金ナノ粒子がヒト肝ミクロソームにおけるテストステロン代謝を調節：サイズ、表面化学、プロテインコロナの影響

概要

金ナノ粒子（AuNP）とタンパク質が形成するコロナ複合体は、理化学的性質を変化させることでシトクロムP450（CYP）によるテストステロン（TST）代謝を変調する可能性があります。本研究では、ナノ粒子のサイズ、表面化学、ヒト血漿プロテインコロナ（PC）が、プールヒト肝ミクロソーム（pHLM）におけるTST代謝に及ぼす影響を検討しました。分岐ポリエチレンイミン（BPEI）、リポ酸（LA）、ポリエチレングリコール（PEG）で機能化された20-40nmおよび80nmのAuNPを、裸粒子とPC形成後の両方で評価しています。

pHLMにおいて、40nmの裸AuNPは5種類のヒドロキシル化TST代謝産物の生成を阻害しましたが、80nm粒子ではその効果は弱かったです。PCの形成はこれらの阻害作用をほぼ緩和しました。驚くべきことに、裸AuNPはアンドロステンジオン（AD）の生成を増加させました。単一ドナーHLMでは個体差が観察され、ほとんどのAuNPが非阻害濃度でTST代謝を抑制した一方、PC-PEG-AuNPはAD生成を刺激しました。これらの知見は、AuNPがTST代謝を調節することで潜在的な内分泌かく乱物質となり得ることを示唆し、他のナノマテリアルのスクリーニングのための枠組みを提供します。

はじめに

AuNPはその独自の光学的・物理的特性により、薬物送達、診断、消費者製品などで広く利用されています（参考文献1-3）。生体液に曝露されると、AuNPは速やかにタンパク質を吸着し、コロナを形成します。これにより表面化学、タンパク質構造、そして細胞毒性、細胞取り込み、CYP酵素活性などの下流の生物学的応答が変化します（参考文献4-7）。in vitro研究では、AuNPがヒト肝細胞、C3A肝腫瘍細胞株、精子細胞に毒性を示すことが報告されています（参考文献6-8）が、PCの存在は表面化学に依存してこれらの影響を減弱または増強させることがわかっています（参考文献6-7）。また、PC形成はナノ粒子のサイズや電荷に関わらず、様々な細胞タイプでの細胞取り込みを妨げることも明らかになっています（参考文献6-12）。

肝臓のCYP酵素は内因性・外因性化合物を代謝します。医薬品、農薬、ナノ粒子など複数の物質がステロイドホルモンの合成と代謝を撹乱し、生理機能の変化をもたらすことが知られています（参考文献13-17）。テストステロン（TST）は主要なアンドロゲンであり、CYP3A4の基質として6β-OH-TSTにヒドロキシル化されます。さらにCYP3A4による追加のヒドロキシル化で2β-OH-TST、15β-OH-TST、16α-OH-TST、16β-OH-TSTが生成され、CYP2D6はTSTを脱アルキル化してアンドロステンジオン（AD）を生成します（参考文献17, 19, 27）。先行研究では、裸およびPC被覆AuNPがCYP1A2、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4など幅広いCYP酵素を調節することが示されています（参考文献6, 7, 20-21）。AgNPもHLMでCYP3A4活性を抑制することが報告されています（参考文献22）。BPEIおよびLA修飾AuNPはC3A細胞でCYP3A4活性を低下させますが、PCによってこの効果は緩和されます（参考文献7）。in vivoでは、小型AuNPが肝臓と脾臓に蓄積し、肝臓のCyp1a1およびCyp2b発現を変化させることが確認されています（参考文献23）。これらの知見を踏まえ、本研究ではPCがAuNPのサイズ、電荷、表面化学に与える影響を通じて、pHLMおよび単一ドナーHLMにおけるCYP媒介TST代謝にどう影響するかを調査しました。

方法

試薬

テストステロン、その代謝産物、¹³C₃標識TSTはMilliporeSigma（ミズーリ州セントルイス）から入手しました。その他の試薬はSteraloidsまたはMilliporeSigma製です。LC-MSグレード溶媒はFisher Scientific製、超純水はMerck Synergy® UV-Rシステムで調製しました。

