Cu:Ag二金属ナノ粒子：薬剤耐性菌株に対する抗菌効果の向上－分子ドッキング研究

概要

本研究では、抗生物質耐性菌に対する有望な抗菌剤として開発されたCu:Ag二金属ナノ粒子において、Agのさまざまな濃度が抗菌活性に及ぼす影響を評価した。Cuを固定量とし、Agの濃度比（2.5、5.0、7.5、10 wt%）を変えた4種類のCu:Ag二金属ナノ粒子（1:0.025、1:0.050、1:0.075、1:0.1と標識）を、共沈法により合成した。溶媒にはアンモニア水と脱イオン水、キャッピング剤にはポリビニルピロリドン、還元剤にはホウ化ナトリウムとアスコルビン酸を用いた。合成されたナノ粒子は多様な手法で特性評価を行った。

XRD解析により相の純度が確認され、CuとAgそれぞれに由来する明確な面心立方（fcc）構造の存在が検出された。FTIR分光法では、さまざまな官能基に対応する振動モードと、二金属に由来する特徴的なピークが確認された。UV-可視分光法では、Ag含有量の増加に伴ってバンドギャップが減少することが明らかになった。SEMおよびHR-TEM観察では、AgドープCu二金属ナノ粒子の球状形態と、大小さまざまな凝集体が観察された。試料はさまざまな寸法と層間隔を示した。

合成されたCu:Ag二金属NPsの殺菌作用は、Staphylococcus aureus（S. aureus）、Escherichia coli（E. coli）、Acinetobacter baumannii（A. baumannii）に対して、Agドーパント濃度に応じてそれぞれ0.85–2.8 mm、0.55–1.95 mm、0.65–1.85 mmの阻害ゾーンを示し、統計的に有意な差（P < 0.05）が認められた。総じて、Cu:Ag二金属NPsはグラム陰性菌よりもグラム陽性菌に対して強い効力を示した。

分子ドッキング研究では、S. aureusおよびA. baumannii由来の細胞壁生合成経路の鍵酵素であるβ-ラクタマーゼに対するCu-Ag二金属NPsの結合を解析し、それぞれ−4.981 kcal/mol、−4.013 kcal/molの結合スコアを得た。また、脂肪酸生合成経路の酵素であるA. baumannii由来FabI（−3.385 kcal/mol）、S. aureus由来FabI（−3.012 kcal/mol）、E. coli由来FabH（−4.372 kcal/mol）との相互作用も解析した。これらの理論計算は、Cu-Ag二金属NPsがこれらの酵素の潜在的阻害剤となり得ることを示唆している。これらの物質のin vitro阻害可能性を探索することは、新たな抗生物質発見の道を開く可能性がある。

はじめに

細菌、真菌、ウイルス、寄生虫など多様な微生物が地球環境に存在し、医療機器、ヘルスケア製品、加工食品、浄水システム、家庭用衛生製品の生産と使用に支障をきたしている[1,2]。抗生物質はヒトや動物の感染症治療に常用されているが、頻繁な使用は細菌の薬剤耐性化を招き、体内の「善玉菌」を減少させる欠点がある[3-7]。薬剤耐性菌による感染症は現代医療の重大な懸念事項となっており、新たな抗菌療法の開発が急務とされている。

ナノテクノロジーは、金属および金属酸化物ナノ粒子（Ag、Cu、CuO、TiO₂、SiO₂、MgO、ZnOなど）の生産を通じて、増加し続ける抗菌薬耐性微生物との戦いに大きく貢献してきた[8-12]。特にCuとAgナノ粒子は有望な抗菌特性を示す。近年、二金属ナノ粒子が化学、材料科学、バイオテクノロジー、環境保護など幅広い分野で開発・応用されている。CuとAgを含む二金属NPsは、表面原子の割合が高く比表面積が大きいことから広く研究されており[13]、化学的、光学的、触媒的、生物学的、プラズモニック、特に抗菌特性が向上することから注目されている[14-20]。

