フェルモキシトールは、敗血症におけるLPS誘発性免疫抑制を改善するMDSCの機能を弱める

はじめに

食品医薬品局によって承認された鉄サプリメントであるFMTは、慢性腎臓病（CKD）の成人の鉄欠乏性貧血の治療に使用されており[1]、FMTは造影剤および薬物担体としても広く使用されています[2]。 。以前の研究では、FMTには、M2マクロファージの表現型シフトを高CD86 ⁺ に誘導する能力など、免疫調節特性があることが示されていました。 、TNF-α陽性M1マクロファージサブタイプ[3、4]。ただし、他の免疫細胞に対するFMTの影響は調べられていません。

MDSCは、強力な免疫抑制能力を持つ未成熟骨髄細胞の不均一な集団です[5]。マウスでは、MDSCはGr-1 ⁺ として識別できます。 CD11b ⁺ 一方、ヒトMDSCはGr-1ホモログを欠いており、CD14 ^- として定義されています。 HLA-DR ⁻ CD11b ⁺ CD33 ⁺ またはCD14 ⁺ HLA-DR ⁻ CD11b ⁺ CD33 ⁺ セル[6]。 MDSCは、顆粒球またはPMN-MDSCとM-MDSCの2つの大きな細胞グループで構成されており、どちらの集団もiNOS、ROS、およびArg-1の産生を通じて免疫抑制機能を持っています。 Arg-1の活性の増加はl-アルギニンを枯渇させ、l-アルギニンの不足はCD3ゼータ鎖の発現を減少させることによってT細胞の増殖を阻害します。 INOSはNOを生成します。これは、T細胞におけるJAK3とSTAT6の両方の機能、およびMHCIIの発現を阻害します。 ROSはT細胞受容体の翻訳後修飾を誘導し、抗原特異的T細胞の無反応を引き起こす可能性があります[7]。 M-MDSCは単球前駆体から生じ、適切なサイトカイン条件下でマクロファージとDCに分化することができます。 MDSCに関する私たちの知識のほとんどは、癌研究に由来しています。近年、MDSCの拡大は、炎症、火傷、自己免疫疾患などの急性および慢性の炎症性疾患でも報告されています[8、9]。最近、マウスの食道および脾臓におけるMDSCによる高レベルの蛍光ナノ粒子の取り込みが画像研究で報告されました[10]。ただし、FMTが炎症性疾患の発症に関与するMDSCの機能を変化させるかどうかは不明です。

敗血症は、生命を脅かす臓器機能障害を引き起こす可能性のある重度の感染症に対する調節不全の宿主炎症反応であり、集中治療室での最も一般的な死因です。敗血症は圧倒的な炎症誘発性反応を開始し、早期に治療しないと、急速に長期の免疫抑制に変化します。 MDSCの拡大は、敗血症の動物モデル[8、11]、および敗血症の患者[12、13、14]の脾臓およびリンパ節で報告されています。 MDSCなどの免疫抑制細胞の活性化は、自然免疫系の過敏性を適切に制御するために重要ですが、それらの過剰な増殖は、二次感染と敗血症後期の死亡の主な推進力である免疫抑制過剰につながる可能性があります。 MDSCの数の増加は、リンパ球増殖の抑制と相関しています。 MDSCは骨髄で表現型を獲得し、次に二次リンパ器官に移動してT細胞応答を阻害し、LPS免疫抑制マウスでの増殖を抑制することが報告されています[8]。敗血症が長引くほとんどの患者は免疫抑制状態を示し、ほとんどの敗血症の死亡率は敗血症後期の免疫抑制によるものです。 MDSCを排除すると、免疫応答が回復するため、敗血症後期に有益な効果が得られる可能性があります[15]。したがって、FMTがMDSCの機能を調節して、敗血症後期の免疫抑制を低下させる可能性があると仮定しました。

ここでは、MDSCに対するFMTの免疫調節効果を示しました。 FMTの磁気特性を利用して、MDSCがinvitroでFMTを貪食できることを明らかにしました。さらに、FMTはArg-1とROSのダウンレギュレーションを介してMDSCの免疫抑制機能を弱めることを発見しました。さらに、インビボ実験により、FMTは、MDSCがT細胞を阻害する能力を弱めることにより、マウスにおけるLPS誘発性敗血症の後期を改善することが確認された。私たちのデータは、FMTの免疫調節機能を使用して、敗血症後期に発生する免疫抑制を治療できる可能性があることを示唆しています。