ヒト肝ミクロソーム

プールHLM（pHLM、200ドナー由来：男性100、女性100）および単一ドナーHLMはCorning Inc.（ノースカロライナ州シャーロット）から購入しました。ドナー別CYP活性は補足表S1に詳細を記載しています。

金ナノ粒子の合成

Biopure™ 40nmおよび80nm AuNP（BPEI、LA、PEG機能化）をnanoComposixから購入しました。コア合成はK₂CO₃存在下でHAuCl₄·3H₂Oを還元し、エージングとタンジェンシャルフロー濾過（TFF）を行いました。表面機能化：LA（0.2:1 w/w）またはPEG（0.5:1 w/w）を添加後、TFFと無菌濾過を実施。BPEI表面はEDC/NHS化学でLAカルボキシルとBPEIアミノ基を結合させ、未結合BPEIをTFFと遠心分離で除去しました。

プロテインコロナの調製

プールヒト血漿（n=5）を40nmまたは80nm AuNPと55%血漿濃度で、37℃、250rpm、1時間撹拌インキュベートしました。PC-AuNPを遠心分離（20,000×g、20℃、20分）で回収し、PBSで3回洗浄後、PBSに再懸濁してキャラクタリゼーション用としました。

物理的特性評価

DLSとTEMで粒子径、分散度、ゼータ電位を測定しました。測定はDI水、PBS、ミクロソームインキュベーションバッファー（pH 7.4）で0分と45分後（37℃）に実施。TEMグリッドはTecnai G2 Spirit BioTWIN（120kV）で観察。UV-VisスペクトルはSpectra Max i3リーダーで記録しました。

インビトロテストステロン代謝試験

TST（10µM）の線形代謝が1.3-9.3mg/mLミクロソームタンパク質濃度で60分まで確認されました。pHLMをTSTと様々な濃度の裸またはPC-AuNP（0-571µg/mL）でインキュベート。NADPH（0.25mM NADP、2.5mM グルコース-6-リン酸、2U/mL デヒドロゲナーゼ）あり/なしで反応を開始し、37℃で45分後、4%リン酸で停止。上清を遠心分離、-20℃保存後、LC-MS/MSで分析。単一ドナーHLMでも同様に10µg/mL AuNPで処理しました。

標準品とサンプル調製

一次標準品（1mM）と内部標準（¹³C₃-TST）をメタノールで調製。作業標準は0.01-200µM範囲。QCサンプルは0.01、0.05、0.1µM。サンプルに内部標準をスパイクし、Oasis PRIME HLBプレートで抽出、洗浄、溶出、希釈後、LC-MS/MSで分析。

液体クロマトグラフィー-質量分析

Waters UPLC HSS T3カラム（2.1×50mm、1.8µm）、流量600µL/minで分離。勾配：30% Bから8.4分で98% B。ESI⁺ソース：4000V、150℃；脱溶媒化450℃。MRM遷移は補足表S2。校正曲線0.001-20µM。LOD 0.001µM、LOQ 0.005µM。

統計解析

D_HとPDIの差にはStudentのt検定。IC₅₀とEC₅₀はGraphPad Prism®でHill式により算出。一元配置分散分析に続きTukeyのHSD検定（p<0.05）でAuNP効果を評価。Pearson相関係数でCYP活性と代謝産物生成の相関を検証。

結果と考察

AuNPの物理化学的特性

TEMにより、40nmと80nmのPC-BPEI-AuNPを除くすべての裸およびPC-AuNPが単分散であることを確認。これらはPBSで凝集を示しました。40nm裸BPEI-およびLA-AuNP、PC-PEG-AuNPでは45分間でD_H値が増加、80nm PC-LA-AuNPでは減少。40nm裸およびPC-PEG-AuNPでPDI増加、裸BPEI-AuNPでゼータ電位が経時的に低下。これらの変化は、PCがNPサイズ、吸光度、形態を変化させるという先行知見と一致します（参考文献6, 7, 10, 26）。

