固体ナノポアを介したDNA転座の制御

はじめに

ここ数十年で、ゲノム内の塩基配列を読み取るためにDNAシーケンシングを適用することで多くの進歩が見られました[1、2]。個別化医療を開発するために、研究者はより速く、より安価なDNA配列決定法を模索してきました。この方法では、標的薬や治療法を個人に具体的に適用できます[3、4]。 DNA検出にはナノポア技術が使用されているため[5]、次世代シーケンシングに有効な方法であると考えられていました[6、7]。 Nanoporeテクノロジーは、DNA [5]またはRNA [8]用の高感度の単一分子検出器を特定するための有望なプラットフォームです。基本的な検出スキームでは、電気化学チャンバーは、導電性溶液と電気化学チャンバー内の分析物を接続するナノポア[9]を備えた薄い膜によって、2つのリザーバー（シスコンパートメントとトランスコンパートメント）に分離されます。膜に電圧を印加することにより、電解質イオンが固体ナノポアを通って流れ、ポア電流を形成します。これは、関連する超高感度電子機器を備えたパッチクランプセットアップを使用して測定されます。分子または分子複合体がナノポアを通過するとき、分析物は、ナノポアによって定義されたボリュームから一部のイオンを除外できます。これは、電流の短い変化を監視することで検出できます。ナノポア内の滞留時間（滞留時間）と電流振幅シグネチャの両方から、分子に関する情報を取得できます。ナノポアシーケンシングの空間分解能は、ナノポアの寸法によって決定されます。これは、検出可能な電流シグネチャをもたらす小分子オブジェクトの単一センサーとして使用できることを示唆しています。さらに、ナノポアセンサーは、携帯性の高いラボオンチップデバイスに簡単に統合でき、小型化できます[10]。

固体ナノポア[2、11]やタンパク質ナノポア[2、7]などのナノポアによるDNAシーケンシングは大幅に進歩しています。タンパク質ナノポアによるDNAシーケンシングが達成されました[7]。ただし、タンパク質ナノポアシステムには、生体分子の研究に限界があります。生物学的/タンパク質ナノポアと比較して、固体ナノポアには制約が少ない。これらの困難は、固体ナノポアによって克服される可能性があります。タンパク質ナノポアと比較して、それらはより広い範囲の温度、電圧、および溶媒条件で機能し、サブナノメートルの精度で直径を調整することができます。 DNAシーケンシングの次世代技術への応用が期待されています。

DNAセンサー用に、さまざまな材料と構造の多くの固体ナノポアが作られています。ただし、DNAシーケンスは、ソリッドステートナノポアでは実現されません。固体ナノポアセンサーの場合、DNAシーケンシングに商業的に適用する前に、空間分解能と時間分解能に関する2つの主要な障害を克服する必要があります。空間分解能に関する難しさは、固体ナノポアが単一塩基の分解能を達成するために、2つの隣接するヌクレオチド間の小さな間隔を区別できることです。時間分解能の障害は、電気力の下でのDNA転座が速すぎることです。その結果、既存のパッチクランプまたは他の信号取得システムによる有効なデータポイントの取得が非常に少なくなります。このミニレビューでは、固体ナノポアDNA検出の空間分解能と時間分解能を向上させるためのさまざまな方法の概要を説明します。このミニレビューでは、固体ナノポアを介したDNA転座を遅くする方法にも焦点を当てています。

空間分解能

2001年に、窒化ケイ素の固体ナノポアがLi etalによって最初に報告されました。 [12]。酸化ケイ素[13]、ケイ素[14]、Al ₂ など、さまざまな固体ナノポアがDNA分子検出用に実証されています。 O ₃ [15]、およびHfO ₂ [16]。固体ナノポアは、最終的には化学的および機械的条件に対して堅牢である可能性がありますが、空間分解能が低いなどの制限があります。材料の厚さのために、数十のベースが一度に固体ナノポアを通過することができます。現在、最も薄い窒化ケイ素ナノポアは3 nmであり、4種類のベースを区別していません[17]。

