固体ナノポアにおけるDNAトランスロケーションの最適化によるシーケンシング精度の向上

概要

バイオナノポアと比較すると、固体ナノポアを商用DNAシーケンシングに応用するには、依然としていくつかの課題を克服する必要があります。空間分解能と時間分解能の低さが、2つの主要な課題です。ナノポアの長さや固体ナノポアの表面特性の制約により、空間分解能には改善の余地があります。一方、DNAは電気的な力で非常に速くトランスロケートするため、有効なデータポイントがほとんど得られません。したがって、DNAトランスロケーション速度を適切に制御できれば、固体ナノポアの時間分解能を向上させることができます。このミニレビューでは、空間分解能を向上させる手法を簡潔にまとめ、ナノポア検出の分解能を高めるための制御可能な手法に焦点を当てています。さらに、ナノポアによるDNAシーケンシングの発展展望についても述べています。

はじめに

近年、ゲノムの塩基配列を読み取るDNAシーケンシングの応用において、大きな進歩が見られています[1, 2]。個別化医療の開発に向けて、研究者たちはより速く安価なDNAシーケンシング手法を求めており、標的薬や治療法を個人に特化して適用できるようにしようとしています[3, 4]。ナノポア技術がDNA検出に用いられるようになって以来[5]、次世代シーケンシングの有効な手法と見なされてきました[6, 7]。ナノポア技術は、DNA[5]やRNA[8]の高感度シングルモレキュール検出器として有望なプラットフォームです。基本的な検出スキームでは、ナノポアを持つ薄い膜によって電気化学チャンバーが2つの貯留槽（シス側とトランス側）に分けられ[9]、導電性溶液と分析対象物質が電気化学チャンバー内で接続されます。膜の両側に電圧を印加すると、電解質イオンが固体ナノポアを通って流れ、ポア電流が形成され、これが超高感度エレクトロニクスを備えたパッチクランプ装置で測定されます。分子や分子複合体がナノポアを通過すると、アナライトがナノポアで定義される体積から一部のイオンを排除するため、電流の短時間の変化として検出できます。ナノポア内での滞在時間（ドウェルタイム）と電流振幅のシグネチャーから、分子に関する情報を得ることができます。ナノポアシーケンシングの空間分解能はナノポアの寸法によって決まるため、検出可能な電流シグネチャーを生成する小さな分子オブジェクトの単一センサーとして使用できます。さらに、ナノポアセンサーは、高度に携帯可能なラボオンチップデバイスへの統合や小型化が容易です[10]。

ナノポアによるDNAシーケンシングでは、固体ナノポア[2, 11]やタンパク質ナノポア[2, 7]などで大きな進歩がありました。タンパク質ナノポアによるDNAシーケンシングは達成されています[7]。しかし、タンパク質ナノポアシステムには生物学的分子の研究における限界があります。固体ナノポアは、生物学的/タンパク質ナノポアと比較して制約が少なく、これらの困難を克服できる可能性があります。タンパク質ナノポアと比べて、より広い温度範囲、電圧範囲、溶媒条件で機能し、サブナノメートル精度で直径を調整できます。次世代DNAシーケンシング技術への応用が期待されています。

さまざまな材料と構造を持つ固体ナノポアがDNAセンサーとして作製されてきました。しかし、固体ナノポアによるDNAシーケンシングはまだ達成されていません。固体ナノポアセンサーでは、商用DNAシーケンシングへの応用前に、空間分解能と時間分解能という2つの主要な障壁を克服する必要があります。空間分解能の難点は、固体ナノポアが隣接する2つのヌクレオチドの微小な間隔を識別し、シングルベース分解能を達成する必要があることです。時間分解能の障壁は、DNAが電気的な力で速すぎる速度でトランスロケートするため、既存のパッチクランプや他の信号取得システムではごく少数の有効なデータポイントしか得られないことです。このミニレビューでは、固体ナノポアDNA検出の空間分解能と時間分解能を向上させるさまざまな手法の概要を示し、特にDNAトランスロケーションを遅くする手法に焦点を当てています。