材料と方法

マウス

オスのC57BL / 6マウス（8〜10週齢）は、南京大学（中国、南京）のモデル動物研究センターから購入しました。マウスは特定病原体除去（SPF）条件下で、24時間の明暗サイクルで飼育され、餌と水を自由に摂取できるようになりました。マウスを使ったすべての実験は、南京大学の動物実験委員会によって承認されました。

プルシアンブルー染色

細胞内FMT分布は、Perlのプルシアンブルー染色キット（Solarbio、中国）を製造元の指示に従って使用して検出されました。簡単に説明すると、細胞を4％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、10％フェロシアン化カリウムで25〜30分間インキュベートした後、洗浄し、ニュークリアファストレッドで10分間対比染色しました。細胞質に青色粒子を含む細胞は、プルシアンブルー染色に陽性でした。

骨髄由来MDSCの生成

骨髄細胞は、野生型マウスの大腿骨と脛骨を洗い流した後、RBC溶解することによって得られました。骨髄細胞は、10％FBS、1％v / vペニシリンおよびストレプトマイシン（Gibco、CA）、40 ng / mL顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）（Miltenyi Biotech、ドイツ）および40 ng / mLIL-6（Miltenyi Biotech、ドイツ）、37°C​​、5％CO ₂ 4日間のインキュベーター。非接着細胞は、さらなる実験のために収集されました。

細胞生存率アッセイ

Cell Counting Kit-8（堂地野、熊本、日本）を製造元の指示に従って使用して、細胞生存率を分析しました。簡単に言うと、MDSC（5×10 ³ ）を96ウェル培養プレートにプレーティングし、5％CO ₂ でインキュベートしました。 処理前に37°Cの雰囲気。次に、培地をさまざまな濃度のFMT（250、500、1000、2000μg / mL）を含む新鮮な培地と24時間交換しました。続いて上澄みを廃棄し、CCK-8溶液を含む新鮮な培地を加えた。 37°Cで3時間インキュベートした後、Gen5マイクロプレートリーダー（BioTek、USA）を使用して450nmで吸光度を測定しました。

トータルRNAの分離とリアルタイムPCR

TRIzol試薬（Invitrogen、米国）を使用して細胞から全RNAを抽出し、Nanodrop分光光度計（Thermo Scientific、米国）で定量した後、HiScript II第1鎖cDNA合成キット（Vazyme Biotech Co.、Ltd、中国）を使用して逆転写しました。メーカーの指示に従って。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、SYBR Green PCR Kit（Bio-Rad、Hercules、CA）をApplied Biosystems StepOne-PlusリアルタイムqPCRシステム（Applied Biosystems、Forster City、CA）で使用して実行しました。遺伝子発現は、2 ^-ΔΔCt を使用してGAPDHに正規化されました。 方法。プライマー配列は、追加ファイル1：表S1に記載されています。

フローサイトメトリー

組織は、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中、37°C​​で30分間、コラゲナーゼタイプD（1 mg / mL）およびDNase I（0.1 mg / mL）を含む単細胞懸濁液として調製し、その後、脾臓は溶解されました。細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーでろ過し、リンパ球を300gで5分間、4℃で遠心分離して回収しました。洗浄後、細胞は直ちに蛍光活性化セルソーティング用に準備されました。単一細胞をFcRブロッキング試薬（Miltenyi Biotech、Germany）で10分間インキュベートした後、次の抗体コンジュゲートで20分間染色しました。FITC標識抗CD11b、抗CD11c、抗CD4、および抗CD8。 PEラベルの抗Ly6G; APC標識抗Ly6C、抗CD3、抗F4 / 80および抗MHCII（BioLegend、CA）。洗浄後、細胞をFACS Calibur（BD、CA）で検出し、FlowJo 7.6（Tree Star、Inc.、USA）を使用してデータを分析しました

H＆E染色

肝臓と肺の組織を4％リン酸緩衝生理食塩水で固定しました。固定組織をパラフィンに包埋し、厚さ5μmの切片を光学顕微鏡用にヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました。

酵素結合免疫吸着測定法

TNFα、MCP-1、およびIL-1βの血清レベルは、特定のELISAキット（Dakewe、中国）を製造元の指示に従って使用して決定しました。各サンプルは重複して実行されました。