興味深いことに、2次元（2D）材料の単層の厚さは約3.0–11.0Åであり、これはssDNAに沿った2つの隣接するヌクレオチド間の間隔（3.2–5.2Å）に匹敵します[18]。グラフェン（3.4Å[19]）、MoS ₂ などの2次元膜 （6.5Å[18]）、WS ₂ （7Å[20]）およびh-BN（11Å[21]）は、信号対雑音比と空間分解能が高いため、DNA転座を検出することが実証されています[21、22、23]。それらの空間分解能から、これらの材料がDNA検出に使用できることは明らかです。さらに、再現性のある成長技術と大規模な転写手順により、2D膜にサブナノメートルの細孔を大規模に製造することが可能になります。

グラフェンは、2次元のハニカム格子に配置された原子的に薄い炭素原子のシートです[24]。研究者は、溶液中の単一DNA分子をグラフェンナノポアで検出および特性評価できることを実証しました[22、25]。しかし、DNAヌクレオチドとグラフェンの間には強い疎水性相互作用があり、DNAはひどく詰まってグラフェンナノポアに付着し、転座速度に著しく影響します[26]。グラフェン上の親水性基[26]で修飾またはコーティングされた親水性材料[25]は、グラフェンの親水性を改善し、その表面にDNAが付着するのを防ぐことができます。残念ながら、親水性基による修飾または親水性材料によるコーティングのいずれかにより、懸濁フィルムの厚さが増加し、ナノポアの厚さが増加し、グラフェンの空間分解能が低下します。

層状遷移金属ジカルコゲナイドは、MoS ₂ を含む別の2D材料です。 [18、27]およびWS ₂ [20]。 DNAがMoS ₂ を通過したときに、高い信号対雑音比（SNR> 10）とイオン電流信号の5倍の増強が検出されました。 ナノポアメンブレン[18]。一方、MoS ₂ は親水性であるため、DNAとその表面の間の疎水性相互作用を回避するために特別な表面処理は必要ありません。もう1つの資料、WS ₂ 直接バンドギャップは2.1eV [28]であり、そのフォトルミネッセンス（PL）発光はよく研究されているMoS ₂ よりも強力です。 [29]。ダンダら[20] WS ₂ を作成しました ナノポアであり、短い光パルスを使用して原子的に制御されたナノポアサイズの達成を実証しました。これは、DNA検出用の固体ナノポアにプラスの効果をもたらす可能性があります。

その上、劉等。 [21]は、h-BNナノポアを介したDNA転座の最初の実験を報告しました。グラフェンと同様に、h-BNは親水性が低く、DNAがナノポアをブロックします。続いて、周等。 [23]は、UV-オゾン処理後のh-BN材料の酸化防止と完全性を利用することにより、h-BNナノポアの親水性を改善することに成功しました。 h-BNの絶縁性は、グラフェンよりも高イオン強度の溶液でより顕著な耐久性と絶縁特性を示す可能性があります。極薄のナノポア構造で単一塩基の分離を達成することは、競争力のある候補です。

二次元材料の使用は、潜在的にデバイスの空間分解能を高めて、単一ヌクレオチドの分解能を達成することができます。いくつかの二次元材料のDNA検出実験が報告されていますが、固体ナノポアDNAシーケンシングの達成を報告した人は誰もいません。ナノポアシーケンシングの時間分解能も課題です。

時間分解能

固体ナノポアを通過するDNA転座速度は非常に速く、最大0.01–1μs /ベース[30]であり、市販のパッチクランプによって収集される効果的なデータはほとんどありません。そのため、遮断電流信号に基づいてすべてのベースを区別することはできません。グラフェン、MoS ₂ などの2D材料の固体ナノポアのDNA転座速度 、WS ₂ 、およびh-BNを図1に示します。理想的には、各ヌクレオチドからのシグナルを十分に記録できるように、ナノポア内のDNA転座速度は1〜100 bp / msである必要があります[32]。