プールHLMにおけるTST代謝

pHLMで6種類のTST代謝産物（5種のヒドロキシル化産物とAD）を検出。裸40nmおよび80nm AuNPが2β-OH-TST、6β-OH-TST、15β-OH-TST生成を濃度依存的に阻害（IC₅₀：416-1113µg/mL）。16α-および16β-OH-TSTは阻害されず、ただし40nm BPEI-AuNPが最高濃度で16β-OH-TSTをわずかに抑制。興味深いことに、裸AuNPは高濃度でAD生成を増加（40nm BPEI-AuNPで4.3pmol mg⁻¹ min⁻¹）。PC被覆AuNPはこれらの阻害をほぼ消失させ、80nm LA-AuNPのAD刺激効果もPCが緩和。総じて、裸AuNPはヒドロキシル化を抑制しつつ脱アルキル化を増強する傾向を示し、PCがこれを減弱させました。

単一ドナーHLMにおける個体差

ドナー別CYP活性と代謝産物生成に強い相関：6β-OH-TSTはCYP2C19（r=0.99、p=0.01）とCYP3A4（r=0.99、p=0.03）と相関、ADはCYP4A11と負の相関（r=-0.98、p=0.04）。非阻害濃度でのAuNP効果はドナー間で異なり、CYP多型と表現型を反映（参考文献33）。サイズ、表面コーティング、PC形成がすべて代謝産物レベルに有意な影響（p<0.0001）。例えばPC-PEG-AuNPはサイズに関わらずドナーHDC3でAD生成を活性化。

結論

裸の40nmおよび80nm AuNPはpHLMでTSTヒドロキシル化を阻害し、脱アルキル化を刺激する可能性があります。生物学的に適切なPCの存在はこれらの効果を緩和し、特に陽イオン性BPEI-AuNPで顕著。単一ドナーHLMではAuNP効果は表面化学依存的で、個々のCYP活性に応じて変動し、AuNPが潜在的な内分泌かく乱物質であることを裏付けています。これらの結果は、他のナノマテリアルのステロイドホルモン代謝への影響評価と、感受性サブグループの特定のための枠組みを提供します。

データと材料の入手可能性

本研究で生成・解析されたすべてのデータは、本文および補足情報に含まれています。

略語

11β-OH TST

11β-ヒドロキシテストステロン

15β-OH TST

15β-ヒドロキシテストステロン

16α-OH TST

16α-ヒドロキシテストステロン

16β-OH TST

16β-ヒドロキシテストステロン

2α-OH TST

2α-ヒドロキシテストステロン

2β-OH TST

2β-ヒドロキシテストステロン

6α-OH TST

6α-ヒドロキシテストステロン

6β-OH TST

6β-ヒドロキシテストステロン

AD

アンドロステンジオン

AgNP

銀ナノ粒子

ANOVA

一元配置分散分析

AuNP

金ナノ粒子

BPEI

分岐ポリエチレンイミン

CFS

クロルピリホス

CYP

シトクロムP450

DEET

ジエチルトルアミド

D_H

動的直径

DI

脱イオン水

DLS

動的光散乱

EC₅₀

半極大活性化濃度

EDC/NHS

1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド/N-ヒドロキシサクシニミド

ESI⁺

正電荷電気噴霧

HLM

ヒト肝ミクロソーム

HSD

Tukeyの正直有意差

IC₅₀

半極大阻害濃度

ISTD

内部標準

LA

リポ酸

LC-MS/MS

液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析

LOD

検出限界

LOQ

定量下限

MRM

多重反応モニタリング

NADP

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸

NADPH

還元型NADP

naked

PCなし

NP

ナノ粒子

PBS

リン酸緩衝生理食塩水

PC

ヒト血漿プロテインコロナ

PDI

多分散性指数

PEG

ポリエチレングリコール

pHLM

プールヒト肝ミクロソーム

QC

品質管理

SWCNT

単層カーボンナノチューブ

TEM

透過型電子顕微鏡

TFF

タンジェンシャルフロー濾過

TiO₂

二酸化チタン

TST

テストステロン

UPLC TQD

三重四重極検出器付き超高速液体クロマトグラフィー