CuとAgを個別に用いる場合、有望な光学的・触媒的・構造的特性を示さず、二金属化も困難である。一方、両金属を組み合わせることで、コア-シェル、ダンベル、二重界面、ランダム混合、花形などの最終構造に応じて、抗菌活性を制御できる新たな機会が生まれる[27-31]。二金属NPsの合成法には共沈法、ゾルゲル法、水熱法、還元法、マイクロエマルション法、ポリオール法などがある[32-37]。

本研究では、共沈法を用いてCu:Ag二金属NPsを合成し、4種類のAg濃度試料を調製した。Ag濃度の増加に伴い、発熱と悪心を引き起こすAcinetobacter baumanniiに対する活性が増強された。合成物は急速な成長過程で赤色を呈し、Ag濃度の上昇に伴って抗菌活性が高まることが示唆された。さらに、細胞壁生合成経路のβ-ラクタマーゼ、脂肪酸生合成経路のFabIおよびFabH酵素を標的とした分子ドッキング研究により、Cu:Ag二金属NPsの相互作用パターンをin silicoで予測した。

方法

材料

前駆体として塩化銅(II)（CuCl₂·0.2H₂O、98.9%）と硝酸銀（AgNO₃）、キャッピング剤としてポリビニルピロリドン（PVP、平均分子量40,000）、還元剤としてホウ化ナトリウム（NaBH₄、99.9%）とL-アスコルビン酸（C₆H₈O₆、99.0%）、およびアンモニア水（NH₄OH）を用いた。すべてSigma Aldrich（米国）製である。

二金属Cu:Ag NPsの合成

図1に示す共沈法により二金属Cu:Ag NPsを調製した。脱イオン水に1.25 gのPVPと0.5 gのアスコルビン酸を加え、100℃で激しく攪拌した。別途、40 mLのアンモニア水溶液を2つ調製し、一方に1.7 gの塩化銅、もう一方に1.7 gの硝酸銀を溶解した。これら2溶液を最初の溶液に順次注ぎ、さらに0.5 gのNaBH₄を添加した。最終溶液を100℃で4時間攪拌して均質化し、6000 rpmで遠心分離してNPsを完全に回収した。得られた二金属NPsを100℃で乾燥し、水分と不純物を完全に除去して純粋な二金属製品を得た[12]。同様に、固定Cu比に対してAg濃度（モル比2.5%、5%、7.5%、10%）を変えた4試料を調製した。

抗菌活性評価

牛乳房炎乳から分離した病原性細菌S. aureus、E. coli、A. baumanniiに対するCu:Ag二金属NPsのin vitro殺菌可能性を、寒天培地穴あけ拡散法で評価した。マンニトール食塩寒天、マッコンキー寒天、リウリア・ベルタニ寒天に、1.5 × 10⁸ CFU/mlに調整した対数増殖期の細菌を塗布した。培地固化後、直径15 mm、10 μL（5 μg/mL）のウェルを5つ穿孔し、各比率のCu:Ag二金属NPsを充填した。陽性対照としてアモキシシリン10 μL（5 μg/mL）、陰性対照としてDIW 50 μLを用いた。37℃で15時間培養後、形成された阻害ゾーン（mm）を測定して殺菌活性を判定した。

統計解析

阻害ゾーン（mm）測定値に基づく殺菌活性は、SPSS 20.0を用いた一元配置分散分析（ANOVA）により統計的有意性を検定した[57]。

分子ドッキング研究

抗生物質は細胞壁破壊、生化学プロセスの撹乱、細胞膜損傷、バイオフィルムへの浸透などにより細菌増殖を抑制・殺菌する[38]。近年、細胞壁破壊や既知抗生物質と類似の機構で栄養源を遮断することで殺菌作用を示すナノ粒子が多数報告されている[39-41]。したがって、これらの生化学経路に関わる酵素は抗生物質開発の重要かつ魅力的な標的と考えられる[12]。本研究では、細胞壁生合成経路のβ-ラクタマーゼ、脂肪酸生合成経路のFabHおよびFabIを標的酵素として選定し、Cu:Ag二金属NPsが活性ポケット内で阻害剤として相互作用する機構を評価した（図2参照）。