空間分解能

2001年、Liらによって窒化シリコン固体ナノポアが初めて報告されました[12]。シリコン酸化物[13]、シリコン[14]、Al₂O₃[15]、HfO₂[16]など、さまざまな固体ナノポアがDNA分子検出に実証されています。固体ナノポアは化学的・機械的条件に対して最終的に堅牢である可能性がありますが、空間分解能が低いという制限があります。材料の厚さのため、数十塩基が一度に固体ナノポアを通過してしまいます。現在、最も薄い窒化シリコンナノポアでも3 nmであり、4種類の塩基を識別するには至っていません[17]。

興味深いことに、二次元（2D）材料の単層の厚さは約3.0–11.0 Åであり、ssDNAに沿った隣接ヌクレオチド間の間隔（3.2–5.2 Å）と比較可能です[18]。グラフェン（3.4 Å[19]）、MoS₂（6.5 Å[18]）、WS₂（7 Å[20]）、h-BN（11 Å[21]）などの2次元膜は、高い信号対雑音比と空間分解能により、DNAトランスロケーションの検出が実証されています[21,22,23]。これらの材料は空間分解能の観点からDNA検出に使用可能です。また、再現性のある成長技術と大規模転写プロセスにより、2D膜にサブナノメートルポアを大規模に作製することが可能になりました。

グラフェンは、炭素原子が二次元ハニカム格子に配列した原子レベルの薄いシートです[24]。グラフェンナノポアを用いて、溶液中の単一DNA分子を検出・特性評価できることが実証されています[22, 25]。しかし、DNAヌクレオチドとグラフェンの間には強い疎水性相互作用があり、DNAがグラフェンナノポアに深刻に詰まったり付着したりして、トランスロケーション速度に大きな影響を与えます[26]。親水性基で修飾する[26]、または親水性材料でコーティングする[25]ことでグラフェンの親水性を改善し、DNAの付着を防止できます。残念ながら、どちらの方法も吊り下げ膜の厚さを増加させ、ナノポアの厚さを増やすため、グラフェンの空間分解能が低下します。

遷移金属ダイカルコゲナイドの層状材料も別の2D材料で、MoS₂[18, 27]やWS₂[20]が含まれます。DNAがMoS₂ナノポア膜を通過する際、高い信号対雑音比（SNR > 10）とイオン電流信号の5倍の増強が検出されました[18]。一方、MoS₂は親水性であるため、DNAとの疎水性相互作用を避けるための特別な表面処理は不要です。もう一つの材料WS₂は2.1 eVの直接バンドギャップを持ち[28]、その光ルミネッセンス（PL）放出はよく研究されているMoS₂よりも強いです[29]。Dandaら[20]はWS₂ナノポアを作製し、短い光パルスを用いて原子レベルで制御されたナノポアサイズの達成を実証しました。これは固体ナノポアによるDNA検出に好影響を与える可能性があります。

さらに、Liuら[21]はh-BNナノポアを通したDNAトランスロケーションの最初の実験を報告しました。グラフェンと同様に、h-BNは親水性が低く、DNAがナノポアを塞ぐ原因となります。その後、Zhouら[23]はUV-オゾン処理によるh-BN材料の酸化防止性と完全性を利用して、h-BNナノポアの親水性を改善することに成功しました。h-BNの絶縁性は、グラフェンよりも高イオン強度溶液において、より優れた耐久性と絶縁特性を示す可能性があります。超薄型ナノポア構造でのシングルベース分解能達成の有力な候補です。

2D材料の利用により、デバイスの空間分解能を向上させ、シングルヌクレオチド分解能の達成が可能になります。いくつかの2D材料でのDNA検出実験が報告されていますが、固体ナノポアDNAシーケンシングの達成は報告されていません。ナノポアシーケンシングの時間分解能もまた課題です。