2D固体ナノポアのDNA転座速度[18、20、21、22、23、25、27、31]。赤い点線は、100 bp / msのDNA転座率を示しています

このような背景から、DNAの転座速度を遅くすることは、多くの研究者が追求する重要な目的です。 DNA転座を遅くして、固体ナノポア検出の時間分解能を向上させるために、さまざまな方法が開発されてきました。通常の方法は、DNAを変更することにより、温度[33]、電解質粘度[27]、駆動電圧[34]、イオン濃度[35]、ナノポアの表面電荷密度[36]などの実験的要因の影響を変更することです。それを介した転座。 Wanunu etal。 [33]温度、電圧、およびDNAの長さを変更することにより、固体ナノポアを介したdsDNAの移動を遅くすることに集中しました。さらに、Feng etal。 [27]は、室温のイオン液体に基づく粘度勾配システムを使用して、MoS ₂ を介したDNA転座のダイナミクスを制御できることを示しました。 ナノポア、および室温イオン液体の高粘度が373 bp / msの最適な単一ヌクレオチド転座速度を提供することを実証しました。

多くのアプローチは、DNA転座速度を低下させ、イオン電流検出を容易にする可能性がありますが、それでもDNAシーケンシングの要件を満たすことはできません。したがって、ナノポアを通るDNAの通過を制御するためのより根本的な方法を開発する必要があります。ここでは、時間分解能を向上させるためにナノポア構造と定量的DNA移動を制御する方法について説明します。

2つのナノポアシステム

研究者は、2つのナノポアシステムを使用してDNA分子の転座を操作しました。これにより、同じ分子を何度も制御可能に検出できます。マイクロメートルサイズの空洞コンパートメントによって分離された2つの積み重ねられたナノポア[37]（図2a）は、DNA分子を一定時間トラップし、制御可能に放出することができます。 DNA分子のダイナミクスは、相関分析によって2つの細孔の信号から推定できます。これにより、転座の直接的な電気的証拠が得られます。さらに、2層ナノポアシステムのエントロピーバリアにより、DNA分子のブラウン運動を制限することができ、ナノポアを使用したDNAシーケンスの精度を向上させることができます。単一分子センシング技術と比較して、DNA分子は、単一の細孔を前後に通過させるのではなく、複数の細孔を連続的に配置することにより、2層ナノポアシステムで複数回測定できます[39]。

a ナノポアDNA検出に使用される2層ナノポアシステムの概略図[37]。 b ナノポアDNA検出に使用されるダブルナノポアシステムの概略図[38]

ダブルナノポアシステムは、分子輸送を制御し、2つのポア間で分子を効率的にブリッジする別の方法を提供します。それらは、DNA操作のためのラベルフリーの機械的アプローチです[40]。ダブルナノポアシステムでは、同じ固体膜内に2つの独立してアドレス可能な隣接するナノポアがあります。 DNA分子が電気泳動によって駆動されてナノポアの1つを通過する間に、単一のDNA分子が両方のポアに捕捉され、2つのナノポアの間に「綱引き」が発生します[38]（図2b）。したがって、力がDNA分子のさまざまな端に加えられ、速度が低下し、その動きが完全に停止します。ダブルナノポアシステムは、固体ナノポアでのDNAの機械的トラップへの新しい道を切り開きます。これは、ラベルがなく、信号が高いという利点を備えた、幅広い生体分子を測定するための有望な手法です。対雑音比と低コスト。 DNA分子を効率的に閉じ込めてトラップし、DNAの転座を遅らせることができます。また、このナノスケールのDNA綱引きの物理学を研究するためにも使用できます[41]。