タンパク質データバンクから選択酵素の3D構造パラメータを取得した：β-ラクタマーゼ（PDB: 4U0X、分解能2.03 Å）[42]、A. baumannii由来FabI（PDB: 6AH9、1.74 Å）[43]、S. aureus由来β-ラクタマーゼ（PDB: 1MWU、2.6 Å）[44]およびFabI（PDB: 4CV1、1.95 Å）[45]、E. coli由来FabH（PDB: 4Z8D、2.0 Å）[46]。

ICM Molsoft v3.8-4a以上（Molsoft L.L.C.）を用いて分子ドッキングを行い、活性部位のキー残基との結合相互作用を特定した[47]。ICMのタンパク質/受容体準備ツールで選択酵素の最適化と構造準備を行い（極性水素原子の付加、水分子の削除、デフォルトパラメータでのエネルギー最小化）、共結晶リガンドを除去してNPsドッキングの空間を確保した。結晶化リガンドの位置をグリッドボックスで指定して結合ポケットを定義し、上位10コンフォメーション中で最も結合エネルギーが低いものを選択して相互作用パターンと結合傾向を解析した。PyMOLとDiscovery Studio Visualizerで解析と3D表示を行った[48]。Cu:Ag二金属NPsの構造はPubChemから.sdf形式で取得した。

特性評価

構造解析と相純度はXRD（PAN analytical X'pert pro、Cu-Kα放射、λ=0.154 nm、20°–80°）で観察した。官能基の振動モードはFTIR（パーキンエルマー分光計）で評価した。吸収スペクトルはUV-可視分光光度計（Genesys 10S）で取得した。表面形態はFESEM-EDS（JSM-6610LV）とHR-TEM（JEOL JEM 2100F）で観察した。分子ドッキング解析にはICM v3.8-4a以上を用いた。

結果と考察

XRD解析により、調製品の相構成と結晶構造を評価した。図3aに20°–80°のXRDパターンを示す。二金属Cu:Agでは、約38.2°、46°、64.4°、77.1°の反射がfcc Ag相の(111)、(200)、(220)、(311)面に帰属される（JCPDS No. 04-0783）[32,49-52]。一方、Cuでは32.6°、44.2°、51°の回折がそれぞれ(110)、(111)、(200)格子面に対応し、fcc構造のCuOと金属Cuの存在を確認した（JCPDS No. 04-0836）[32,53-56]。抽出パターンではAgとCuの両ピークが観察され、両相を含むNPsの形成を示した。さらに、低Ag含有試料（1:0.025、1:0.050、1:0.075）ではCuOピークが検出され、Cu NPsが高温で酸化され、低Ag濃度では非保護的振る舞いを示すことが分かった[52]。逆に最高Ag含有試料（1:0.1）ではCuOピーク強度が低く、部分的に酸化物フリーな生成物が形成されたことを示唆する[57]。これはAg添加により二金属NPsの耐酸化性が向上することを意味する[52]。装置検出限界内では不純物ピークは検出されず、各結晶面は原子密度に基づくエネルギー的に異なるサイトを含む。CuとAg NPsはともに(111)面で高い原子密度を持ち、最大配向面を露出させる[51,58]。ブラッグの法則を用いて、AgとCuのd-spacingはそれぞれ0.24 nmと0.21 nmで、両元素の(111)面に対応し、HR-TEM結果（図6）と一致した[51,59-62]。SAEDリング（図3b-d）は明確なリングパターンを示し、良好に結晶化した生成物であり、XRDパターンとよく一致した。

FTIRスペクトル（図3e、500–4000 cm⁻¹）では、600–900 cm⁻¹の透過バンドがCu:Ag結合の形成に由来する[63]。約1200および1400 cm⁻¹のバンドはそれぞれC-OとC-Hに、約1800および2100 cm⁻¹のピークはPVPとNH₄OH由来のC=OとN-H結合に帰属される[64]。約2800および3400 cm⁻¹の透過はC≡Nと水酸基（O-H）の存在を示す[64]。