ROSの検出

細胞内ROSは、2,7-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）キット（Beyotime、中国）を製造元の指示に従って使用して測定しました。簡単に説明すると、細胞をPBSで2回洗浄し、5μMのDCFH-DAとともに37°C、暗所で30分間インキュベートした後、RPMI-1640培地で洗浄し、PBSに再懸濁しました。フローサイトメーター（BD、CA）を使用して、細胞の細胞内緑色蛍光を分析しました。

T細胞増殖アッセイ

合計CD3 ⁺ CD3εMicroBeadキット（Miltenyi Biotech、ドイツ）を使用して野生型マウスの脾臓からT細胞を濃縮し、CFSE染色（Invitrogen、米国）をインキュベートしました。抗CD3 / CD28抗体によるT細胞増殖では、T細胞を抗CD3抗体（1μg/ mL）および抗CD28抗体（1μg/ mL）で活性化しました。 G-MDSC（Gr-1 ^高 Ly-6G ⁺ ）およびM-MDSC（Gr-1 ^dim Ly-6G ⁻ ）骨髄由来抑制細胞分離キット（Miltenyi Biotech、ドイツ）を製造元の指示に従って使用して、FMT処理またはビヒクル処理マウスの脾臓から分離しました。 MDSCは、CFSE標識CD3 ⁺ と1：1の比率で共培養されました。 96ウェル平底プレートのT細胞を3日間。 CFSEは、各分裂で娘細胞間で均等に分裂します。したがって、増殖はフローサイトメトリーによって決定されました。選別後の細胞の純度は> 90％でした。

統計とデータ分析

すべての統計は、GraphPad Prism 6ソフトウェア（GraphPad Software、CA）を使用して計算され、平均値±標準偏差（SD）として表されます。 2つのグループ間の違いは、マン・ホイットニー U によって分析されました。 テストまたはペアになっていない、両側の生徒の t テスト。一元配置分散分析は、複数のグループの比較に使用されました。すべての実験は少なくとも3回繰り返されました。 p との違い 0.05未満の値は統計的に有意であると見なされました。

結果

多数のMDSCがFMTを取り込む

FMTが内部移行した細胞がMACSMicroBeadsによって分離されているかどうかを確認するために、プルシアンブルー染色を使用して、FMT（1000 ng / mL）で24時間処理したマクロファージの細胞内鉄含有量を検出しました。細胞は3つのグループに分けられました：磁気分離の前に、磁気的に選択されたFMT陽性細胞（FMT +）と磁気的に分離されなかった細胞（FMT-）。プルシアンブルー染色は、磁気的に選択された細胞の大部分がプルシアンブルー陽性であることを示しました（図1a）。 MDSC、マクロファージ、DC間でFMTを貪食する能力を比較するために、FMTで6時間、12時間、24時間、48時間処理したナイーブC57BL / 6マウスから脾細胞を分離しました。脾細胞は、磁気分離前とFMT陽性細胞の2つのサブセットに分けられました。フローサイトメトリー分析により、MDSCの60％近くとマクロファージの60％以上が12〜48時間後にFMTを蓄積したことが明らかになりました（図1b、c）。 DCの約40％のみが24時間でFMT陽性でした。これらのデータは、マクロファージと同様に、MDSCがFMTを取り込むことができることを示し、FMTがMDSC機能に影響を与える可能性があることを示唆しています。

FMTを取り込むMDSC、マクロファージ、およびDCの能力。 a マクロファージをFMT（1000 ng / mL）で24時間処理した後、プルシアンブルーで染色して、3つのグループ間の鉄の細胞内存在と沈着を確認しました：磁気分離前、磁気分離前（FMT +）、磁気分離ではない（FMT-） 。 b ナイーブC57BL / 6マウスの脾細胞を、FMTとともに6時間、12時間、24時間、および48時間インキュベートしました。 2つのサブセットにおけるMDSC、マクロファージ、およびDCのパーセンテージのFACS分析：磁気分離前、FMT陽性細胞。 c 磁気分離前の細胞に対するFMT陽性細胞の比率。すべてのデータは、各実験グループの3つの独立した実験を表しており、平均値±標準偏差として表示されます