時間分解能

固体ナノポアを通るDNAトランスロケーション速度は非常に速く、最大で0.01–1 μs/塩基[30]に達するため、市販のパッチクランプではほとんど有効なデータが収集できません。したがって、ブロック電流信号に基づいて各塩基を識別することはできません。グラフェン、MoS₂、WS₂、h-BNなどの2D材料の固体ナノポアにおけるDNAトランスロケーション速度を図1に示します。理想的には、ナノポア内のDNAトランスロケーション速度は1–100 bp/msで、各ヌクレオチドからの信号を満足に記録できるはずです[32]。

図1 2D固体ナノポアのDNAトランスロケーション速度[18, 20,21,22,23, 25, 27, 31]。赤い点線は100 bp/msのDNAトランスロケーション速度を示す。

この背景から、DNAトランスロケーション速度を遅くすることは多くの研究者が追求する重要な目的です。固体ナノポア検出の時間分解能を向上させるため、DNAトランスロケーションを遅くするさまざまな手法が開発されてきました。一般的な方法は、温度[33]、電解質粘度[27]、駆動電圧[34]、イオン濃度[35]、ナノポアの表面電荷密度[36]などの実験的因子の影響を変えることで、ナノポアを通るDNAトランスロケーションを変化させることです。Wanunuら[33]は、温度、電圧、DNA長を変えることで、固体ナノポアを通るdsDNAトランスロケーションを遅くすることに注力しました。また、Fengら[27]は、室温イオン液体ベースの粘度勾配システムを用いてMoS₂ナノポアを通るDNAトランスロケーションのダイナミクスを制御でき、室温イオン液体の高粘度が最適なシングルヌクレオチドトランスロケーション速度373 bp/msを提供することを示しました。

多くのアプローチがDNAトランスロケーション速度を低減し、イオン電流検出を促進する可能性を秘めていますが、それでもDNAシーケンシングの要件を満たすには至っていません。したがって、ナノポアを通るDNAの通過を制御するより根本的な手法を開発する必要があります。ここでは、ナノポア構造の制御とDNAの定量的移動による時間分解能向上の手法について議論します。

二重ナノポアシステム

研究者たちは、DNA分子のトランスロケーションを操作し、同じ分子を制御可能に繰り返し検出するために、二重ナノポアシステムを用いてきました。マイクロメートルサイズの空洞コンパートメントで隔てられた2つの積層ナノポア[37]（図2a）は、DNA分子を一定時間トラップし、制御可能に放出できます。2つのポアの信号から相関解析によりDNA分子のダイナミクスを導出でき、トランスロケーションの直接的な電気的証拠を提供します。さらに、二層ナノポアシステムのエントロピー障壁により、DNA分子のブラウン運動を閉じ込めることができ、ナノポアによるDNAシーケンシング精度を向上させられます。シングルモレキュールセンシング技術と比較して、二層ナノポアシステムでは、単一ポアを往復させる代わりに、複数のポアを直列に配置することでDNA分子を複数回測定できます[39]。

図2 a ナノポアDNA検出に用いられる二層ナノポアシステムの模式図[37]。b ナノポアDNA検出に用いられる二重ナノポアシステムの模式図[38]

二重ナノポアシステムは、分子輸送を制御し、2つのポア間で分子を効率的にブリッジする別の手法を提供し、DNA操作のラベルフリーな力学的アプローチとなっています[40]。二重ナノポアシステムでは、同じ固体膜内に独立してアドレス指定可能な2つの隣接ナノポアがあります。DNA分子が電気泳動的に一方のナノポアを通過する際、単一DNA分子が両方のポアに捕捉され、2つのナノポア間で「綱引き」が生じます[38]（図2b）。したがって、DNA分子の両端に力が加わり、その動きが遅くなり、完全に停止することさえあります。二重ナノポアシステムは、固体ナノポアにおけるDNAのメカニカルトラップへの新たな道を開き、ラベルフリー、高信号対雑音比、低コストという利点を持つ幅広い生体分子の測定に有望な技術です。DNA分子を効率的に閉じ込め、トランスロケーションを遅くできるだけでなく、DNA上のこのナノスケール綱引きの物理を研究するにも使用できます[41]。