UV-Vis吸収スペクトル（図4a）では、340、410、500 nmに明確な吸収バンドが見られ、金属AgとCuの表面プラズモン共鳴吸収に帰属される[52]。410 nmのバンドはAg NPs、510 nmのピークはCu NPsの存在に由来する[52,57-67]。XRD結果でも確認されたように、二金属NPsは単一の二金属相ではなく、明確なAgとCuの別相として形成されることが示唆される[52]。Ag含有量増加に伴い410 nmの吸収バンドがわずかにレッドシフトし、最大吸収が増加した[58]。タウクの式を用いてバンドギャップを算出し、それぞれ3.2、2.9、2.7、2.6 eVとなった（図4b-e）。

SEM画像（図5a-d）では、大粒子表面に微小粒子が堆積し、Ag含有量が2.5%から7.5%に増加するにつれてさまざまな形態の粒子が形成され、最終的に塊状のCu:Ag NPsとなった。さらに、不均一で微小なAg粒子の蓄積がドーパント濃度増加とともに増大し、表面により散在したブロックが出現した。これはAgドーピングがCuの形態に大きな影響を与えることを示し、HR-TEMでも確認された（図5e-h）。

HR-TEM（10 nm分解能）で形態とd-spacingを詳細に解析した。図6aではCu NPsのd-spacing（0.21 nm）がCuの(111)面に対応し、XRD結果（図3a）と一致した。図6bでは層間隔が0.21から0.22 nmにわずかに増加し、Ag NPsの0.24 nm間平面距離が(111)面と一致した。図6c、dでは各試料の層間隔と別相が示され、図6eではAgとCu NPsの粒子形状が示された。HR-TEM像ではコア-シェル構造を有する粒子が観察された。図6dでは単一粒子内でCuとAgに由来する格子縞が記録され、異なるCu:Ag比を持つコア-シェル二金属NPsが形成され、不規則な準球状NPsを生成することを強く示唆する。また、単一粒子内で暗部と明部のコントラスト差が見られ、2種の異なる構成物質の存在、すなわち二金属Cu:Ag粒子の生成を示唆する[70,71]。

EDSスペクトルに二金属由来の明確なピークと元素組成が見られ、Cu:Ag NPsの形成が確認された。図7aは1:0.050試料のEDSスペクトルで、CuとAgの明確なピークを示す。図7bは1:0.10試料で、CとOのピークが検出されたが、これはSEM観察用のカーボンタブやSEM-EDSセンサーのバックグラウンドに起因する。

寒天培地穴あけ拡散法によるin vitro殺菌効果を表1に示す。合成NPs濃度と阻害ゾーン（mm）には正の比例関係が認められた。Agドーパント（2.5、5、7.5、10 wt%）に対するS. aureus、E. coli、A. baumanniiへの統計的に有意な（P < 0.05）阻害ゾーンはそれぞれ0.85–2.8 mm、0.55–1.95 mm、0.65–1.85 mmの範囲であった（表1）。すべての結果はDIW（0 mm）とアモキシシリン（4 mm）を陰性・陽性対照として比較した。同様に、ドープNPsの効率はS. aureus、E. coli、A. baumanniiに対してそれぞれ21.2–70%、13.7–48.7%、16.2–46.2%増加した。全体としてCu:Ag二金属NPsはE. coliとA. baumannii（グラム陰性）よりもS. aureus（グラム陽性）に対して強力であった。

NPsのサイズ、濃度、形状はナノ構造が生成する酸化ストレスに直接影響する。AgドープCu二金属NPsのwt%増加により陽イオン（++）の可用性が高まるため、阻害ゾーン（mm）としての殺菌効果が向上した。殺菌作用はサイズと濃度に関して逆相関を示す[58,59]。ナノサイズ構造は反応性酸素種（ROS）を効率的に生成し、細菌細胞膜に存在して細胞小器官の流出を引き起こし、最終的に細菌死に至らせる[60]。ROS生成に加え、Ag⁺とCu²⁺の陽イオンが細菌細胞膜の負電荷部分と相互作用し、細胞溶解と細菌崩壊を通じて濃度依存的に殺菌効果を高める[58,61]。

