生分解性・腫瘍応答型ナノ粒子による二重モダリティ乳がんイメージング

概要

ガス充填超音波（US）造影剤は体内で容易に崩壊し、ガスが容易に漏出するため、USイメージングの有効性が制限されています。この問題に対処するため、MRネガティブ造影剤Fe₃O₄、蛍光色素Cy5.5、CO₂放出ドナー（Na₂CO₃）を担持した注射可能なガス生成マルチモードシステムを開発しました。ナノ粒子は体内の酸性腫瘍組織で二酸化炭素（CO₂）ガスを連続生成し、超音波イメージング下で腫瘍に強いエコー信号を与えます。さらに、ナノ粒子は腫瘍組織のMRと蛍光イメージングに優れた効果をもたらします。結果は、このpH応答性NPシステムがMR/US/蛍光イメージングで良好な効果を提供することを示しています。本研究は、マルチモーダル腫瘍イメージングへの有用な参照となります。

はじめに

臨床実践では、マイクロバブルが主に超音波造影剤として、様々な臓器と血管のリアルタイムイメージングに用いられています[1-3]。従来の超音波造影剤は通常、空気やパーフルオロカーボンガスを包む脂質やタンパク質などの材料で構成されます。マイクロスフェアに封入されたガス種は、マイクロバブル欠陥の急速な拡散により血中で安定性が低く半減期が短いです[4-6]。さらに、ガス充填マイクロバブルの粒子サイズが通常大きい（約1-8 μm）ため、組織外染み出しにより腫瘍微小環境への浸透が困難です。したがって、ミクロンサイズバブルの血管内イメージング応用は限られています[7]。理想的な超音波造影剤は一般に、組織血管空間を通過する最適サイズ、十分な音響効果持続時間、良好な標的性と生体適合性、体外への容易な排泄を示すべきです[8, 9]。「ガス生成ナノ粒子」の概念が先行研究で提案され、超音波造影イメージングへの潜在性を持っています[10-12]。これらガス生成ナノ粒子は、現在のガス充填マイクロバブルより性能が優れ、連続生成ガスが強力な超音波イメージングを可能にします。ガス生成ナノ粒子は浸透と保持を強化し、血中で安定して循環し、腫瘍組織に効果的に蓄積できます[13, 14]。

従来のイメージング法（MRI、CT、超音波など）では、長い取得時間、高放射線被曝、低感度により、微小で潜在的な腫瘍の検出が課題となっています[15, 16]。異なるイメージング法を統合し、マルチモーダルイメージング技術を開発して、がん早期発見のための統合的シナジーを達成する必要があります[17-19]。超常磁性酸化鉄（Fe₃O₄）ナノ粒子は、T2強調イメージングでネガティブMRI造影剤として使用できます[20, 21]。Fe₃O₄は、小粒子サイズ、強い透過性、高磁化、良好な代謝、比較的低毒性など魅力的な全体特性を持ちます[22, 23]。高い緩和性とコントラストにより、Fe₃O₄造影剤は早期がんMRI診断で広く研究されています[24-26]。また、リアルタイム蛍光イメージングは優れた分解能を持ち、腫瘍ステージング定義、腫瘍切除ガイド、治療効果モニタリングに貴重な手法となり得ます[27, 28]。

本研究では、これらナノ粒子を主にポリ（乳酸-グリコール酸）（PLGA）でカプセル化しました。PLGAはFDA承認済みの生体安全材料です[29, 30]。PLGA粒子をRGDペプチドで修飾し、乳がん細胞表面のαvβ3インテグリンとの結合を可能にし、Cy5.5を蛍光色素としてin vivoイメージング用に、Fe₃O₄をMRI用T2ネガティブ造影剤として封入しました（スキーム1a）。腫瘍組織では上昇した解糖系により乳酸とプロトンが細胞外環境で多く生成されるため、腫瘍組織pH（6.8-7.2）は正常組織（pH 7.4）より低くなります[31-33]。そこで、PLGA内に炭酸ナトリウム（Na₂CO₃）を設計し、腫瘍組織の低pHでCO₂気泡を生成して超音波イメージングに利用しました。これらマルチモードナノ粒子のin vitroイメージングへの有望な応用を検証するため、細胞毒性、標的特異性、腫瘍組織内バイオディストリビューションなど、3つのイメージングモードで包括的特性を体系的に評価しました。