光学トラップナノポア

光学トラップナノポアは、数十ナノメートル以下の粒子を光学ツイーザーでトラップすることを可能にします。これにより、タンパク質[42]、DNA断片[43]、他の生体分子[44]、小型ウイルス[45]の光学的トラップが可能になります。光学トラップナノポアの基本理論は、自己誘導バックアクション光学トラップ[46]です。ナノポアアレイの領域に集光されたレーザービームは、ホール内の金属層の端に高出力密度の局所光場を形成します。粒子がこの局所光場の間を移動すると、局所光透過率に大きな変化を引き起こし、その結果、粒子に大きな光学的および誘電力が生じます。二重ナノホール構造を用いることで、捕捉可能な粒子のサイズボトルネックを打破します。Muhammadら[47]は、20 nmのシリカおよびAuナノ粒子を用いた光学トラップナノポアの可能性を実証しました。ダンベル形状の二重ナノホールがAu膜にミリングされ、吊り下げられたSiₓNᵧ膜の中央に25 nmのナノポアがドリル加工されています（図3a参照）。電気泳動力でナノ粒子をナノポアを通過させると、ホールの端を通過する際に二重ナノホールの先端間に存在する自己誘導バックアクションプラズモニック力が電気泳動力に反対し、ナノ粒子の速度を低下させます。結果は、光学トラップにより電気泳動トランスロケーション時間が4桁延長されることを示しました。Kimら[43]は、単一ナノポアのナノプラズモニック構造を用いて、プラスミドDNAとラムダDNAの光学的捕捉を実現しました。この技術はDNA検出への応用可能性があり、複数の局所光場を設定することで並列検出を実現できます。しかし、高周波イオン電流振動がDNAの電流検出結果に影響を与える可能性があります。これは、電気泳動力と自己誘導バックアクション力の競合により、ナノ粒子がナノポアの入り口で上下に浮遊するためと考えられます。

図3 a 光学トラップナノポアチップの模式図[47]。b 自己誘導バックアクションシステムの模式図

光学ツイーザー

光学ツイーザーは、ナノポアを通る分子トランスロケーションを制御するために使用でき、近年一般的に用いられています。2006年、Keyserら[48]は、SiNₓナノポアを通るDNAトランスロケーションを光学ツイーザーで制御し、電気泳動力と機械的力の間の分子綱引きを初めて実証しました。このシステムは単純なフックのばねとして働き、ビーズへの張力はフックの法則に基づいて計算できます：Fₒₜ = −kₜᵣₐₚZ、ここでFₒₜは光学力、kₜᵣₐₚは変位方向のトラップ剛性、Zはビーズの線形変形です[48]。集光レーザービームの交差点でDNAテザー付きポリスチレンビーズをトラップする光学ツイーザー法は、DNAテザー付きポリスチレンビーズを三次元で操作でき、ピコニュートン範囲の力感度を持ちます（図4a参照）。ナノポア内のトランスロケート中DNAをトラップするため、張力をDNAへの電場力（Fₑₗ）と釣り合うように調整します。したがって、張力を用いてDNAトランスロケーション速度を低減し、DNA分子をナノポアから引き出すことができます[52]。このシステムは、核酸やタンパク質の空間サンプリングと高分解能力測定を同時に可能にし、DNAシーケンシングで大きな進歩を達成しています。しかし、光学ツイーザー技術にはいくつかの根本的な困難があります。第一に、多数のナノポアへのスケールアップが困難です。第二に、光学ツイーザーのレーザーによる加熱が、ナノポアを通るイオン電流とノイズレベルに強く影響するため、光学的にトラップされたビーズをナノポアから数マイクロメートル離す必要があります[53]。