各種ナノ粒子の生物学的応用は過去数十年間広く研究されてきた。NPsの独自特性により、従来の抗生物質に代わる殺菌剤として幅広く利用されている。NPsは細菌細胞と相互作用し、細胞膜透過を撹乱し、主要代謝経路を破壊する[72]。NPsの細菌に対する毒性メカニズムの解明が必要である。NPsは静電気力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などを通じて細菌細胞と相互作用し、最終的に細菌死をもたらすと考えられる。酵素は細菌感染の主要な病原因子であり、その活性阻害は感染制御に役立つ[73]。本研究では、細胞壁および脂肪酸生合成経路の酵素標的に対するCu:Ag NPsの分子ドッキング研究を行い、これらのNPsが活性ポケット内で示す結合相互作用パターンを特定した。A. baumannii、S. aureus、E. coliに対するin vitro抗菌可能性を考慮し、これらの微生物由来の酵素標的を選定して殺菌活性の背後にある可能性のある機構を探った。

A. baumannii由来β-ラクタマーゼとの最良ドッキングコンフォメーションでは、Glu272（2.8 Å）およびSer286（3.2 Å）との水素結合、Val292との金属接触相互作用が見られ、ドッキングスコアは−4.013 kcal/molであった（図8a）。同様に、S. aureus由来β-ラクタマーゼとの結合スコアは−4.981 kcal/molで、Ser403（3.2 Å）、Tyr519（3.6 Å）、Gln521（3.0 Å）、Asn464（3.1 Å）との水素結合相互作用を示した（図8b）。

第2の標的酵素であるFabI（脂肪酸生合成経路）に対しても、Cu:Ag二金属NPsは潜在的阻害剤として優れた結合を示した。A. baumannii由来FabIに対する結合スコアは−3.385 kcal/molで、Ser201（2.7 Å）、Ala199（3.5 Å）、Leu198（3.3 Å）との水素結合を有した（図8c）。S. aureus由来FabIとの最良ドッキングコンフォメーションでは、Gly202（2.5 Å）とGln155（2.5 Å）との水素結合、スコア−3.012 kcal/molであった（図8d）。

さらに、E. coli由来FabHに対する結合能も評価し、結合スコア−4.372 kcal/mol、Thr254（3.5 Å）、HIE244（2.6 Å）、Glu302（3.0 Å）との水素結合相互作用を確認した（図8e）。

結論

細菌関連疾患対策への応用を目的として、共沈法によりCu:Ag二金属ナノ粒子を調製した。XRDプロファイルはfcc構造のCuO、金属Cu、Ag粒子の存在を確認した。AgとCuの両ピークが観察され、AgとCu相を含む二金属NPsの形成を示した。XRDで観察された面はSAEDリングとよく対応した。調製品に結合した化学基と、600–900 cm⁻¹の特徴的な透過バンドはCu:Ag結合形成に由来する。UV-Visスペクトルでは410 nmに吸収が見られ（Ag NPs由来）、510 nmのピークはCu NPsの存在に帰属された。HR-TEM像の粒子はコア-シェル構造を示し、Cu:Ag NPsは明確に異なるCu:Ag比を持つ二金属NPsを形成し、不規則な準球状NPsを生成した。Cu NPsのd-spacing（0.21 nm）はXRDで検出されたCuの(111)面に対応し、層間隔のわずかな増加（0.21→0.22 nm）とAg NPsの0.24 nm層間距離は(111)面と一致した。分子ドッキング研究はin vitro殺菌活性と良好な一致を示した。Cu:Ag二金属NPsの、細胞壁生合成経路のβ-ラクタマーゼ、脂肪酸生合成経路のFabIおよびFabHに対する結合傾向は、それらの阻害可能性を示唆しており、酵素阻害試験による更なる検証が必要である。