリリースしました。模擬腸液の放出媒体（0.5％Tween-80を含む25 mM PBSバッファー、pH 6.9）では、ダイゼインの累積放出率は1時間で約73％、12時間で84％、24時間で完全放出でした。; DLCLは、1時間で3％、12時間で59％、48時間で100％をリリースしました。

0.5％Tween 80（ a を含む塩酸塩溶液（pH 1.2）でのDLCLおよび遊離ダイゼインのinvitro放出 ）および0.5％Tween 80（ b を含むリン酸緩衝液（pH 6.9）） ）（平均±SD、 n =3）

インビトロ放出実験の結果は、DLCLがpH1.2およびpH6.9の透析媒体で有意に徐放であり、pH1.2の透析媒体での放出速度がpH6.9の透析媒体での放出速度よりも速いことを示した。これは、脂質二重層構造が酸性条件下で脆弱であり、安定性が低いという事実が原因である可能性があります。

InVivo薬物動態に対する準備プロセスの影響

ダイゼインとDLCLの単回経口投与後のダイゼインの平均血漿中濃度-時間曲線を図6に示し、両方のグループにおけるダイゼインの主な非コンパートメント薬物動態パラメーターを表5に示しました。両群とも等用量ダイゼイン（30 mg / kg）下では、DLCL群のダイゼインの血漿中濃度は常にダイゼイン群よりも高かった。 AUC _{0- t} DLCL群のダイゼイン（単回投与後の総吸収量を表し、薬物吸収度を反映した血漿中薬物濃度-時間曲線下面積）は1515.52±532.40μg/ L * hであり、2.5倍であった。ダイゼイングループ（ p <0.05）。さらに、MRT _{0- t} （平均滞留時間。これは、体内の薬物の63.2％を除去するために必要な時間です）および t _1/2 DLCL群のダイゼイン（終末期の血漿中薬物濃度を半減させるのに必要な時間である消失半減期）は、ダイゼイン群のそれぞれ1.6倍と1.8倍に延長されました（ p <0.05）。薬物動態の結果は、DLCLがダイゼインの初回通過効果を低下させて経口吸収を促進するだけでなく、平均滞留時間を延長して徐放効果を達成できることを示しました。

ダイゼイン（30 mg / kg）の単回経口投与後のDLCLおよび遊離ダイゼインの平均血漿濃度-時間曲線（平均±SD、 n =5）

結論

自己乳化型薬物送達システム（SEDDS）、固体脂質ナノ粒子（SLN）、およびナノ構造脂質担体（NLC）を含むナノ脂質担体は、溶解性、透過性、胃腸の安定性、および薬物の経口バイオアベイラビリティ。 SEDDSは、無水等方性油、乳化剤、補助乳化剤、可溶化剤、および薬物で構成されています。消化管で脂質を乳化することにより、薬物の表面積吸収と透過性を高め、薬物が体循環に入るのを促進することができます。ただし、SEDDSは薬物負荷が低く、薬物の結晶化とin vivoでの沈殿が発生しやすく、invitroとinvivoの結果の相関関係は不十分です[26、27]。 SLNは、薬物、脂質、および界面活性剤で構成されています。独自の粒子構造特性と制御可能な放出の利点により、SLNは、抗がん剤のカプセル化に使用される場合、ターゲティングを大幅に改善し、がん細胞の取り込みを促進することができます。ただし、SLNは、親水性薬物やカチオン電荷を持つ薬物のカプセル化には適していません[28]。 NLCは、液体脂質と固体脂質の混合物によって形成される第2世代の脂質ナノ粒子であり、SLNよりも安定性が高くなっています。疎水性分子を効果的にカプセル化し、体内での薬物の滞留時間を延長することができますが、その準備コストは高くなります[29]。

ダイゼインの貧弱な経口バイオアベイラビリティを改善するために、最近の研究は、91.7±1.5％のEEと6.87倍の増加したAUC [11]、ダイゼインを含むダイゼイン-リン脂質複合体負荷脂質ナノキャリアなどの新しいドラッグデリバリーシステムに焦点を当てました。 -EEの85.9±2.7％がAUCの9倍に増加した自己組織化ナノデリバリーシステム[12]、およびEEの81.9％とAUCが5.57倍に増加したダイゼイン-PLGAナノ粒子[13]。

本研究では、最適化された条件下で調製されたDLCLのEEおよび薬物負荷は、それぞれ85.3±3.6％および8.2±1.4％でした。 pH1.2およびpH6.9の培地でのDLCLのinvitro完全放出時間は、遊離薬物の4倍および2倍にそれぞれ増加しました。ラットにダイゼイン（30 mg / kg）とDLCL（等量のダイゼインを含む）を単回経口投与した後、 t _1/2 、MRT _{0- t} 、およびAUC _{0– t} DLCL群のダイゼインの割合は、ダイゼイン群と比較して1.8倍、1.6倍、2.5倍に増加しました。これは、DLCLが経口吸収を促進し、ラットにおけるダイゼインの平均滞留時間を延長したことを示しています。

データと資料の可用性

著者は、物質移動合意書に過度の資格を与えることなく、資料、データ、および関連するプロトコルを読者がすぐに利用できることを宣言します。この調査中に生成および分析されたすべてのデータは、この記事に含まれています。

略語

AUC：

時間-濃度曲線の下の面積;

C _max ：

ピーク濃度

DLチューブ：

ディソルベントチューブ

DLCL：

ダイゼイン長期循環リポソーム

DSPE-mPEG2000：

ジステアロイルホスホエタノールアミン-PEG2000

EE：

カプセル化の効率

ESI：

エレクトロスプレーイオン化

HPLC：

高速液体クロマトグラフィー

IS：

内部標準

LC-MS / MS：

液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析

m / z ：

質量電荷比

MPS：

単核食細胞システム

MRM：

マルチリアクションモニタリングモード

MRT：

平均滞留時間

MS：

質量分析

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

PDI：

多分散度指数

PEG：

ポリエチレングリコール

RSD：

相対的な標準の導出;

SD：

標準偏差

SEM：

平均の標準誤差

SPC：

ホスファチジルコリン

t _1/2 ：

消失半減期

TEM：

透過型電子顕微鏡

T _max ：

ピーク濃度の時間