結果と考察

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsの合成と特性評価

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsは、生体適合性ポリマーPLGAにFe₃O₄とNa₂CO₃、生分解性化学結合によるインテグリン標的剤をカプセル化して、RGD標的マルチモード造影剤として設計しました（スキーム1b）。

透過型電子顕微鏡像では、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsが明確な球状で、シェルに均一に分散した酸化鉄粒子が見えました（図1a）。動的光散乱で測定した平均動的サイズは117.6 nm、平均多分散性指数は0.234でした（図1b）。ゼータ電位測定で表面電荷は-21.7 mVと確認されました（図1c）。蛍光スペクトル測定で、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGDの最大発光波長が685 nmで、Cy5.5がPLGAコアに成功裏に封入されたことを示しました（図1d）。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGDと遊離Fe₃O₄ NPsの飽和磁化値はそれぞれ32.6と42.5 emu/gでした（図1e）。これらの所見は、室温でのナノ粒子の超常磁性を示しています。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGDのFTIRスペクトルでは、N-H伸縮振動と-OH吸収ピークが3432 cm⁻¹付近に出現。さらに、C=O伸縮振動の増強（1628 cm⁻¹）が見られました。非標的NPsと比較して、標的NPsでは1735 cm⁻¹の特徴ピーク（カルボキシル基）が著しく減少し、マイクロスフェア表面のカルボキシル基とRGDペプチドのアミノ基との結合を示しました。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsのin vitro結合を図1fに示します。

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsのin vitro結合

αvβ3インテグリンは一般に乳がん腫瘍内皮細胞で高発現し、腫瘍転移を促進します[33-36]。MDA-MB-231細胞でのαvインテグリン発現の細胞免疫蛍光は、MCF-7細胞よりはるかに高く、A549細胞を陽性対照としました（図2a）。NPsの細胞取り込みをCLSMで研究しました（図2b）。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsは、非標的NPsよりMD-MB-231細胞への結合率がはるかに高かったです。蛍光像では、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsが細胞質に結合し、マージ像でαvインテグリン発現部位と同一位置であることが示されました[37, 38]。

細胞毒性アッセイ

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsのin vitro細胞毒性を、CCK8アッセイでMDA-MB-231細胞で推定しました。A549とMCF-7細胞をNPs処理対照としました（図2c）。Fe濃度5-80 μg/mL範囲で、A549とMB231細胞の生存率は有意に低下せず、両者とも70%以上でした。対照的に、MCF-7細胞はFe濃度40 μg/mL以上で細胞生存率が約50%まで有意に低下しました。CCK8結果は、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsが与えられた濃度範囲でMDA-MB-231細胞に有意に低い細胞毒性を示すことを実証しました。

in vitro造影イメージング

アガーゼラチンファントムを用い、異なるpH値（図3a）でNa₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsの性能をin vitroで研究しました。弱酸性pH（pH 6.8）では、pH 7.2と比較してNa₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsの超音波造影像が有意に増強されました。これはpH 7.2では超音波イメージングに十分なCO₂気泡が生成されないためと考えられます。対照的に、弱酸性環境では超音波イメージングに十分な気泡が生成されました。この特性は、in vivoで高い組織異質性と多様なpHレベル（pH 6.8-7.2）を示す腫瘍に関連しています[32, 39, 40]。超音波画像の信号強度を解析しました（図3b）。非標的NP（pH 7）、非標的NP（pH 5）、標的NP（pH 7）、標的NP（pH 5）群のブランク群相対信号強度比はそれぞれ112%、145%、167%、178±4%で、標的NP群（pH 5）が最も強いUS信号を持つことを明確に示しています。

in vitro MRI研究では、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs中のFe濃度増加に伴い、T2強調信号強度が有意に低下し、これらNPsがT2 MRI造影剤として使用可能であることを示しました（図3c）。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsの横緩和率(r2)は19.597 mM⁻¹s⁻¹と算出されました。このr2値は他の多くのMRI超常磁性剤より低いものの、Fe₃O₄組成によりr2を増加させ、臨床使用SPIO粒子のr2の2.94倍でした。