FMTはinvitroでMDSCの拡大を阻害します

FMTは、M2マクロファージの表現型シフトを高CD86 ⁺ に誘導することが報告されています。 、TNF-α陽性M1マクロファージサブタイプ[3]。 FMTを取り込むことができるMDSCは多数あるため、FMTがMDSCの機能を変更する可能性があると仮定しました。まず、MDSCに対する250、500、1000、および2000μg/ mLのFMTの細胞毒性効果を、CCK8細胞生存率アッセイによって評価しました。結果は、FMTが低用量で細胞生存率に影響を与えず、2000μg/ mLの最大用量で中程度の細胞毒性しか示さなかったことを示しました（図2a）。次に、さまざまな濃度のFMTがMDSCの生成に影響を与えるかどうかをテストしました。ナイーブC57BL / 6マウスから分離された骨髄細胞は、中またはさまざまな濃度のFMT（250、500、1000、および2000μg/ mL）で4日間処理され、4日目にフローサイトメトリーによって特性評価されました。GM-CSFおよびIL-6は0日目に追加されました。3つの独立した実験の結果は、1000および2000μg/ mLのFMTがMDSCの拡大を大幅に減少させることを明らかにしました（図2b、c）。

CD11b ⁺ のパーセンテージのフローサイトメトリーによる定量化 Gr-1 ⁺ invitroで250、500、1000、2000μg / mLのFMTで処理した後の細胞。 a MDSC細胞の生存率は、さまざまな濃度のFMTで24時間処理した後、CCK8アッセイを使用して検出されました。 b 、 c C57BL / 6マウスから分離した骨髄細胞を、さまざまな濃度のFMTの存在下でGM-CSFおよびIL-6とともに4日間培養し、細胞の表現型をフローサイトメトリーで評価しました。すべてのデータは、各実験グループの3つの独立した実験を表しており、平均値±標準偏差として表示されます。 * p <0.05、** p <0.01、*** p ペアになっていない生徒の t によって決定された<0.001 ビヒクルのみで処理された細胞に対する試験

FMTはMDSCの免疫抑制能力を低下させます

MDSCは、T細胞の増殖とエフェクター機能を阻害するためにいくつかのメカニズムを使用しており、最もよく説明されているのはROSとArg-1の産生です。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ（NOX）複合体のp47phox成分の発現は、MDSCでのROS産生に関与しています[5]。 S100A8 / A9は、オートクリン炎症ループでMDSCによって合成および分泌され、これはマウスモデルの樹状細胞機能の抑制に重要であることが報告されています[16]。 FMTがMDSCの機能を変更できるかどうかを判断するために、前述のようにBM由来のMDSCを取得し、RT-PCRを使用してFMTで処理したMDSCと未処理のコントロールのmRNA発現を測定しました。その結果、FMTで処理したMDSCは、未処理のMDSCと比較して、Arg-1、S100A8、S100A9、およびp47phoxの発現レベルを大幅にダウンレギュレートすることが明らかになりました（図3a–h）。次に、コントロールMDSCとFMT処理MDSCのROSレベルを評価しました。結果は、FMTで処理されたMDSCが対照細胞よりも有意に低いレベルのROSを示したことを明らかにしました（図3i、j）。その後、FMT治療群と未治療群のMDSC亜集団の変化を比較しました。結果は、FMTがG-MDSCの割合を減少させ、M-MDSCのわずかな増加も観察されたことを示しました（図3k、l）。

FMTはinvitroでMDSCの機能を変化させます。ビヒクルまたはFMTで24時間処理された骨髄由来MDSC。 a – h 定量的RT-PCRで測定した、処理済みMDSCからのArg-1、S100A8、S100A9、およびp47phox遺伝子発現。 i BM由来のMDSCをFMTと24時間インキュベートし、FCMによってROS産生を検出しました。 j i の定量的データ 。 k FMT治療群と対照群のMDSCの亜集団。 l G-MDSCおよびM-MDSCのパーセンテージのFACS分析。すべてのデータは、各実験グループの3つの独立した実験を表しており、平均値±標準偏差として表示されます。 * p <0.05、 ** p <0.01、 *** p ペアになっていない生徒の t によって決定された<0.001 ビヒクルのみで処理された細胞に対する試験

FMTはMDSCのマクロファージへの分化を促進します

FMTがMDSCのマクロファージへの最終分化を刺激するかどうかを判断するために、0日目に1000μg/ mLのFMTで細胞を処理し、1、3、5日目にマクロファージ関連マーカーCD11bおよびF4 / 80のフローサイトメトリーを実行しました。結果は、1000μg/ mLのFMTの添加の1日後に、マクロファージの割合が未処理の細胞と比較して2倍以上有意に増加したことを示しました。同様に、FMTによる治療の3日後と5日後、マクロファージの割合も大幅に増加しました（図4a、b）。