図4 a ナノポアDNA検出に用いられる光学ツイーザーの模式図[48]。光学ツイーザーシステムが平衡状態にあるとき、光学力（Fₒₜ）は電場力（Fₑₗ）と等しい。b ナノポアDNA検出に用いられる磁気ツイーザーの模式図[49]。磁気ツイーザーシステムが平衡状態にあるとき、磁気力（Fₘₜ）は電場力（Fₑₗ）と等しい。c ナノポアDNA検出に用いられるAFMの模式図[50]。d ナノポアDNA検出に用いられるTFFSの模式図[51]

磁気ツイーザー

磁気ツイーザーは、張力によりDNAトランスロケーションを制御する別の方法を提供し、DNAトランスロケーションを遅くする効果があることが実証されています[49]。このシステムでは（図4b参照）、DNA分子を強力な金-チオール[54]またはストレプトアビジン-ビオチン[49]相互作用を用いてマイクロメートルサイズの磁気ビーズに結合させます。次に、印加電場によりDNAの遊離末端をナノポアに捕捉させます。その後、小さな隙間を持つ2つの磁石を用いて磁場勾配を作ります。この技術は、トラップされたDNAへの電気的力を釣り合わせてトランスロケーション速度を低減し、甚至は電気泳動を逆転させることができます。光学ツイーザーと比較して、磁気ツイーザーは大規模並列力分光法の有望な候補です。このシステムでは、数百個のビーズ、ひいてはDNA分子を数百のナノポア内で同時に制御でき、多くのアドレス指定可能なナノポアへのスケールアップが容易です。これにより、分析プロセスを桁違いに高速化できます。しかし、光学ツイーザーと比較して、磁気ツイーザーアプローチの明らかな欠点は、分子の三次元制御ができないことです[55]。

力検出プローブ

光学ツイーザーと磁気ツイーザーによるDNAトランスロケーション速度の制御で大きな進歩があったものの、ビーズトラップ法にはブラウン運動の問題があり、10 nm未満の分解能でビーズの動きを制御することが困難です[51]。これを克服するため、AFMを用いてDNAトランスロケーション速度を制御し[50]、同時に力とブロック電流を測定することができます。このシステムを用いた研究では（図4c参照）、DNAをAFMプローブの先端にテザーし、プローブホルダーにクランプします。プローブの動きを制御することで、DNAトランスロケーションを制御し、速度を低減し、甚至は電気泳動を逆転させることができます。さらに、分子長に対応する高さまでチップを引き戻すことで、測定を繰り返すことができます。AFMの支援により、ブロック電流とAFM力測定の組み合わせ信号によって検出分解能を大幅に向上できるため、DNA検出は実践と理論の両面で前進しています[56]。しかし、ナノポア技術のDNA検出への応用には、DNA分子が比較的摩擦の少ない状態でナノポアを通過する際、0.35–0.72 nmごとに力（および電流）の規則的な変動が断続的に発生するという障壁が残っています。これらの変動は、個々のヌクレオチドがナノポアをターンスタイルのような動きで通過することに起因すると考えられています[50]。

チューニングフォークを力検出センサーとして用いることで、DNAをサブナノメートルレートでナノポアを通過させる制御が可能であることが実証されています[51, 57]。この統合装置を用いた研究では（図4d参照）、DNA分子をチューニングフォークの一方の歯に接着したプローブチップに結合させます。サブナノメートル精度を持つナノポジショニングシステムでチューニングフォークを保持します[51]。プローブチップの位置は、チューニングフォークベースのフィードバック力センサーで検出され、ナノメートルポジショニングシステムの操作で制御されます。この移動速度は、光学ツイーザーで操作されるDNAの10分の1、固体ナノポアを自由に通過するDNAの1000分の1です[57]。従来のAFMと比較して、チューニングフォークは液浸時により高速なスキャン動作と高い力感度を提供できます。TFFSをナノポアと組み合わせることで、DNA分子がナノポアを通過する際、ナノポアを通るイオン電流、チップ位置、チップ振動振幅を同時に測定できます。