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsの超音波造影イメージング

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsの腫瘍超音波イメージングへの可能性を実証するため、乳がん異種移植ヌードマウスに尾静脈注射し、時間経過に伴う超音波像をモニタリングしました（図4a）。注射前、腫瘍、肝臓、皮下領域の画像を記録。注射直後、腫瘍組織領域に造影増強は見られませんでした。注射30分後から腫瘍領域の増強が観察され、90分間持続しました。in vivo超音波結果は、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsが酸性腫瘍組織で十分な気泡を生成し、超音波イメージング用のエコー反射率を生み出すことを示しました。対照として、標的NPs注射後、異なる時間で肝臓と皮下組織の画像も取得しました。観察期間を通じて、皮下注射領域に有意な増強は見られず、時間とともに減少する肝臓の増強は腫瘍より有意に低かったです（図4b）。この結果は、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsが生理的pHで体内循環しても、超音波造影増強のための実質的なCO₂気泡を生成しないことを示しています。

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsのMRI

in vivo MRIでは、NPsが腫瘍特異的イメージングに使用可能か実証するため、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsを腫瘍と筋肉に直接注射しました。結果、標的NPs注射後、腫瘍領域でT2-MRコントラストの有意な低下を示し、信号強度が注射前8875から120分後5972へ有意に減少しました（図5a, b）。しかし、同量ナノ粒子注射でも、皮下筋肉領域ではT2信号低下がはるかに小さかったです。この発見は、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsが過敏性インテグリン標的T2-MR造影剤として腫瘍標的イメージングに有効であることを実証します。尾静脈注射群では、T2-MRイメージングも注射24時間後に腫瘍で明確なコントラスト低下を示し、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsの高い腫瘍蓄積を実証しました（図5c, d）。さらに、肝臓と腎臓でT2信号低下が観察され、NPs中の鉄イオンが体内から速やかに排泄されることを示しました。したがって、MRIはPLGA包みFe₃O₄ナノ粒子が、特にRGD媒介標的化により透過性と保持（EPR）効果で効率的な受動的腫瘍標的化を示すが、in vivoで分解・速やかに排泄されることを明らかにしました。

蛍光イメージングと組織学

200 μl NPsをマウスに尾静脈注射し、in vivo蛍光イメージングを行いました。RGD標的NPs注射群では、Cy5.5蛍光信号が腫瘍領域で徐々に増加し、注射4時間後にピークに達し、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsが腫瘍に効果的に蓄積することを示しました。非標的群では、NPsが注射後全身に分布し速やかにクリアランスされ、長期間腫瘍に蓄積しませんでした（図6a）。その後マウスを解剖し、主要臓器と腫瘍を回収してin vitro蛍光イメージングを行い、標的NPsの高い腫瘍取り込みが明らかになりました（図6b, c）。標的NPs注射マウスの腫瘍におけるCy5.5蛍光強度は、非標的NPs注射マウスの1.5倍でした。

さらに、凍結腫瘍切片の組織蛍光イメージングで、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsの腫瘍特異的標的化を検証しました（図7a）。αvとβ3インテグリン抗体による腫瘍切片免疫蛍光染色で、腫瘍組織でのαvβ3インテグリン顕著発現が明らかになりました。αvとβ3インテグリン蛍光を、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsのCy5.5蛍光とマージして免疫染色像を取得し、共局在を明らかにしました。腫瘍組織の免疫蛍光結果は、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsがMB231悪性乳がんのαvβ3インテグリンに特異的に結合することを示しました。また、標的群と非標的群のH&E染色比較では、すべての臓器組織切片が正常な病理形態を示し、組織学的損傷反応はありませんでした（図7b）。以上の細胞毒性と組織学的分析結果すべてが、Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsがin vivoで主要臓器組織に有意な毒性を誘発せず、その良好な生体適合性がPLGAに合理的に帰属できることを示しました。

結論

結論として、以上の結果は、腫瘍微小環境で活性化される磁気標的とガス生成システムを通じた乳がんMRIのための創造的で成功したアプローチを示しています。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPsは、MR/超音波/蛍光イメージングモードで優れたイメージング性能と良好な生体適合性を示します。本研究は、改善されたマルチモーダルイメージングによる腫瘍診断の強力な可能性を示しています。