光トラップナノポア

光トラップナノポアにより、光ピンセットは数十ナノメートル未満のサイズの粒子をトラップできます。タンパク質[42]、DNAフラグメント[43]、その他の生体分子[44]、および小さなウイルス[45]の光トラップを可能にします。光トラップナノポアの背後にある基本的な理論は、自己誘導型の逆作用光トラップです[46]。ナノポアアレイの領域に焦点を合わせたレーザービームは、穴の金属層の端に高出力密度の局所光場を形成します。粒子が局所的なライトフィールド間を移動すると、局所的な光透過率に大きな変化が生じる可能性があり、その結果、粒子に大きな光学力と誘電力が発生します。捕獲された粒子のサイズのボトルネックを打破するために、ダブルナノホール構造が使用されます。ムハンマドら。 [47]は、20nmのシリカとAuナノ粒子を使用した光トラップナノポアの使用の可能性を示しました。二重ナノホールのダンベル形状をAuフィルムにフライス加工し、25nmのナノポアを懸濁したSi _x にドリルで穴を開けました。 N _y 図3aに示すように、二重ナノホールの中央にある膜。ナノ粒子をナノポアに通す電気泳動力は、穴の端を通過するときに、二重ナノホールの先端の間に存在する自己誘導逆作用プラズモン力が電気泳動力に対抗し、ナノ粒子の速度を低下させます。結果は、光トラッピングが電気泳動転座時間を4桁延長したことを示した。キムら[43]は、単一のナノポアのナノプラズモニック構造を使用することにより、プラスミドDNAとラムダDNAの光学的捕捉を実現しました。この技術は、DNA検出の潜在的な用途があり、並列検出を実現するために複数の局所ライトフィールドを設定できます。ただし、高周波イオン電流の振動は、DNAの電流検出結果に影響を与える可能性があります。これは、電気泳動力と自己誘導逆作用力の競合により、ナノ粒子がナノポアの口を通って上下に浮くためである可能性があります。

a 光トラップナノポアチップの概略図[47]。 b 自己誘発バックアクションシステムの概略図

光ピンセット

光ピンセットは、ナノポアを介した分子の移動を制御するために使用でき、近年一般的に使用されています。 2006年、Keyser etal。 [48]は、光ピンセットを適用してSiN _x を介したDNA転座を制御することにより、電気泳動力と機械力の間の分子綱引きを最初に示しました。 ナノポア。このシステムは単純なフックのばねとして機能し、ビードにかかる張力はフックの法則に基づいて計算できます。 F _ot =−k _トラップ Z 、ここで F _ot は光学力、 k _トラップ は変位方向に沿ったトラップ剛性であり、 Z はビーズの線形変形です[48]。集束レーザービームのクロスオーバーにDNAテザーポリスチレンビーズをトラップする光ピンセット法は、図4aに示すように、DNAテザーポリスチレンビーズを3次元で操作でき、力感度のピコニュートン範囲を持ちます。 。ナノポア内に移動するDNAをトラップするために、張力を調整して電界力（ F ）のバランスを取りました。 _el ）DNA上。したがって、張力を使用して、DNA転座の速度を低下させ、DNA分子をナノポアから引き出すことができます[52]。このシステムにより、核酸とタンパク質の空間サンプリングと高解像度の力の同時測定が可能になり、DNAシーケンシングで大きな進歩を遂げました。ただし、光ピンセット技術にはいくつかの根本的な問題があります。第一に、多数のナノポアにスケールアップすることは困難です。第二に、光ピンセットのレーザーによって引き起こされる加熱は、ナノポアを通るイオン電流とノイズレベルに強く影響し、光学的にトラップされたビーズがナノポアから数マイクロメートル離れている必要があります[53]。

a ナノポアDNA検出に使用される光ピンセットの概略図[48]。光ピンセットシステムが平衡状態にあるとき、光学力（F _ot ）は電界力（F _el ）。 b ナノポアDNA検出に使用される磁気ピンセットの概略図[49]。磁気ピンセットシステムが平衡状態にあるとき、磁力（F _Mt ）は電界力（F _el ）。 c ナノポアDNA検出に使用されるAFMの概略図[50]。 d ナノポアDNA検出に使用されるTFFSの概略図[51]