Siプローブ

前述のすべての手法、すなわち磁気ツイーザー、光学ツイーザー、AFM、TFFSは、ナノポア位置のスキャンを必要とします。DNAの有効長内にナノポアを位置づけ、DNAがナノポアを通過できるようにする必要があります。ナノポアアドレッシングはこれらの手法の重要な部分ですが、困難です[32]。DNAをチップの面積よりも大きいシリコンプローブの大きな表面に接続しました（図5参照）。これにより、膜内のナノポア位置をスキャンすることなく、固定化されたDNAをナノポアに容易に挿入できます。DNA固定化Siプローブと位置制御装置を用いて、DNAのナノポアへの出入りを制御することの実現可能性が実証されています。この手法の難点は、Siプローブが溶液に浸漬され、ペプチド結合でDNAと接続されていることです。プローブ表面のDNA密度を制御するのが難しく、複数のDNAが同時にナノポアを通過する可能性があり、検出電流に影響を与えます。

図5 ナノポアDNA検出に用いられるDNA固定化Siプローブシステムの模式図[32]

光学ツイーザー、磁気ツイーザー、原子間力顕微鏡（AFM）、チューニングフォークベース力検出（TFFS）は、ナノポア内の分子の実際の力と位置を検出でき、適切な速度でDNAのナノポア通過を制御する上で有望です。Siプローブを用いることでナノポアアドレッシングの困難さを回避できます。また、二重ナノポアシステムの利用は、DNAのナノポア通過を制御し遅くする実現可能な手法です。さらに、光学トラップナノポアは将来のDNA検出に潜在的可能性を秘めています。ここでは、二重ナノポアシステム、光学トラップナノポア、光学ツイーザー、磁気ツイーザー、AFM、TFFS、Siプローブなど、いくつかのDNA制御手法と統合された固体ナノポアのDNAトランスロケーション速度をまとめました（表1）。

結論

グラフェン、MoS₂、WS₂、h-BNなどの単層2D材料は、ヌクレオチド間の間隔と同程度の厚さであるため、達成可能な最も薄い材料である可能性があります。従来の固体ナノポア膜と比較して、単層2D膜は高いイオン電流信号対雑音比と比較的大きなセンシング領域を示すため、ナノポアデバイスに理想的です。これらは、光学ツイーザー、磁気ツイーザー、AFM、TFFS、Siプローブ、二重ナノポアシステム、光学トラップナノポアと組み合わせることで、DNAシーケンシングの実現に潜在的に適格です。しかし、これらの技術にはいくつかの課題が生じており、ナノポアDNAシーケンシングの商用化前に解決する必要があります。第一に、ビーズやプローブチップがナノポアに近づくと、イオン電流信号でDNAヌクレオチドを識別するのがより困難になります。分子ハンドルや他のより長い分子を用いてDNA鎖の長さを増やし、ビーズやチップによる電流信号への影響を相殺すべきです。第二に、高スループット・並列検出を実現するにはナノポアアレイを用いるべきですが、並列検出技術は現在十分に成熟していません。第三に、現在の製造手法では、二重ナノポアシステムと光学トラップナノポアシステムを高精度かつ再現性良く作製するのが困難であり、これはナノポアDNA検出にとって非常に重要です。ヘリウムイオンビームがこの問題を解決する鍵となる技術かもしれません[11, 58]。したがって、DNAナノポアシーケンシングは引き続き研究の焦点となり、より新しいアイデアや革新的アプローチと統合され、低エラーレート、高速・高並列記録、最大100キロベースの長いリード長の実現が期待されます。