MDSCの分化に対するFMTの効果。 a 、 b 骨髄由来MDSCは1000μg/ mLFMTの有無にかかわらず処理され、マクロファージの数はFACSによって1日、3日、および5日後に評価されました。すべてのデータは、各実験グループの3つの独立した実験を表しており、平均値±標準偏差として表示されます。 * p <0.05、ビヒクルのみで処理された細胞に対して

FMTはLPS誘発性敗血症マウスの症状を改善します

敗血症は組織の損傷に関連し、臓器不全や内皮機能障害を引き起こすことが報告されています[17]。 FMTが後期敗血症の症状を軽減するかどうかを調査するために、実験マウスの臓器損傷の程度を10日後に評価しました。 LPS誘発敗血症における肺の組織病理学的検査は、FMTがビヒクル処置マウスと比較して白血球動員および肺胞壁肥厚を減少させたことを示した。 H＆E染色はまた、肝臓壊死の領域が、ビヒクル処置マウスと比較して、FMT処置マウスにおいてより小さかったことを明らかにした（図5a、b）。さらに、これらの動物の肝機能障害の生化学的マーカーとして使用されるアスパラギン酸トランスアミナーゼ血清レベルは、対照と比較して、FMT処置マウスの肝臓で有意に低かった（図5c）。しかし、FMTはアラニンアミノトランスフェラーゼのレベルに影響を与えませんでした（図5d）。さらに、敗血症は、炎症性サイトカインの産生の上昇などの有害な結果に関連していると考えられています。したがって、血清中の炎症性サイトカインのレベルの変化を評価しました。血清中のTNF-αのレベルは、LPS注射の3時間後のFMT治療マウスでわずかに、しかし有意ではなく低く、MCP-1またはIL-1βレベルの違いはFMT治療マウスとビヒクルの間で観察されませんでした治療を受けたマウス（図5e–g）。

FMTは、LPS誘発性敗血症マウスの肝障害を改善します。 a マウスはPBSまたはi.p. 0日目に5mg / kg体重の細菌性LPSを注射。1時間後および5日後、10 mg / kgまたは100μLの生理食塩水の用量のFMTを尾静脈から投与した。マウスを4つのグループに分けた（ n =6）：制御、受信車両; LPS、LPSのみを受信します。 FMT、FMTのみを受信します。およびLPS + FMT、LPSおよびFMTを受信します。 b 肺と肝臓の組織はヘマトキシリンとエオシンで染色されました。 c-d 血清トランスアミナーゼ（ALTおよびAST）を測定しました（ n =6）。サイトカインレベル（TNF-α、IL-1βおよびMCP-1）をELISAで測定した。 e - g ビヒクルまたはフェルモキシトール処置マウスにおけるサイトカイン産生に対するLPS誘発敗血症の影響。腹腔内投与後のビヒクルまたはフェルモキシトール処置マウスの血清中のELISAによって測定されたサイトカインレベル。 LPSチャレンジ（50 mg / kg）。 ** p ペアになっていない生徒の t によって決定される<0.01 テスト

FMTはLPS誘発性敗血症マウスの脾臓のMDSCの数を減少させます

敗血症に関連する免疫抑制が死亡率を増加させることを裏付ける証拠が増えており[18]、MDSCは免疫抑制ネットワークの主要な構成要素と見なされています[8]。 G-MDSCは敗血症患者でより特異的に拡大し、敗血症誘発性免疫抑制の主要なアクターであるように見えることが報告されています[12]。 FMTが野生型マウスのMDSC集団を調節するかどうかを判断するために、C57BL / 6マウスに1時間目と5日目に尾静脈からFMTを投与しました。結果は、MDSCの割合に有意差がないことを示しました。対照マウスとFMT治療マウスの間の骨髄（図6a、e）。注目すべきことに、FMTはCD11b ⁺ のLPS依存性の拡大を減少させました Gr-1 ⁺ 骨髄と脾臓の両方の細胞（図6a、e）。これはinvitro研究と一致しています。さらに、FMTは脾臓のG-MDSCとM-MDSCの割合も減少させましたが、骨髄ではG-MDSCの割合のみが減少しました（図6c、g）。これらのデータは、FMTがLPS誘発性敗血症マウスの脾臓におけるMDSCの数を減少させることを示しています。