磁気ピンセット

磁気ピンセットは、張力によってDNA転座を制御する別の方法を提供し、磁気ピンセット技術がDNA転座を遅らせるのに効果的であることが実証されています[49]。このシステムでは、図4bに示すように、強力な金-チオール[54]またはストレプトアビジン-ビオチン[49]の相互作用を使用して、DNA分子をマイクロメートルサイズの磁気ビーズに付着させることができます。次に、DNAの自由端は、印加された電界によってナノポアに捕捉されます。続いて、小さなギャップを持つ2つの磁石を使用して、磁場の勾配を作成できます。この技術は、トラップされたDNAにかかる電気力のバランスを取り、転座速度を低下させ、さらには電気泳動を逆にすることができます。光ピンセットと比較して、磁気ピンセットは超並列力分光法の有望な候補です。このシステムでは、数百のビーズ、つまりDNA分子を数百のナノポア内で同時に制御できます。これは、多くのアドレス可能なナノポアに簡単に拡張できます。これにより、分析プロセスが桁違いに高速化されます。ただし、光ピンセットと比較して、磁気ピンセットアプローチの明らかな欠点の1つは、分子の3次元制御がないことです[55]。

フォースセンシングプローブ

光ピンセットや磁気ピンセットによるDNA転座速度の制御は大きく進歩しましたが、ブラウン運動には10 nm未満の分解能での制御が困難なブラウン運動の問題があります[51]。 。これを克服するために、AFMはDNA転座の速度を制御するために使用されており[50]、力と遮断電流を同時に測定することもできます。このシステムを使用した研究では、図4cに示すように、DNAをAFMプローブの先端につなぎ、プローブホルダーに固定しました。プローブの動きを制御することにより、DNA転座を制御して、その速度を低下させ、さらには電気泳動を逆にすることができます。さらに、分子の長さに対応する表面からの高さまでチップを引っ込めることにより、測定を繰り返すことができます。 AFMの支援により、遮断電流とAFM力測定の信号を組み合わせることで検出分解能を大幅に向上させることができるため、DNA検出は実践と理論において進歩しました[56]。ただし、DNA検出におけるナノポア技術の適用には依然として障害があります。つまり、DNA分子が比較的摩擦のない方法でスライドするときに0.35〜0.72 nmごとに力（および電流）の規則的な変動が断続的に発生します。ナノポア。これらの変動は、回転式改札口のような動きでナノポアを通過する個々のヌクレオチドに起因します[50]。

研究によると、力検出センサーとして使用できる音叉は、ナノメートル未満の速度でDNAがナノポアを通過するように制御できることが示されています[51、57]。この統合された装置を使用した研究では、図4dに示すように、DNA分子が音叉の1つのプロングに接着されたプローブチップに取り付けられました。音叉を保持するために、サブナノメートルの精度を備えたナノポジショニングシステムが使用されました[51]。プローブの先端の位置は、音叉ベースのフィードバック力センサーによって感知され、ナノメートルの位置決めシステムを操作することによって制御されます。この移動速度は、光ピンセットで操作されるDNAの10倍遅く、固体ナノポアを自由に通過するDNAの1000倍遅い[57]。従来のAFMと比較して、音叉はより速いスキャン動作を提供し、液体に浸されたときに高い力感度を備えています。 TFFSをナノポアに組み込むことにより、ナノポアを通過するDNA分子の通過中に、ナノポアを通過するイオン電流、チップの位置、およびチップの振動振幅を同時に測定できます。

Siプローブ

上記のすべての方法、すなわち、磁気ピンセット、光ピンセット、AFM、およびTFFSは、ナノポアの位置をスキャンする必要があります。彼らは、DNAがナノポアを通過できることを確認するために、DNAの有効長内にナノポアを配置する必要があります。ナノポアアドレッシングはこれらの方法の重要な部分ですが、チップの面積よりも大きいシリコンプローブの大きな表面にDNAを接続することは困難です[32]。これは、固定化されたDNAを簡単に挿入できることを意味します。膜内のナノポアの位置をスキャンせずにナノポア。 DNA固定化Siプローブと位置コントローラーを使用してDNAのナノポアへの移動とナノポアからの移動を制御することの実現可能性が実証されています。この方法の難しさは、Siプローブが溶液に浸され、ペプチドカップリングによってDNAに接続されることです。プローブ表面のDNA密度を制御することは困難であるため、ナノポアを同時に通過する複数のDNAが発生し、検出電流に影響を与える可能性があります。

ナノポアDNA検出に使用されるDNA固定化Siプローブシステムの概略図[32]

光ピンセット、磁気ピンセット、原子間力顕微鏡（AFM）、音叉ベースの力検出（TFFS）は、ナノポア内の分子の実際の力と位置を検出できます。これにより、適切な速度でナノポアを通過するDNAの制御が可能になります。 Siプローブを使用することにより、ナノポアに対処することの難しさを回避できます。さらに、2ナノポアシステムの使用は、ナノポアを通過するDNAの通過を制御および減速するための実行可能な方法です。さらに、光トラップナノポアは将来的にDNA検出の可能性を秘めています。ここでは、2ナノポアシステム、光トラップナノポア、光ピンセット、磁気ピンセット、AFM、TFFS、SiプローブなどのいくつかのDNA制御方法と統合された固体ナノポアのDNA転座速度を要約しました（表1）。 。

結論

グラフェン、MoS ₂ などの単分子層2D材料 、WS ₂ 、およびh-BNは、ヌクレオチド間の間隔と同じくらい厚いため、おそらく最も薄い達成可能な材料です。従来のソリッドステートナノポアメンブレンと比較して、単層2Dメンブレンは、高いイオン電流信号対ノイズ比と比較的大きな検出領域を示すため、ナノポアデバイスに最適です。それらは、光ピンセット、磁気ピンセット、AFM、TFFS、Siプローブ、2ナノポアシステム、または光トラップナノポアと組み合わせることにより、DNAシーケンシングを実現する資格がある可能性があります。ただし、これらの手法では、いくつかの課題が発生しました。これらの課題は、ナノポアDNAシーケンシングを商品化する前に解決する必要があります。これらの最初のものは、ビーズまたはプローブの先端がナノポアに近い場合、イオン電流信号でDNAヌクレオチドを識別することがより困難な場合に発生します。分子ハンドルまたは他のより長い分子を使用して、ビーズまたはチップによってもたらされる電流信号への影響を相殺できるDNA鎖の長さを追加する必要があります。第二に、高スループットで並列検出を実現するにはナノポアアレイを使用する必要がありますが、並列検出の技術は現在十分に成熟していません。第三に、現在の製造方法によれば、2ナノポアシステムおよび光トラップナノポアシステムを高精度および再現性で製造することは困難であり、これはナノポアDNA検出にとって非常に重要である。ヘリウムイオンビームは、この問題を解決するための重要な技術である可能性があります[11、58]。したがって、DNAナノポアシーケンシングは引き続き研究の焦点であり、より新しいアイデアや革新的なアプローチと統合して、低エラー率、高速で高速の並列記録、最大100キロベースの長い読み取り長を実現できると期待しています。

データと資料の可用性

この調査中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された記事に含まれています。

略語

2D：

二次元

3D：

立体素材

TMD：

層状遷移金属ジカルコゲナイド

SNR：

信号対雑音比

PL：

フォトルミネッセンス

SIBA：

自己誘発バックアクション

AFM：

原子間力顕微鏡

TFFS：

音叉ベースの力検出