FMTは、LPS誘発性敗血症マウスのMDSCの数を減らします。マウスを4つのグループに分けた（ n =6）：制御、受信車両; LPS、LPSのみを受信します。 FMT、FMTのみを受信します。およびLPS + FMT、LPSおよびFMTを受信します。 a CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ 骨髄中の細胞集団はFACSによって検出されました。 b a の定量的データ 。 c ゲートCD11b ⁺ におけるLy6CおよびLy6G発現のフローサイトメトリードットプロット 脾臓からの細胞。 d 顆粒球および単球サブセットのパーセンテージの定量化。 e CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ 脾臓の細胞集団はFCMによって検出されました。 f e の定量的データ 。 g 脾臓のゲートCD11b +細胞におけるLy6CおよびLy6G発現のフローサイトメトリードットプロット。 h 顆粒球および単球サブセットのパーセンテージの定量化。 * p 対になっていない生徒の t によって決定される<0.05 テスト

FMTはinvivoでMDSCのT細胞免疫抑制特性を低下させます

CD4およびCD8T細胞を含む複数の免疫細胞集団の数値的減少は、敗血症後の適応免疫応答の主要な特徴です。それは、死亡のリスクの増加、および他の悪い結果と関連しています[19、20]。 MDSCは、敗血症患者のT細胞ゼータ鎖発現を損なうことによってT細胞増殖を抑制することが示されています[21]。後期敗血症におけるリンパ球の割合を評価するために、マウス敗血症モデルにおいてCD4およびCD8T細胞の割合を測定しました。結果は、FMTがLPS誘発マウスの脾臓のCD4およびCD8 T細胞の増加を引き起こしたことを示しました（図7a、b）。対照マウスと比較して、FMT処理マウスの脾臓におけるCD4およびCD8 T細胞のパーセンテージに差はありませんでした（図7a、b）。インビボでのT細胞増殖の抑制におけるMDSCの役割をさらに確認するために、G-MDSCおよびM-MDSCを、MACSによってビヒクルまたはFMT処理LPSチャレンジマウスの脾臓から単離し、CD3 T細胞と1：1で共培養した。比。我々の結果は、FMT治療がG-MDSCとM-MDSCの両方のT細胞免疫抑制機能を低下させることを示しました（図7e、f）。さらに、マウスの脾臓から分離されたMDSCにおけるArg-1およびp47phoxの発現レベルも測定しました。予想通り、Arg-1およびp47phox遺伝子の発現は脾臓CD11b ⁺ で有意に減少しました。 Gr-1 ⁺ LPSチャレンジマウスと比較した場合のFMT処理LPSチャレンジマウスから単離された細胞（図7g、h）。これらのデータは、FMTがArg-1およびROS産生を減少させることにより、MDSCの免疫抑制機能を低下させたことを示しており、FMTが後期敗血症における長期の免疫抑制を低下させる可能性があることを示唆しています。

FMTはMDSCの免疫抑制特性を低下させます。 a CD3 ⁺ CD4 ⁺ 脾臓の細胞集団はFACSによって検出されました。 b a の定量的データ 。 c CD3 ⁺ CD8 ⁺ 脾臓の細胞集団はFACSによって検出されました。 d a の定量的データ 。 e 抗CD3 / CD28刺激によって誘発されたT細胞増殖を抑制するマウスのG-MDSCの能力は、FACS（ n ）によって測定されました。 =グループあたり3）。代表的なヒストグラムが表示されます。 f ビヒクルまたはFMTで処理したLPSチャレンジマウスのM-MDSCが、抗CD3 / CD28刺激によって誘導されるT細胞増殖を抑制する能力をFACSで測定しました（ n =グループあたり3）。代表的なヒストグラムが表示されます。 g 、 h ビヒクルまたはFMT処理LPSチャレンジマウスのMDSCにおけるArg-1およびp47phoxmRNAの発現

ディスカッション

FDA承認の鉄サプリメントFMTは、MRIスキャンの薬物担体および造影剤として広く使用されています。 FMTは、M1マクロファージ極性化によって炎症誘発性免疫応答を誘導することによって癌の増殖を阻害することがわかりました[3]。これは、FMTが免疫調節機能を持っていることを示しています。この研究では、FMTで処理したMDSCと対照の未処理のMDSCの表現型と機能を比較することにより、MDSCに対するFMTの効果を評価しました。以前の研究は、MDSCが磁性ナノ粒子を取り込むことができることを示しており[10]、私たちのデータはさらに、FMTがArg-1とROSのダウンレギュレーションを介して脾臓のMDSCの免疫抑制機能を弱めることを示しました。私たちのデータはまた、FMTがMDSCの分化に直接影響を及ぼし、invitro実験で5日後に細胞の約5分の1がマクロファージに均一に分化することを示しました。 FMTに曝露されたマクロファージの表現型は調査しませんでしたが、炎症性M1サブタイプであると仮定しました。結果は、FMTがMDSCの分化と成熟を改善することを明確に示しており、したがって、これが敗血症後期に観察されたMDSC集団の減少の根底にあることを示唆しています。

敗血症は、時間とともに変化する複雑な免疫応答を開始し、炎症誘発性応答と抗炎症性応答の両方を伴います。以前の研究では、敗血症の初期段階での死亡は過度の炎症によるものであることが示されています。 Deriveらは、10日目のMDSCを敗血症マウスに養子移入すると、腹膜サイトカイン産生が減弱し、生存率が改善したと報告しました[22]。最近では、Namkoog etal。クラリスロマイシン前処理は、CD11b ⁺ を拡張することにより、LPS誘発性ショックのマウスモデルの生存率を高めることを観察しました。 Gr-1 ⁺ cell population [23]. They described that MDSCs play a protective role in sepsis, however, it should be noted that they were concerned about the early stages of sepsis. Most patients with sepsis display rapid signs of profound immunosuppression, and deaths in this phase are typically due to the acquisition of a secondary hospital-acquired infection, often with opportunistic pathogens [24]. Overzealous MDSC proliferation may facilitate a physiological syndrome of persistent immunosuppression, causing poor outcomes [25]. McClure et al. reported that they did not observe any protective effects from MDSC transfer once the mice entered the late immunosuppressive state [26]. They had previously shown that MDSCs massively expand in the bone marrow, spleen, and lymph nodes of mice with ongoing septic processes and contribute to sepsis-induced T cell suppression [11]. Additionally, Uhel reported that M-MDSCs and G-MDSCs strongly contribute to T cell dysfunction in patients with sepsis [12]. Our data demonstrated that FMT significantly decreased the percentage of MDSCs and attenuated the functions of MDSCs to restore the number of T cells present in mice during late sepsis. Therefore, when studying the role of MDSCs in sepsis, it is crucial to clearly distinguish the early and late stages of sepsis.

Mohus et al. suggested that iron deficiency was associated with increased risk of future bloodstream infections that cause sepsis, indicating that the immune defense mechanisms may be depressed compared to bacterial iron sequestration in low iron environments [27]. Controversies shown in iron supplemental studies reported that intravenous iron therapy was associated with an increased risk of infection [28]. It should be noted the iron supplements differ significantly in their physicochemical properties, which give them different biological properties [29]. With FMT, an iron core is wrapped in a carbohydrate shell, which leads to low toxicity, lysosomal uptake and degradation [30, 31]. It has been reported that FMT does not cause liver toxicity in patients or animal models and is typically metabolized within 2 months [32]. Our data showed that FMT does not increase the production of inflammatory cytokines in early sepsis, indicating that FMT can be administered in sepsis.

Conclusion

This study demonstrated a novel immune-modulatory property of FMT; however, further studies are needed to elucidate the mechanism of FMT suppression of MDSCs. Furthermore, we provide an attractive therapeutic approach for the treatment of sepsis-associated immunosuppression and targeting MDSCs may provide a promising new option for restoring the immune response during sepsis.

データと資料の可用性

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

ALT:

Alanine aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartate aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSCs/PMN-MDSCs:

Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs

HE:

Hematoxylin–eosin

IL-1β:

Interleukin-1β

iNOS:

Inducible nitric oxide synthase

LPS:

Lipopolysaccharide

MCP 1:

Monocyte chemotactic protein 1

MDSC:

Myeloid-derived suppressor cell

MHC II:

Major histocompatibility complex

M-MDSCs:

Monocytic MDSCs

PBS:

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Reactive oxygen species

TLR:

Toll-like receptor

TNF-α:

Tumor necrosis factor α